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水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定量法

1范圍

本文件描述了水中嗜肺軍團(tuán)菌酶底物定量檢驗(yàn)法。

本文件適用于冷卻水、冷凝水和沐浴用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)，其他水質(zhì)檢驗(yàn)可參考本文件進(jìn)行。

本方法定量限為1MPN/100mL。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T18204.5公共場所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)

GB/T18204.6公共場所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

嗜肺軍團(tuán)菌LegionellaPneumophila

軍團(tuán)菌目、軍團(tuán)菌科、軍團(tuán)菌屬中的一種桿菌。

注：菌體大小為（0.3～0.4）μm×（2～3）μm。無莢膜，無芽孢，有端生鞭毛，革蘭染色陰性，常呈梭形，需在

含L-半胱氨酸、鐵離子等營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中生長。

3.2

最可能數(shù)mostprobablenumber；MPN

稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)

一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)方法。

注：利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估計(jì)一定體積樣品中

目標(biāo)微生物存在的數(shù)量（單位體積存在目標(biāo)微生物的最可能數(shù)）。

4方法原理

該方法基于一種細(xì)菌酶檢驗(yàn)技術(shù)，嗜肺軍團(tuán)菌利用培養(yǎng)基中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)物質(zhì)

迅速地生長，經(jīng)分解代謝作用與培養(yǎng)基中的酶底物發(fā)生反應(yīng)使溶液渾濁或顯褐色。

5培養(yǎng)基與試劑

5.1酶底物法培養(yǎng)基

5.1.1成分

N-氨基甲酰甲基乙磺酸緩沖液（ACES）10.0g

酵母膏3.5g

硫酸鎂0.35g

α-酮戊二酸1.05g

丙酮酸鈉0.45g

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氨基酸4.7g

硫代硫酸鈉0.007g

二氯化錳0.03g

抗生素0.35g

5.1.2制法

將以上成分按比例溶解在1000mL無菌水中，121℃高壓滅菌15min。

5.2預(yù)處理液的配制

稱取2.04g雷伯環(huán)衍生物有機(jī)酸加入100mL無菌水中混勻。

5.3硫代硫酸鈉溶液的配制

稱取26g硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶液（或16g無水硫代硫酸鈉），溶于1L水中，并加熱煮沸

10min，冷卻，過濾后避光備用。

5.4BCYE培養(yǎng)基

5.4.1成分

N-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液10.0g

氫氧化鉀2.8g

活性炭2.0g

酵母提取物（細(xì)菌級）10.0g

α-酮戊二酸鉀鹽1.0g

瓊脂12.0g

L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物0.4g

焦磷酸鐵（III）0.25g

水1000mL

5.4.2制法

5.4.2.1將0.4gL-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物加到10mL水中。通過孔徑為0.22μm的膜過濾器過濾，

對溶液進(jìn)行過濾滅菌。

5.4.2.2將0.25g焦磷酸鐵（III）加到10mL水中。通過孔徑為0.22μm的膜過濾器過濾，對溶液進(jìn)

行過濾滅菌。

5.4.2.3將10gN-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液添加到含500mL水的容器中，于

45℃～50℃的水浴中溶解。用0.1mol/L氫氧化鉀溶液和0.1mol/L硫酸溶液，將ACES緩沖溶液的pH

調(diào)至6.8±0.1。

5.4.2.4將2.8g氫氧化鉀添加到480mL水中，并輕輕搖動(dòng)使其溶解。

5.4.2.5混合5.4.2.3、5.4.2.4中的兩種溶液，并依次添加2g活性炭、10g酵母提取物和1gα-酮戊二

酸鉀鹽，每次添加之間要充分混合。加入瓊脂，充分混合并在121℃高壓滅菌15min后，在水浴中冷

卻至（50±2）℃。

5.4.2.6無菌添加L-半胱氨酸（5.4.2.1）和焦磷酸鐵（III）溶液（5.4.2.2），每次添加之前應(yīng)充分混

合。在25℃下培養(yǎng)基的pH應(yīng)為6.8±0.2。

5.5BCYE-cys培養(yǎng)基

該培養(yǎng)基應(yīng)按照5.4進(jìn)行制備，但不添加L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物。

5.6無菌水

使用符合三級水要求的實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓滅菌15min備用。

5.7標(biāo)準(zhǔn)菌株

陽性對照標(biāo)準(zhǔn)菌株：嗜肺軍團(tuán)菌（CICC24883/ATCC33152或其它同類菌株）；

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陰性對照標(biāo)準(zhǔn)菌株：糞腸球菌（CICC10396/ATCC29212或其它同類菌株）。

