《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測-液相色譜法》

編制說明

一、工作簡況，包括任務(wù)來源、協(xié)作單位、主要工作過程、標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其

所作的工作等；

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要

求、試驗方法、檢驗規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù)），修訂標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)增列

新舊標(biāo)準(zhǔn)水平的對比；

三、主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果；

四、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度及水平的對比情況；

五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系；

六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)；

七、作為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的建議；

八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過渡辦法等內(nèi)容）；

九、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議；

十、其他應(yīng)予說明的事項。

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一、標(biāo)準(zhǔn)工作簡況

1、任務(wù)來源

維蘭特羅是葛蘭素史克公司研發(fā)的新型β2-受體激動劑，具有起效快、作用時間持

久等優(yōu)點，對β2-受體的親合力較對β1-受體和β3-受體高1000倍，具有高度選擇性，可

作為多款上市藥品如蕪地溴銨的原料藥或有效成分進(jìn)行使用，具有廣闊的需求市場。

原料藥需要確定合適的手性異構(gòu)體檢測技術(shù)方法與檢測條件來落實和確認(rèn)質(zhì)量的合格

和數(shù)據(jù)的有效性，但目前維蘭特羅沒有公開的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1維蘭特羅的來源

廣東萊佛士制藥公司通過創(chuàng)新的合成工藝實現(xiàn)了維蘭特羅的高效綠色制造，并提

供給藥品生產(chǎn)企業(yè)用于藥品生產(chǎn)。萊佛士公司根據(jù)原料藥質(zhì)量和中國藥典的指導(dǎo)原則

建立了維蘭特羅質(zhì)量和檢測方法的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。由于目前國內(nèi)圍繞維蘭特羅藥物已經(jīng)構(gòu)

成了原料藥生產(chǎn)、原料藥市場交易和藥品生產(chǎn)的團(tuán)體，急需對維蘭特羅手性異構(gòu)體檢

測方法進(jìn)行深入研究，并將維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測方法企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)上升為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，

使之成為團(tuán)體共同使用可以互相驗證互相承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，這對于藥物綠色制造和藥品市

場監(jiān)管、制藥行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化具有重要價值。

1.2維蘭特羅手性異構(gòu)體

維蘭特羅有一個手性中心，存在兩種手性異構(gòu)體，分別是R型維蘭特羅和S型維

蘭特羅。R型維蘭特羅作為藥劑原材料，發(fā)揮出治療的效果。S型維蘭特羅為合成路線

中得到的副產(chǎn)物。

圖1維蘭特羅手性異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)示意圖：（左）(R)-VL、（右）(S)-VL

2

1.3結(jié)構(gòu)及手性拆分情況

關(guān)于維蘭特羅的檢測方法國內(nèi)外僅有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)有研究報道，均采用高效液相

色譜法進(jìn)行樣品分離，檢測手段有紫外、熒光和質(zhì)譜[1-5]。Yajun等[6]采用高效液相色譜

分離維蘭特羅對映體，在ChiralpakID柱上使用正己烷-乙醇-乙醇胺(75:25:0.1,v/v/v)作

為流動相，紫外檢測波長為220nm，對映體分離度達(dá)到3.3，(R)‐維蘭特羅檢出限為

0.30μg/mL，線性范圍為3-30μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9998，方法回收率在98.5-101.7%

之間，方法精密度較高。Chundela等[7]采用高效液相色譜-質(zhì)譜分離檢測維蘭特羅，在

ZorbaxEclipseXDB-C8色譜柱和ZorbaxEclipseXDB-C8柱上進(jìn)行分離。流動相為乙

腈-0.1%乙酸(95:5,v/v)，方法檢出限(LOD)為2pg/mL。對于維蘭特羅原料藥質(zhì)量檢測

方法而言，由于其純度高，相對于檢測方法靈敏度而言，更重要的是方法的準(zhǔn)確性、

穩(wěn)定性及設(shè)備的通用性、普及性，因此采用高效液相色譜加紫外檢測作為維蘭特羅的

檢測方法對于其團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)而言適用性較好。

1.4維蘭特羅研究目的及意義

由于目前國內(nèi)圍繞維蘭特羅藥物已經(jīng)構(gòu)成了原料藥生產(chǎn)、原料藥市場交易和藥品

生產(chǎn)的團(tuán)體，急需對維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測方法進(jìn)行深入研究，并將維蘭特羅檢測