6儀器設(shè)備

6.1高壓蒸汽滅菌器：121℃（0.10MPa～0.12MPa）。

6.2干熱滅菌器（烤箱）：60℃～80℃、160℃～180℃。

6.3生化培養(yǎng)箱或恒溫恒濕培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

6.4CO2培養(yǎng)箱：CO2濃度為2.5%、36℃±1℃。

6.5三角瓶：帶蓋的無菌玻璃瓶或者聚乙烯瓶。

6.6采樣瓶（含硫代硫酸鈉）：含0.1mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）的無菌廣口玻璃瓶或者聚乙烯瓶。

6.7程控定量封口機(jī)。

6.8定量盤：定量培養(yǎng)用無菌塑料盤，含96個(gè)孔穴，其中6個(gè)大孔（13.7mL/大孔），90個(gè)小孔（0.2

mL/小孔）。

6.9定量盤橡膠襯墊：與96孔定量盤配套使用。

6.10吸管：1mL、10mL無菌玻璃吸管或可調(diào)式移液管。

6.11試管：5mL或10mL無菌帶蓋玻璃試管或者離心管。

6.12量筒：100mL±1mL。

6.13生物安全柜。

7樣品的采集

7.1采樣瓶的準(zhǔn)備與滅菌

采樣瓶準(zhǔn)備時(shí)應(yīng)添加硫代硫酸鈉溶液（5.3）消除活性氯對嗜肺軍團(tuán)菌的干擾。

將濃度為0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液與擬采集水樣體積按照1∶1000的比例加入采樣廣口玻璃瓶中，

于160℃～180℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器，121℃高壓滅菌15min。干熱滅菌的采樣瓶應(yīng)在

兩周內(nèi)使用；濕熱滅菌的采樣瓶如不能立即使用，應(yīng)于60℃烤箱內(nèi)將瓶內(nèi)冷凝水烘干，兩周內(nèi)使用。

7.2樣品采集

按照GB/T18204.5的要求采集冷卻水和冷凝水，冷卻水樣品采集應(yīng)在距冷卻塔壁20cm、液面下10

cm處，冷凝水樣品采集應(yīng)在排水管或冷凝水盤處；按照GB/T18204.6的要求采集沐浴用水，沐浴用水樣

品采集應(yīng)隨機(jī)選擇5個(gè)沐浴噴頭；在沐浴池選擇3個(gè)采樣點(diǎn)，采集水面下30cm處水樣。每個(gè)采樣點(diǎn)依無

菌操作取樣500mL。

7.3樣品運(yùn)輸與保存

樣品應(yīng)在常溫條件下避光保存，并在48h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室開展檢驗(yàn)。

8檢驗(yàn)步驟

8.1稀釋

根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，將樣品稀釋至可計(jì)數(shù)濃度范圍。

稀釋方法：以無菌操作方法吸取10mL充分混勻的水樣，加入到含有90mL無菌水的三角瓶中，混

勻成1∶10的稀釋液，按照同法遞增稀釋，每稀釋一個(gè)濃度梯度，更換一支10mL吸管。

8.2接種

8.2.1取100mL配制好的酶底物法培養(yǎng)基到無菌三角瓶中備用。

8.2.2取2mL預(yù)處理液到無菌試管中。

8.2.3將2mL水樣原液和/或稀釋液分別加到含有2mL預(yù)處理液的試管中，混勻,于常溫下靜置（60±5）

s，靜置結(jié)束前再次混勻試管內(nèi)液體，并立即取2mL加到100mL酶底物法培養(yǎng)基（8.2.1）中混勻。

8.2.4將8.2.3三角瓶中的液體全部加到96孔定量盤中，以手撫平96孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡后

用程控定量封口機(jī)封口。觀察96孔定量盤顏色，若出現(xiàn)與陽性對照顏色相同，應(yīng)終止試驗(yàn)或重新操作。

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8.3培養(yǎng)

將96孔定量盤紙面向下放置于36℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，且培養(yǎng)箱中水盤避免干涸。

8.4對照試驗(yàn)

8.4.1空白對照

制備1個(gè)100mL無菌水樣品，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤應(yīng)無任何顏色或

濁度變化。

8.4.2陰性對照

制備1個(gè)（103～104）CFU/mL的100mL糞腸球菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后的

96孔定量盤應(yīng)無任何顏色或濁度變化。

8.4.3陽性對照

制備1個(gè)（102～103）CFU/mL的100mL嗜肺軍團(tuán)菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后

的96孔定量盤應(yīng)顯褐色或濁度大于空白對照。

9檢驗(yàn)結(jié)果

9.1未檢出

將培養(yǎng)7d后的定量盤取出觀察。如所有孔穴內(nèi)水樣的顏色與濁度和空白對照無差異，可直接報(bào)告

結(jié)果。結(jié)果報(bào)告為“未檢出/100mL”。

9.2檢出

如孔穴內(nèi)的水樣有顯褐色或者濁度大于空白對照的，則表示該孔穴中含有嗜肺軍團(tuán)菌。記錄所有顯

褐色或有濁度變化的孔穴數(shù)量，對照附錄A中表A.1，查出其代表的嗜肺軍團(tuán)菌最可能數(shù)（MPN）。并

按照公式（1）進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌濃度計(jì)算，結(jié)果采用兩位有效數(shù)字的科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，單位為MPN/100mL。

c=MPN值×100×b··················································(1)