方法企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)上升為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，使之成為團(tuán)體共同使用可以互相驗證互相承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，

這對于藥物綠色制造和藥品市場監(jiān)管、制藥行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化具有重要價值。

2、協(xié)作單位

本標(biāo)準(zhǔn)于2022年由廣東省藥學(xué)會藥物手性專業(yè)委員會提出，廣東省藥學(xué)會團(tuán)體標(biāo)

準(zhǔn)委員會歸口，在廣東省藥學(xué)會藥物手性專業(yè)委員會組織下，由廣東萊佛士制藥技術(shù)

有限公司進(jìn)行起草、修訂，華南師范大學(xué)、廣東朗斯姆生化技術(shù)有限公司協(xié)助修訂。

4、主要工作過程

2022年*月*日，廣東省藥學(xué)會藥物手性專委會提出了手性色譜檢測的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)計

劃項目。

2022年5月1日，由廣東萊佛士制藥技術(shù)有限公司、華南師范大學(xué)、廣東朗斯姆

生化技術(shù)有限公司三家單位發(fā)起《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測-液相色譜法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

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的立項申請，并由廣東萊佛士制藥技術(shù)有限公司作為主要起草單位，開始標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備工

作。

2022年5月11日，廣東省藥學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)委員會專家進(jìn)行了該團(tuán)標(biāo)的立項評審，

并批準(zhǔn)立項。標(biāo)委會提出該團(tuán)標(biāo)補(bǔ)充了現(xiàn)行技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的不足，對學(xué)科發(fā)展起到積極的

推動作用，檢測方法具有一定的應(yīng)用價值，對相關(guān)產(chǎn)品的安全性有指導(dǎo)意義，并要求

起草單位按照《廣東省藥學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法(試行)》有關(guān)要求，嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量

關(guān),切實提高標(biāo)準(zhǔn)制定的質(zhì)量和水平，增加標(biāo)準(zhǔn)的適用性和實效性，按期完成標(biāo)準(zhǔn)編制

的相關(guān)工作。

2023年6月25日，項目主持單位組織專家成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，并負(fù)責(zé)編制

起草工作，確定標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容，制定了工作計劃，安排相應(yīng)的實驗內(nèi)容，并組

織標(biāo)準(zhǔn)起草工作。

2024年*月*日，起草小組擬定了《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測-液相色譜法》（工

作組討論初稿）和編制說明。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)工作組召開會議，針對該討論稿進(jìn)行討論，提

出修改意見。

2024年*月*日，按照團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)起草工作會討論意見，整理并確定了相關(guān)特征性理

化指標(biāo)值，并達(dá)成一致意見，最終形成標(biāo)準(zhǔn)的（工作組討論初稿）。

2024年*月*日，工作組向廣東省藥學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)委員會提出申請。

在廣泛的調(diào)查研究和必要的試驗驗證的工作基礎(chǔ)上，根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化

工作導(dǎo)則第一部份：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》及GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫第四部

份：化學(xué)分析方法》所規(guī)定的內(nèi)容和格式編寫完成標(biāo)準(zhǔn)草案，現(xiàn)已形成征求意見稿。

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二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

1、編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜法測定維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測的術(shù)語和定義、試劑

和材料、儀器與設(shè)備、測定步驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)采用手性固定相-高效液相色譜（CPS-HPLC）方法對較高純度的維蘭特羅

標(biāo)準(zhǔn)品或原料分析。適用于合成的維蘭特羅原料或?qū)φ掌返鹊氖中援悩?gòu)體的種類判定

和含量的測定。本標(biāo)準(zhǔn)的編寫制定過程以提高測試方法選擇性、精密度、靈敏度、準(zhǔn)

確度和分析效率，降低分析成本為總原則，力求反映科學(xué)技術(shù)的先進(jìn)成果和先進(jìn)經(jīng)驗。

遵循了標(biāo)準(zhǔn)制定過程中的先進(jìn)性、經(jīng)濟(jì)性和適用性原則。

2、標(biāo)準(zhǔn)研制目的

目前，市場上的維蘭特羅(Velanterol,VL)原料主要來源于工業(yè)合成，通常是(S)-VL

和(R)-VL的混合物，其中主要成分和具有β2-受體激動劑藥理效果的為(R)構(gòu)型?；谇?/p>

期研究、廣泛調(diào)研和驗證基礎(chǔ)上的考慮，結(jié)合實際，建立合理的維蘭特羅手性異構(gòu)體

的檢測和含量測定方法，以規(guī)范維蘭特羅藥品的生產(chǎn)秩序。

本標(biāo)準(zhǔn)針對純度較高（純度≥98%）的維蘭特羅標(biāo)準(zhǔn)品或原料產(chǎn)品制定，采用高

效液相方法，檢測識別這類高純度產(chǎn)品的異構(gòu)體判定和對映體過量或分配，標(biāo)準(zhǔn)名稱

定為《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測-液相色譜法》。

3、技術(shù)要求

采用高效液相色譜法，在選定的工作條件下，通過手性色譜柱對樣品中(R)-VL和

(S)-VL分離，用紫外吸收檢測器檢測，用外標(biāo)法定量，計算試樣中(R)-VL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

在現(xiàn)有文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，對維蘭特羅的液相分析方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，該方法

可有效測定(R)-VL含量。

3.1定性確認(rèn)

液相色譜儀進(jìn)行定性測定，在試驗條件下注入適量(S)-VL和(R)-VL參比物質(zhì)來測

5

定分離度，分離度不小于1.5。

在試驗條件下對樣品進(jìn)行定性測定，如果檢出樣品中(S)-VL或(R)-VL色譜峰的保

留時間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，且該物質(zhì)的紫外吸收譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收譜圖一致，則可

初步確認(rèn)樣品中存在。

3.2質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

試樣中(R)-VL的含量按式（1）計算：

··································（1）

??×?×1000

式中：??=?×1000

Xi-------試樣中被測組分的含量，單位為g/g；

Ci-------從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的待測溶液中(R)-VL的濃度，單位為毫克每毫升

（mg/mL）；

V--------樣品溶解總體積，單位為毫升（mL）；

m-------試樣的質(zhì)量，單位為克（mg）。

3.3重復(fù)性

在重復(fù)條件下，取兩次獨立測定的算術(shù)平均值作為結(jié)果，其絕對差值不得超過算

術(shù)平均值的10%。

4、試驗方法

4.1樣品溶液的配制

4.1.1(S)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

取(S)-VL對照品20mg、(R)-VL對照品20mg，精密稱定，分別置于20mL量瓶

中，乙醇稀釋至刻度，分別配成約1mg/mL的(S)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和約1mg/mL的

(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲備液于0~8℃保存。

4.1.2混合對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

取(S)-VL對照品20mg、(R)-VL對照品20mg，精密稱定，置于同一20mL量瓶

中，加乙醇至刻度，配成約每1mL約含1mg(S)-VL和1mg的(R)-VL混合對照品標(biāo)準(zhǔn)

6

儲備溶液，儲備液于0~8℃保存。

4.1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制

精密量取(R)-VL對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（見4.1.1）一定體積，置于10mL量瓶中，

加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液：0.005、0.01、0.02、0.04、

0.05、0.06、0.08、0.10mg/mL，分別編號1、2、3、4、5、6、7、8。

4.1.4系統(tǒng)適用性溶液配制

精密量取(R)-VL對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（見4.1.1）200μL，置于10mL量瓶中，加