式中：

c--嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為MPN/100mL；

MPN值--96孔定量盤陽性孔數(shù)查表所得結(jié)果；

b--接種樣品的稀釋倍數(shù)。

9.3菌型確定

如需對嗜肺軍團(tuán)菌陽性結(jié)果進(jìn)行菌型確定，可按照附錄B進(jìn)行操作。

10質(zhì)量控制

10.1每批樣品應(yīng)進(jìn)行空白對照試驗(yàn),并使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽性和陰性對照試驗(yàn)（8.4）。

10.2按照質(zhì)控要求，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株/質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

11生物安全

嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)應(yīng)按照三類病原微生物的生物安全要求進(jìn)行管理。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

96孔定量盤MPN表

96孔定量盤MPN表見表A.1。

表A.196孔定量盤MPN表

小孔陽性孔大孔陽性孔穴數(shù)

穴數(shù)0123456

0<11.12.33.95.88.412.6

11.02.23.55.27.410.415.5

22.03.24.76.69.012.418.7

33.04.35.97.910.614.622.3

44.05.47.29.412.316.926.4

55.06.58.410.814.119.431.0

66.07.79.712.315.921.936.1

77.08.810.913.817.824.641.6

88.19.912.215.319.827.547.4

99.111.013.516.821.730.553.4

1010.112.214.818.423.833.559.6

1111.113.316.120.025.936.765.9

1212.114.517.521.628.040.072.3

1313.215.618.823.330.243.378.8

1414.216.820.224.932.446.785.4

1515.218.021.526.634.750.192.1

1616.319.122.928.337.053.698.9

1717.320.324.330.139.357.1105.7

1818.321.525.731.841.660.6112.7

1919.422.727.133.644.064.2119.8

2020.423.928.535.346.467.8126.9

2121.425.130.037.148.871.5134.2

2222.526.331.438.951.275.1141.6

2323.527.532.940.753.778.8149.0

2424.628.734.342.656.182.5156.6

2525.629.935.844.458.686.3164.4

2626.731.137.246.261.190.1172.2

2727.732.438.748.163.693.9180.1

2828.833.640.249.966.197.7188.2

2929.934.841.751.868.6101.6196.4

3030.936.143.153.771.1105.5204.8

3132.037.344.655.673.7109.4213.3

3233.138.546.157.576.2113.3221.9

3334.139.847.659.478.8117.3230.7

3435.241.049.261.381.4121.3239.6

3536.342.350.763.284.0125.4248.7

3637.343.552.265.186.6129.5258.0

3738.444.853.767.189.3133.6267.4

3839.546.155.369.091.9137.7277.1

3940.647.356.871.094.6141.9286.9

4041.748.658.372.997.2146.1296.9

4142.849.959.974.999.9150.4307.1

4243.851.261.476.8102.6154.7317.5

4344.952.563.078.8105.4159.0328.1

4446.053.764.580.8108.1163.4339.0

4547.155.066.182.8110.8167.8350.1

4648.256.367.784.8113.6172.2361.4

4749.357.669.386.8116.4176.7373.0

4850.458.970.888.8119.2181.2384.9

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小孔陽性孔大孔陽性孔穴數(shù)