入乙醇稀釋至刻度，配成每1mL約含0.02mg(R)-VL的溶液；精密量取(S)-VL對照品

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（見4.1.1）200μL，置于10mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，配成每

1mL約含0.02mg(S)-VL的溶液，將兩份溶液各取500μL混合，作為系統(tǒng)適用性溶液。

4.1.5定量限溶液的配制

精密量取(R)-VL對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（見4.1.1）200μL，置于20mL量瓶中，加

入乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取(R)-VL稀釋液4.0mL置于10mL量瓶中，加入

乙醇稀釋至刻度，作為定量限溶液。

4.1.6精密度溶液的配制

精密量取(R)-VL對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（見4.1.1）0.2mL、0.5mL、0.6mL，分別

置于10mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，配制成0.02mg/mL（40%濃度）、0.05

mg/mL（100%濃度）、0.06mg/mL（120%濃度）三個濃度的維蘭特羅溶液，按照色譜

條件進(jìn)行測定。

4.1.7方法準(zhǔn)確度溶液的配制

取(R)-VL對照品10mg、(S)-VL對照品10mg，精密稱定，分別置于10mL量瓶

中，乙醇稀釋至刻度，分別配成約1mg/mL的(R)-VL溶液和約1mg/mL的(S)-VL溶液。

5%(R)-VL和95%(S)-VL的準(zhǔn)確度溶液的配制：取上述(R)-VL溶液1μL，(S)-VL

溶液19μL，置于同一5mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，同法制備三份。

50%(R)-VL和50%(S)-VL的準(zhǔn)確度溶液的配制：取上述(R)-VL溶液10μL，(S)-

VL溶液10μL，置于同一5mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，同法制備三份。

7

95%(R)-VL和5%(S)-VL的準(zhǔn)確度溶液的配制：取上述(R)-VL溶液19μL，(S)-VL

溶液1μL，置于同一5mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，同法制備三份。

4.1.8穩(wěn)定性溶液的配制

精密量取(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液100μL，分別置于10mL量瓶中，加入乙醇稀釋至

刻度，制備兩份，分別置于常溫和4℃冰箱保存，作為(R)-VL穩(wěn)定性溶液。

4.1.9供試品溶液的配制

取供試品約20mg，精密稱定，置于20mL量瓶，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，

作為供試品儲備溶液。精密量取供試品儲備溶液100μL，置于10mL量瓶中，加入乙

醇稀釋至刻度，作為供試品待測液。

4.2高效液相色譜測定

4.2.1液相色譜分析條件

按高效液相色譜操作規(guī)程開機(jī)預(yù)熱，調(diào)節(jié)溫度及流量，達(dá)到分析條件并基線平穩(wěn)

后進(jìn)樣分析。推薦的色譜柱及典型色譜操作條件見表1，其他能達(dá)到等同分離程度的色

譜柱和色譜操作條件均可使用。

測定：精密量取上述各濃度溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

表1色譜柱和典型色譜操作條件

纖維素三-（4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠為填充劑

色譜柱（Phenomenex，LuxCellulose-44.6mm×250mm，5μm或效能相

當(dāng)?shù)纳V柱）

流動相正己烷:乙醇:二乙胺:三氟乙酸=800:200:0.5:1(v/v)，等度洗脫

柱溫30℃

流速1mL/min

檢測波長230nm

進(jìn)樣量25μL

運行時間20min

4.2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測定

將上述系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液按色譜條件（見4.1.3）進(jìn)行測定，以樣品峰面積為y

軸，對應(yīng)的樣品濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

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4.2.3試樣測定

將樣品溶液按色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，由色譜峰面積

從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)的(R)-VL的濃度。樣品溶液中被測物質(zhì)的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測定

的線性范圍內(nèi)，超出線性范圍的應(yīng)稀釋或濃縮后再進(jìn)樣分析。

4.2.4平行試驗

按以上步驟，對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定，以算術(shù)平均值作為結(jié)果，其絕對差