穴數(shù)0123456

4951.560.272.490.9122.0185.8397.1

5052.661.574.092.9124.8190.4409.6

5153.862.875.694.9127.6195.1422.3

5254.964.177.297.0130.5199.7435.5

5356.065.578.899.1133.4204.5448.9

5457.166.880.4101.1136.2209.3462.8

5558.268.182.1103.2139.2214.1477.0

5659.369.483.7105.3142.1218.9491.6

5760.570.885.3107.4145.0223.9506.7

5861.672.186.9109.5148.0228.8522.3

5962.773.488.6111.6150.9233.8538.3

6063.974.890.2113.7153.9238.9554.9

6165.076.191.9115.9156.9244.0572.0

6266.177.593.5118.0160.0249.2589.7

6367.378.895.2120.1163.0254.4608.1

6468.480.296.8122.3166.1259.7627.1

6569.681.598.5124.5169.2265.0646.9

6670.782.9100.2126.6172.3270.4667.6

6771.984.3101.9128.8175.4275.9689.0

6873.085.6103.6131.0178.5281.4711.5

6974.287.0105.3133.2181.7287.0735.0

7075.388.4107.0135.4184.9292.6759.6

7176.589.8108.7137.7188.1298.3785.5

7277.791.2110.4139.9191.3304.0812.8

7378.892.6112.1142.1194.5309.9841.7

7480.093.9113.8144.4197.8315.8872.3

7581.295.3115.5146.7201.1321.7904.9

7682.396.7117.3148.9204.4327.8939.8

7783.598.2119.0151.2207.7333.9977.2

7884.799.6120.8153.5211.0340.01017.6

7985.9101.0122.5155.8214.4346.31061.6

8087.1102.4124.3158.1217.8352.61109.7

8188.3103.8126.0160.5221.2359.11162.9

8289.5105.2127.8162.8224.6365.61222.4

8390.7106.7129.6165.2228.1372.11289.8

8491.9108.1131.4167.5231.6378.81367.7

8593.1109.5133.2169.9235.1385.61459.8

8694.3111.0135.0172.3238.6392.41572.5

8795.5112.4136.8174.7242.2399.41717.8

8896.7113.9138.6177.1245.8406.41922.6

8997.9115.3140.4179.5249.4413.62272.6

9099.1116.8142.2181.9253.0420.8>2272.6

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B

B

C

C

附錄B

（資料性）

菌型確定

菌型確定按如下步驟進(jìn)行：

a)用75%酒精擦拭定量盤背面顯褐色或者濁度大于空白對照的陽性孔穴處。

b)用移液管尖端直接穿刺并吸取10μL陽性菌液接種到BCYE平板上，在36℃±1℃的CO2培養(yǎng)箱中

培養(yǎng)2d～4d。

c)挑選白色、灰色、藍(lán)色、紫色、深褐色、灰綠色或深紅色，邊緣整齊、表面光滑，呈典型毛玻璃狀

的菌落，同時(shí)接種BCYE和BCYE-cys平板。在36℃±1℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。

d)用嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清對在BCYE瓊脂平板上生長而在BCYE-cys瓊脂平板上不生長的嗜肺軍團(tuán)菌

菌落進(jìn)行血清分型。

8

《水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定

量法》

（標(biāo)準(zhǔn)送審稿）編制說明

《水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定量法》

標(biāo)準(zhǔn)編制組

2021年8月

《水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定量法》

（標(biāo)準(zhǔn)送審稿）編制說明

1.項(xiàng)目背景

1.1任務(wù)來源

根據(jù)中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)公布的關(guān)于2019年度團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)征集工

作(預(yù)會(huì)發(fā)〔2019〕76號)的精神，北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生

所成立編制組，開展《水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定量法》標(biāo)

準(zhǔn)制定工作。

1.2工作過程

北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所在收到編制任務(wù)后，立即組

建標(biāo)準(zhǔn)起草編制小組，制定標(biāo)準(zhǔn)編制計(jì)劃，依據(jù)編制計(jì)劃合理分工，

深入開展論證工作。綜合查閱國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，制定技術(shù)路線

和實(shí)驗(yàn)方案，在此基礎(chǔ)上開展標(biāo)準(zhǔn)編制工作。本標(biāo)準(zhǔn)研究期間，選擇

了不同來源，不同類型的多種水樣進(jìn)行實(shí)際樣品的定性和定量研究，

完成了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證工作。在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合北京市內(nèi)外多家有資質(zhì)

的實(shí)驗(yàn)室完成方法的實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證工作。通過對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的合理

分析，最終完成本標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)送審稿）的編制。

1.3協(xié)作單位

序號單位名稱

1中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所

2北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心

3北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心

4北京市門頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心

5山東省泰安市疾病預(yù)防控制中心

6湖北省十堰市疾病預(yù)防控制中心

-1-

1.4標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其分工

張雅婕，北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，副主任技師。負(fù)

責(zé)本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的技術(shù)路線、技術(shù)指標(biāo)的提出及標(biāo)準(zhǔn)制訂各階段質(zhì)

控、內(nèi)容核定工作，負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)版本、征求意見稿、送審稿、報(bào)批

稿的制訂和標(biāo)準(zhǔn)解讀、編制說明等工作，為本項(xiàng)目負(fù)責(zé)人。

牛春燕：北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，主管技師。負(fù)責(zé)

本標(biāo)準(zhǔn)所有的數(shù)據(jù)錄入、核對和統(tǒng)計(jì)處理工作，負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)版本、