值不得超過算術(shù)平均值的10%。

5、試劑與設(shè)備

5.1試劑

（1）正己烷：色譜純。

（2）無水乙醇：色譜純。

（3）二乙胺：色譜純

（4）三氟乙酸（TFA）。

（5）參比物質(zhì)1（對照品）：(S)-維蘭特羅，化學(xué)純度：96.3%（HPLC），由深圳市恒豐

萬達(dá)醫(yī)藥科技有限公司提供。

（6）參比物質(zhì)2（對照品）：(R)-維蘭特羅，化學(xué)純度：99.6%（HPLC），由廣東萊福士

制藥技術(shù)有限公司提供。

5.2儀器和設(shè)備

（1）高效液相色譜儀：配二級管陣列檢測器（DAD）或紫外檢測器（UV），其靈敏度

及穩(wěn)定性應(yīng)符合GB/T16631。

（2）色譜柱：纖維素三-（4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠填充劑色譜柱（Phenom-

enex，LuxCellulose-44.6mm×250mm，5μm）。

（3）分析天平：感量0.1mg。

（4）量瓶：100mL、20mL、10mL。

（5）微量移液器：100-1000μL量程、20-200μL量程。

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三、主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)

期的經(jīng)濟(jì)效果；

1.方法的確定

高效液相色譜分析方法學(xué)驗證項目匯總?cè)绫?下：

表2《維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測液相色譜法》驗證結(jié)果概要

項目預(yù)期目標(biāo)驗證結(jié)果

空白溶液應(yīng)不干擾和的空白溶劑對和不產(chǎn)生

專屬性(S)-VL(R)-VL(S)-VL(R)-VL

檢查；干擾。

在此系統(tǒng)條件下(R)-VL和(S)-VL的

和的分離度應(yīng)符合要分離度為，表明在該液相色譜

系統(tǒng)適用性(S)-VL(R)-VL2.69

求，Rs≥1.5；條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)符合含量

測定要求，且方法精密度良好。

要求信噪比S/N≈10時的檢測濃度，

證明方法具有足夠低的定量檢測能在本色譜條件下，信噪比約為

定量限10

力；所測三份溶液的主成分保留時間時，(R)-VL進(jìn)樣濃度為0.5g/mL。

RSD≤2.0%，峰面積≤5.0%。

(R)-VL、(S)-VL峰面積與濃度線性

關(guān)系良好。在0.005-0.100mg/mL范

在0.005~1.000mg/mL范圍內(nèi)，線性圍內(nèi)，(R)-VL含量線性關(guān)系良好，

方程的相關(guān)系數(shù)≥，軸截距應(yīng)回歸方程，2

線性和范圍0.990Yy=0.92x–0.014R

在100％響應(yīng)值的25％以內(nèi)，響應(yīng)因=0.9998，響應(yīng)因子RSD為0.93%；

子的RSD應(yīng)不大于10%。(S)-VL含量線性關(guān)系良好，回歸方

程y=0.78x–0.53,R2=0.9995，響應(yīng)因

子RSD為2.27%。

由實驗結(jié)果可知，(R)-VL、(S)-VL

的方法準(zhǔn)確度良好。(R)-VL的回收

率為95.39%-107.40%，平均回收率

為100.9%，RSD為4.22%，方法準(zhǔn)