征求意見稿、送審稿、報(bào)批稿的制訂和標(biāo)準(zhǔn)解讀、編制說明等工作。

李霞：中國疾病預(yù)防控制中心，研究員。參加方法技術(shù)指標(biāo)的確

定及討論修改標(biāo)準(zhǔn)草案。

任淑敏：北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法

技術(shù)指標(biāo)的確定及方法驗(yàn)證。

張新峰：山東省泰安市疾病預(yù)防控制中心，副主任技師。參加方

法驗(yàn)證。

高艷：北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，主任技師。參加方法技

術(shù)指標(biāo)的確定及方法驗(yàn)證。

張永：北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，主任醫(yī)師。參加方

法技術(shù)指標(biāo)的確定及討論修改標(biāo)準(zhǔn)草案。

張銳：北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，高級工程師。參加

方法技術(shù)指標(biāo)的確定及討論修改標(biāo)準(zhǔn)草案。

劉海濤：北京市門頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心，副主任技師。參加

方法驗(yàn)證。

-2-

楊康：湖北省十堰市疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法驗(yàn)

證。

蘇?。罕本┦虚T頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法

驗(yàn)證。

張淑：北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

1.5參加起草人及其分工

劉艷妍：北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

趙璐：北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

王?。罕本┦醒討c區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

劉凡：北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

王長勇：山東省泰安市疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法

驗(yàn)證。

張洋洋：山東省泰安市疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)證。

張博文：北京市門頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心，技師。參加方法驗(yàn)

證。

呂秋艷：北京市門頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心，副主任技師。參加

方法驗(yàn)證。

李艷麗：湖北省十堰市疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法

驗(yàn)證。

劉蘭芳：湖北省十堰市疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法

驗(yàn)證。

楊艷：湖北省十堰市疾病預(yù)防控制中心，主管技師。參加方法驗(yàn)

-3-

證。

高斌：北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，主管技師，負(fù)責(zé)部

分采樣及檢驗(yàn)工作。

何立偉：北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，主管醫(yī)師，負(fù)責(zé)

部分采樣工作。

2與有關(guān)現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

本標(biāo)準(zhǔn)可作為國家標(biāo)準(zhǔn)《GB37488-2019公共場所衛(wèi)生指標(biāo)與限

值要求》的配套標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T18204.5-2013公共場所衛(wèi)生

檢驗(yàn)方法第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)》的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。

3確定各項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、試驗(yàn)方法、

檢驗(yàn)規(guī)則等）的依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)參照SN/T3266-2012、GB/T18204.5-2013和ISO

11731-2017進(jìn)行了適用性、干擾因素、標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度、特異性、

定量限、精密度和準(zhǔn)確度等技術(shù)指標(biāo)的確定。

4標(biāo)準(zhǔn)制訂的必要性

4.1軍團(tuán)菌的危害

軍團(tuán)菌病是一種細(xì)菌性疾病，主要表現(xiàn)為軍團(tuán)菌肺炎、肺外綜合

征和龐蒂亞克熱。其中軍團(tuán)菌引發(fā)的一種以肺炎為主的急性呼吸系統(tǒng)

傳染病，其特征是嚴(yán)重的呼吸道癥狀，具有高度致命性。軍團(tuán)菌肺炎

是非典型肺炎中病情最重的一種，其病死率高達(dá)15%~30%，免疫力

-4-

低下的患者可高達(dá)80%，未經(jīng)有效治療的病死率高達(dá)45%。該病已經(jīng)

被列為近幾十年新發(fā)傳染病之一，嚴(yán)重地威脅到人們的生命健康，已

成為現(xiàn)代城市面臨的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。

據(jù)相關(guān)研究顯示，約90%以上軍團(tuán)菌病是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的，

軍團(tuán)菌可在25℃~45℃的溫水中生長，廣泛存在于人工、自然水環(huán)境、

具有復(fù)雜水管系統(tǒng)的建筑物以及各種人工供水設(shè)施中，比如冷卻塔、

建筑用水、旋渦水療和裝飾性噴泉等[1]，因此環(huán)境衛(wèi)生將軍團(tuán)菌病的

主要致病菌——嗜肺軍團(tuán)菌列為集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)的常規(guī)監(jiān)測項(xiàng)目

之一。

4.2國內(nèi)外環(huán)境水體中嗜肺軍團(tuán)菌的污染現(xiàn)狀

相關(guān)文獻(xiàn)顯示，空調(diào)系統(tǒng)、噴泉水、旋流池水和冷熱水管道等人

工水環(huán)境中的水溫高、管道阻塞、水流停滯、鐵銹、生物膜等因素為

軍團(tuán)菌提供了良好的棲息和繁殖環(huán)境，導(dǎo)致這些水體中軍團(tuán)菌檢出率

較高。尤其是空調(diào)冷卻水是引發(fā)軍團(tuán)菌病的最主要污染源。人們可通

過吸入軍團(tuán)菌氣溶膠而感染[2]。

早在20世紀(jì)80年代英國和日本就報(bào)道了集中空調(diào)系統(tǒng)軍團(tuán)菌陽

性率分別為52.0%和44.1%。在澳大利亞南部的阿德萊德，Deanna

Hayes-Phillips等人[3]對家用熱水淋浴系統(tǒng)進(jìn)行了調(diào)查，研究結(jié)果顯示

軍團(tuán)菌和嗜肺軍團(tuán)菌的檢出率分別為74.6%（50/68）和64.2%（43/68）。

LEGNANI等人[4]檢驗(yàn)了意大利某地11家私人保健院的供水系統(tǒng)，發(fā)