準(zhǔn)確度回收率應(yīng)為80%~120%

確度良好；(S)-VL的回收率為

98.68%-112.5%，平均回收率為

104.2%，RSD為4.53%，方法準(zhǔn)確

度良好。

配制3種不同濃度精密度溶液，每個由實驗結(jié)果可知，本法的系統(tǒng)精密

系統(tǒng)精濃度制備三份進(jìn)行測定，對照溶液中度和日內(nèi)精密度良好。系統(tǒng)精密度

密度的各成分峰面積RSD≤2.0%，保留時考察中，(R)-VL、(S)-VL在0.02

間RSD≤2.0%。mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL

三個濃度時，峰面積和保留時間

同一分析人員連續(xù)三天用同一儀器檢

RSD均小于2%。日間精密度考察

日間精查系統(tǒng)精密度的3個濃度，各成分峰

精密度中，連續(xù)3天考察(R)-VL、(S)-VL

密度面積RSD≤5.0%，保留時間

三個濃度保留時間的RSD均小于

RSD≤5.0%。

5%，峰面積的RSD小于5%。

上述結(jié)果顯示，在同一實驗室，由

取供試品稱樣份，檢測結(jié)果同一操作者使用相同儀器設(shè)備，按

重復(fù)性6(R)-VL

的RSD小于2%。相同的前處理方法和測試方法對供

試品進(jìn)行了6次測定，供試品中(R)-

10

VL測定結(jié)果的RSD為0.61%，小于

2%，說明該方法的重復(fù)性良好。

當(dāng)調(diào)節(jié)TFA含量比例變化±0.5%、

柱溫變化25~35℃時，系統(tǒng)適用性溶

液中維蘭特羅手性異構(gòu)體的峰面積

RSD小于5%。當(dāng)流動相比例變化

檢測方法的色譜條件發(fā)生微小變化±2%時，分離度和峰面積檢出量差

時，系統(tǒng)適用性溶液中的和異不大，但保留時間＞，

耐用性(S)-VLRSD20%

(R)-VL分離度Rs≥1.5，不同參數(shù)的說明溶劑比例對樣品的保留時間非

獲得的峰面積的RSD＜10%；常敏感。當(dāng)檢測波長變化±5nm、流

速變化±0.1時，分離度均符合規(guī)

定，峰面積檢出量差異較大。因此

在色譜條件中，應(yīng)注意控制流動相

比例、檢測波長和流速；

(R)-VL、(S)-VL在0-9h內(nèi)的常溫穩(wěn)

定性考察中，面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

RSD＜2%，線性回歸方差分析顯示

(R)-VL、(S)-VL對照品溶液在常溫及0.01＜P＜0.05，具有顯著性差異；

冷藏條件下放置一段時間后，峰面積在天的保存條件下考察，

穩(wěn)定性0-74℃

百分含量的RSD（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）(R)-VL、(S)-VL的應(yīng)穩(wěn)定性較好

≤5.0%。（RSD≤2%），回歸不顯著（對于

95%置信水平，P＞0.05）。說明0-7

天的4℃保存條件下，(R)-VL、(S)-

VL具有較好的穩(wěn)定性；

經(jīng)過對和檢測方法進(jìn)行驗證，方法的準(zhǔn)確度高、靈敏度及精密

結(jié)論(R)-VL(S)-VL

度良好，適用于維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測。

1.1專屬性實驗

進(jìn)行空白溶劑干擾實驗，取乙醇空白溶液、0.01mg/mL(S)-VL標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.01

mg/mL(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，按液相色譜條件（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)

內(nèi)容下的4.2.1項）分別進(jìn)行測試，記錄色譜圖，空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見圖1。

11

圖1專屬性實驗液相色譜圖：(a)(R)-VL；(b)(S)-VL；(c)空白溶液

結(jié)論：空白溶劑對(S)-VL和(R)-VL不產(chǎn)生干擾。

1.2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取系統(tǒng)適用性溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.5項），按

色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗測定，記錄(R)-VL的保留時間（min）、峰面

積（mAU）、拖尾因子（T）、理論塔板數(shù)（N），分離度（Rs）。記錄數(shù)據(jù)見表3、圖2。

表3系統(tǒng)適用性參數(shù)

樣品名稱保留時間/min理論塔板數(shù)/N拖尾因子/T分離度/Rs

(R)-VL12.2935631.05

(S)-VL14.7235581.072.69

圖2系統(tǒng)適用性液相色譜圖

結(jié)論：在此系統(tǒng)條件下(R)-VL的保留時間分別為12.29min；(R)-VL的理論塔板數(shù)