現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌檢出率高達(dá)86.8%。RamaChaudhry等人[5]從印度一所

醫(yī)院和醫(yī)療中心的一般區(qū)域收集了79份水樣（41份飲用水，38份非

-5-

飲用水），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其中28份水樣檢出嗜肺軍團(tuán)菌。

國內(nèi)針對水體中嗜肺軍團(tuán)菌的污染現(xiàn)狀研究也有很多。郭寶羨等

人[6]在2016~2017年隨機(jī)抽取漳州市公共場所沐浴用水160件，檢出

嗜肺軍團(tuán)菌陽性72件，檢出率為45.00%（72/160）。徐俊等人[7]在

2017年對北京市西城區(qū)公共淋浴場所130份樣本進(jìn)行分析，檢出嗜

肺軍團(tuán)菌陽性28件，總體陽性率為21.5%。牟敬鋒等人[8]于2015~2016

年共采集深圳市公共場所噴泉水100份，其中有42份水樣檢出嗜肺

軍團(tuán)菌，檢出率為42.00%。肖光文等人[9]于2019年6~8月期間隨機(jī)

選取了梅州城區(qū)部分醫(yī)院、商場、酒店和學(xué)校作為研究對象，對其空

調(diào)冷卻水、沐浴用水、自來水和內(nèi)外部景觀水嗜肺軍團(tuán)菌污染狀態(tài)進(jìn)

行了分析。結(jié)果顯示200份空調(diào)冷卻水中，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌76株

（38.00%）；200份自來水中，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌35株（17.50%）；

200份景觀水中，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌24株（12.00%）；150份沐浴用

水中，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌31株（20.67%）。

綜上所述，世界各地公共場所的人工水體中嗜肺軍團(tuán)菌的污染具

有普遍性且狀況嚴(yán)重，直接導(dǎo)致了許多國家和地區(qū)軍團(tuán)菌病的散發(fā)或

暴發(fā)。因此不僅需要從業(yè)人員在開展相關(guān)工作時(shí)定期做好消毒工作和

個(gè)人防護(hù)，同時(shí)應(yīng)提高相關(guān)衛(wèi)生部門的認(rèn)識，并制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及有效

措施以降低嗜肺軍團(tuán)菌的污染水平。

4.3監(jiān)督檢驗(yàn)及污染事故處理工作的需要

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國承擔(dān)的國際賽事、會(huì)議和演出等活動(dòng)

也越來越多。這給我國的重大活動(dòng)衛(wèi)生保障工作、日常衛(wèi)生監(jiān)督與檢

-6-

驗(yàn)工作都提出了更高的要求，我們不僅要確保這些體育場館、賓館飯

店和娛樂場所等公共場所的衛(wèi)生狀況符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)

的要求；還要在發(fā)生污染事故時(shí)，能夠在最短的時(shí)間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地

完成大樣本量的檢驗(yàn)，并對污染菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究，完成污

染溯源工作。目前我國《GB37488-2019公共場所衛(wèi)生指標(biāo)與限值要

求》對集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)的冷卻水和冷凝水以及沐浴用水規(guī)定不得檢

出嗜肺軍團(tuán)菌。然而與之相配套的GB/T18204.5-2013檢驗(yàn)方法步驟

復(fù)雜、檢驗(yàn)時(shí)間長，需要較多的試驗(yàn)耗材，質(zhì)量控制的環(huán)節(jié)眾多，最

重要的是結(jié)果判斷難度高，需要檢驗(yàn)者具備豐富的經(jīng)驗(yàn)。因此該方法

不能滿足快速、大規(guī)模的檢驗(yàn)需求。所以，開發(fā)并引進(jìn)快速、簡單、

準(zhǔn)確的嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法勢在必行。本研究介紹的酶底物法檢驗(yàn)水

中嗜肺軍團(tuán)菌的方法就是一種性能優(yōu)越且操作簡便的檢驗(yàn)新方法，可

很好地解決上述問題。該方法能將檢驗(yàn)時(shí)間縮短到7天內(nèi)完成，且不

需要確認(rèn)試驗(yàn)，對人員及環(huán)境污染較小，結(jié)果觀察方便易行，檢驗(yàn)準(zhǔn)

確度高，質(zhì)控環(huán)節(jié)少，與國標(biāo)方法相比能夠更精確的指導(dǎo)對嗜肺軍團(tuán)