12

大于3000；(R)-VL的拖尾因子為1.05。(R)-VL和(S)-VL的分離度為2.69。表明在該液

相色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)符合含量測定要求，且方法精密度良好。

1.3定量限（LOQ）檢測

取定量限溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.6項）按色譜條

件（見4.2.1）進(jìn)行測定，檢測(R)-VL信噪比，當(dāng)S/N=10時為LOQ濃度，記錄色譜圖，

計算峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表4、表5，液相色譜圖見圖3。

表4維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限

峰面積

濃度信噪比保留時平均保留保留時間平均峰峰面積RSD

樣品(×104m

(mg/mL)S/N間/min時間RSD（%）面積（%）

AU)

10.8612.184429

(R)-VL0.000510.9312.1812.150.43425842912.91

10.5112.094186

表5維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限

峰面積

濃度信噪比保留時平均保留保留時間平均峰峰面積RSD

樣品(×104m

(mg/mL)S/N間/min時間RSD（%）面積（%）

AU)

10.3814.093678

(S)-VL0.000510.2514.0514.080.22365936780.53

10.2714.113698

圖3維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限液相色譜圖：(a)(R)-VL、(b)(S)-VL；

結(jié)論：在本色譜條件下，信噪比約為10時，(R)-VL、(S)-VL進(jìn)樣濃度為0.0005

mg/mL。

1.4標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測定

取標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.3項）按

色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行測定。以樣品峰面積為y軸、對應(yīng)的樣品濃度為x軸，進(jìn)行

13

線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)，見表6、表7，含量線性關(guān)系圖見圖4、圖

5。

表6(R)-VL線性關(guān)系實驗結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)液編號12345678

C(R)-VL

5102040506080100

(mg/L)

峰面積4.489.2518.3637.2345.6655.6375.0690.86

(×104)4.579.0418.4136.8745.8355.1274.3192.22

平均峰面積4.539.1518.3937.0545.7555.3874.6991.54

響應(yīng)因子90609150915592629150923093369154

響應(yīng)因子RSD（%）0.93Y軸截距/100%響應(yīng)值（%）0.03

線性方程y=0.92x–0.014相關(guān)系數(shù)0.9998

表7(S)-VL線性關(guān)系實驗結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)液編號12345678

C(R)-VL

5102040506080100

(mg/L)

峰面積3.637.6715.0830.0237.7845.2161.3777.49

(×104)3.607.6015.2131.1336.3445.9862.0678.04

平均峰面積3.627.6415.1530.5637.0645.6061.7277.76

響應(yīng)因子72407640757576407412760077157776

響應(yīng)因子RSD（%）2.27Y軸截距/100%響應(yīng)值（%）1.42

線性方程y=0.78x-0.53相關(guān)系數(shù)0.9995

圖4(R)-VL、(S)-VL的含量線性關(guān)系圖

14

圖5(R)-VL、(S)-VL的含量線性關(guān)系色譜圖

結(jié)論：(R)-VL、(S)-VL的峰面與濃度線性關(guān)系良好。在0.005-0.100mg/mL范圍內(nèi)，

(R)-VL的含量線性關(guān)系良好，回歸方程y=0.92x-0.014，R2=0.9998,響應(yīng)因子RSD為

0.93%；在0.005-0.100mg/mL范圍內(nèi)，(S)-VL的含量線性關(guān)系良好，回歸方程

y=0.78x-0.53，R2=0.9995，響應(yīng)因子RSD為2.27%。

1.5準(zhǔn)確度試驗

精密量取方法準(zhǔn)確度溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.8項）

各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按公式（2）進(jìn)行計算，實驗結(jié)果見表