菌的防控工作，符合環(huán)境工作發(fā)展的需要。

因此，為切實(shí)貫徹《中華人民共和國水污染防治法》，保護(hù)環(huán)境，

保障人體健康，擬制定本標(biāo)準(zhǔn)。

5國內(nèi)外水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法的相關(guān)研究

5.1國內(nèi)外嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)及評價(jià)方法現(xiàn)況

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作為防止軍團(tuán)菌病暴發(fā)流行的重要控制環(huán)節(jié)，許多國家和地區(qū)相

繼出臺了水環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌的監(jiān)測方案[10-14]。

國外現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有：瑞士制定了公共浴室和沐浴

用水中軍團(tuán)菌評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)FSVO2017；美國國家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)發(fā)布了

ASHRAE188-2018，用來評估管理建筑水系統(tǒng)的軍團(tuán)菌病風(fēng)險(xiǎn)。國外

現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)有：ISO11731-2017采用培養(yǎng)法來檢驗(yàn)水

樣；英國標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)頒布的BS6068-4.12-1998參考了ISO11731-2017

的方法測定水中的軍團(tuán)菌；法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)頒布的NFT90-471-2010

中采用即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT.PCR)測定水中的軍團(tuán)菌和/或嗜肺軍團(tuán)

菌；酶底物法定量檢驗(yàn)嗜肺軍團(tuán)菌獲得了法國標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（AFNOR）

的NF驗(yàn)證認(rèn)證，也獲得了英國分析常務(wù)委員會(huì)（standingcommitteeof

analysis，SCA）的認(rèn)可，并推薦該方法用于測定飲用水及其他檢水類

型中的嗜肺軍團(tuán)菌。

國內(nèi)現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有《GB37488-2019公共場所衛(wèi)

生指標(biāo)與限值要求》，此標(biāo)準(zhǔn)要求冷卻水、冷凝水、沐浴用水中不得

檢出嗜肺軍團(tuán)菌，《T/ASC02-2016健康建筑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定集中

生活熱水系統(tǒng)不得檢出嗜肺軍團(tuán)菌[15]。國內(nèi)現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)標(biāo)

準(zhǔn)有：《GB/T18204.5-2013公共場所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》、《DB11/T

485-2020集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生管理規(guī)范》附錄F、《SN/T2528-2010

飲用水中軍團(tuán)菌檢測》和《HG/T4323-2012循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的

檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)》均使用膜過濾法采集培養(yǎng)測定飲用水或者其他檢水類型

中的軍團(tuán)菌；《DB11/T485-2020集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生管理規(guī)范》

-8-

附錄G采用膠體金免疫層析法測定冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌血清1型

（LP1）；《SN/T2770-2011國境口岸軍團(tuán)菌熒光PCR檢驗(yàn)方法》

中規(guī)定，使用熒光PCR技術(shù)測定臨床標(biāo)本或者環(huán)境樣本如集中空調(diào)

通風(fēng)系統(tǒng)冷卻水、冷凝水和管道飲用水中的軍團(tuán)菌。

5.2水中嗜肺軍團(tuán)菌酶底物檢驗(yàn)法的性能研究及應(yīng)用

總的來說，國內(nèi)外現(xiàn)行國家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中使用的嗜肺軍團(tuán)菌檢

驗(yàn)方法基本相同，大多數(shù)檢驗(yàn)方法是通過對集中空調(diào)冷凝水、冷卻水

等水環(huán)境樣品進(jìn)行過濾、洗脫、酸處理、熱處理后再進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)

[16-17]。該方法需要的儀器和耗材種類繁多，流程復(fù)雜，檢驗(yàn)時(shí)間長，

靈敏度低，影響到軍團(tuán)菌的風(fēng)險(xiǎn)評估工作。近年來出現(xiàn)了一些新的嗜

肺軍團(tuán)菌定量檢驗(yàn)方法，包括PCR定量方法和酶底物法。其中，酶

底物法是嗜肺軍團(tuán)菌利用培養(yǎng)基中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)

素，迅速生長，經(jīng)分解代謝作用，與培養(yǎng)基中的酶底物發(fā)生反應(yīng)，使

溶液渾濁或顯褐色，以此指示樣品是否存在嗜肺軍團(tuán)菌污染及其污染

程度。近年來，有多個(gè)國家的研究人員通過對比酶底物法和傳統(tǒng)過濾

培養(yǎng)法對水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)結(jié)果，來確定酶底物定量法的方法性

能及適用性。如D.P.Sartory等人[18]應(yīng)用酶底物法檢驗(yàn)飲用水和相關(guān)

水樣中的嗜肺軍團(tuán)菌發(fā)現(xiàn)：與ISO11731-2017相比較，酶底物法顯示

出對嗜肺軍團(tuán)菌的高敏感性和高特異性，并且該方法顯著改善和簡化

了飲用水相關(guān)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)。在最近的另一項(xiàng)研究中，

PETRISEKR等人[19]將酶底物法和美國公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)發(fā)表的水和廢

水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法9260J進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)酶底物法對飲用水中嗜肺軍

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團(tuán)菌的敏感性增加，對非飲用水的檢驗(yàn)靈敏度和9260J方法相同。

MelaineM.Rech等人[20]用酶底物法和美國CDC提供的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法

檢驗(yàn)非飲用水中的嗜肺軍團(tuán)菌，研究結(jié)果顯示酶底物法具有更高的靈

敏度和特異性。JavierCheca等人[21]應(yīng)用酶底物法與ISO11731-1998

法檢驗(yàn)飲用水和非飲用水樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶底物

法具有很高的特異性，對嗜肺軍團(tuán)菌有更高的靈敏度和選擇性，與此

同時(shí)，鑒于酶底物法在檢驗(yàn)程序上的優(yōu)勢，它還可以使得實(shí)驗(yàn)室更好

的節(jié)省資源、成本和時(shí)間。總之，作者認(rèn)為酶底物法可替代ISO11731：

1998。SilviaN.Monteiro等人[22]用酶底物法、傳統(tǒng)過濾培養(yǎng)法（ISO

11731）和qPCR法對飲用水和非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)進(jìn)行了

比較，同樣證明酶底物法具有更高的特異性和便捷性，這代表了飲用

水和非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢驗(yàn)法的一個(gè)重大進(jìn)展。另外，

KirstenSpies等人[23]對酶底物法和ISO11731測定飲用水中嗜肺軍團(tuán)

菌的研究也得到了相似的結(jié)論：酶底物法的特異性可達(dá)97.9%，高于

ISO11731方法的特異性（95.3%）。同時(shí)，酶底物法在飲用水樣品中

測定的嗜肺軍團(tuán)菌濃度普遍高于ISO11731方法的測定值，這也說明

酶底物法有更好的靈敏度。在國內(nèi)的相關(guān)研究中，付喜梅[24]和陳智[25]

等人分別以四川省和武漢市部分集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)冷卻塔水中的嗜

肺軍團(tuán)菌為研究對象，進(jìn)行了酶底物法和分離培養(yǎng)法的比較，兩者的

研究結(jié)果均表明：酶底物法的檢驗(yàn)時(shí)間短、操作簡便，且該方法的檢

出率高于分離培養(yǎng)法。表1對近些年世界各地區(qū)的水環(huán)境樣品中嗜肺

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軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法的原理進(jìn)行了總結(jié)[18-28]。表2對水中嗜肺軍團(tuán)菌的酶

底物檢驗(yàn)法和傳統(tǒng)過濾培養(yǎng)法的性能研究及比對結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)。

表1世界各地區(qū)水環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法原理一覽表

地區(qū)或組織樣品種類檢驗(yàn)原理

中國上海醫(yī)院建筑內(nèi)水樣培養(yǎng)法

中國廣州賓館沐浴用水培養(yǎng)法

中國上海公共建筑住宅分子生物學(xué)技術(shù)（qPCR）

美國建筑水箱分子生物學(xué)技術(shù)（qPCR）

意大利住宅培養(yǎng)法

德國小型住宅熱水培養(yǎng)法

國際標(biāo)準(zhǔn)化組織水樣培養(yǎng)法

美國CDC飲用水和非飲用水培養(yǎng)法

中國湖南公共場所水環(huán)境分子生物學(xué)技術(shù)（RT-qPCR）

中國公共場所非飲用水培養(yǎng)法

中國冷卻水膠體金免疫層析法

德國飲用水酶底物法

美國飲用水和非飲用水酶底物法

美國非飲用水酶底物法

加拿大魁北克非飲用水酶底物法

SCA飲用水和非飲用水酶底物法

西班牙飲用水和非飲用水酶底物法

葡萄牙飲用水和非飲用水酶底物法

德國飲用水和非飲用水酶底物法

中國四川冷卻水酶底物法

中國武漢冷卻水酶底物法

表2水中嗜肺軍團(tuán)菌的酶底物檢驗(yàn)法和傳統(tǒng)過濾培養(yǎng)法的性能研究及比對結(jié)果

地區(qū)或組織發(fā)表雜志及時(shí)間結(jié)果

德國LettersinApplied酶底物法檢驗(yàn)飲用水中的嗜肺軍團(tuán)菌的特

Microbiology；2017異性為96.4%。

美國JournalofWater&酶底物法檢驗(yàn)飲用水和非飲用水中的嗜肺

Health；2017軍團(tuán)菌的特異性均為100%。

美國CurrentMicrobiology；酶底物法的靈敏度為0.84±0.08,特異性為

20180.97±0.02，證明酶底物法具有較高的靈敏