8。

檢出量

回收率（）

實際加入量································2

=×100%

表8(R)-VL、(S)-VL準(zhǔn)確度測試結(jié)果

檢出量投入量回收率平均回收率RSD

(R)-VL濃度

（mg)（mg)（%）（%）（%）

10.0081101.3

5%20.00830.008103.8

30.007998.75

10.085106.3

50%20.0860.080107.4100.94.22

30.083101.4

10.14897.37

95%20.1450.15295.39

30.14796.71

15

檢出量投入量回收率平均回收率RSD

(S)-VL濃度

（mg)（mg)（%）（%）（%）

10.0089112.5

5%20.00850.008106.3

30.0088110.0

10.083104.2

50%20.0810.080101.4104.24.53

30.083104.2

10.15098.68

95%20.1510.15299.49

30.153100.9

結(jié)論：由實驗結(jié)果可知，(R)-VL、(S)-VL的方法準(zhǔn)確度良好。(R)-VL的回收率為

95.39%~107.40%，平均回收率為100.9%，RSD為4.22%，方法準(zhǔn)確度良好；(S)-VL的

回收率為98.68%~112.5%，平均回收率為104.2%，RSD為4.53%，方法準(zhǔn)確度良好。

1.6系統(tǒng)精密度和日間精密度試驗

取精密度溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.7項）按色譜條

件（見4.2.1）進(jìn)行測定，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，考察日內(nèi)精密度，以及連續(xù)3天分別

進(jìn)樣3次，考察日間精密度。計算其峰面積、保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表9。

表9維蘭特羅手性異構(gòu)體的日內(nèi)、日間精密度(mean±SD，n=3)

日內(nèi)精密度RSD(%)

A日間精密度

樣品濃度tR(min）

(×104mAU)第一天第二天第三天RSD(n=6)

(mg/mL)(n=3)

(n=3)

tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)

0.211.89±0.2218.72±0.230.150.830.071.450.101.261.611.69

(R)-VL0.511.89±0.3846.56±0.220.060.390.050.460.090.561.720.45

0.611.90±0.2456.34±0.350.050.600.060.550.180.441.830.55

A日內(nèi)精密度

樣品濃度tR(min）RSD(%)日間精密度

(×104mAU)

(mg/mL)(n=3)RSD(n=6)

(n=3)第一天第二天第三天

16

tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)

0.214.05±0.2515.61±0.240.071.100.150.870.051.321.591.33

(S)-VL0.514.04±0.2736.86±0.170.050.470.070.380.140.861.780.41

0.614.06±0.2246.10±0.470.110.730.051.280.230.581.950.89

結(jié)論：由實驗結(jié)果可知，本法的日間精密度和日內(nèi)精密度良好。日間精密度考察

中，(R)-VL在0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL三個濃度時，峰面積和保留時間

RSD均小于2%。在日間精密度考察中，連續(xù)3天考察(R)-VL三個濃度保留時間RSD

均小于5%，峰面積RSD均小于5%。

1.7重復(fù)性實驗

依照供試品溶液制備方法（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.10

項），制備六份供試品溶液，按色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行重復(fù)性試驗測定，記錄色譜

圖，實驗結(jié)果見表10。

表10(R)-VL重復(fù)性實驗結(jié)果

樣品編號質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g)平均值RSD(%)

10.760

20.762

30.766

0.7600.61

40.762

50.755

60.754

結(jié)論：上述結(jié)果顯示，在同一實驗室，由同一操作者使用相同儀器設(shè)備，按相同

的前處理方法和測試方法對供試品進(jìn)行6次測定，供試品中(R)-VL測定結(jié)果的RSD(%)

為0.61%，小于1%，說明該方法的重復(fù)性良好，在樣品溶液中未檢測出(S)-VL的峰。

1.8耐用性考察

取供系統(tǒng)適用性溶液，考察液相色譜條件發(fā)生微小變動時（流動相比率、流速、柱

溫、檢測波長），對測試結(jié)果的影響程度，以保留時間、拖尾因子、理論塔板數(shù)和含量

百分比做評估，試驗方案見表11。

表11維蘭特羅手性異構(gòu)體耐用性試驗方案

17

耐用性研究項目實驗方法條件確認(rèn)耐用性范圍考察指標(biāo)

檢測波長(nm)230檢測波長變化±5nm

TFA含量比例(%)0.10TFA含量比例變化±0.5%峰面積（A）

保留時間(tR)

柱溫(℃)30溫度變化±5℃

理論塔板數(shù)(N)

流動相比例(%)800:200流動相比例變化±2%拖尾因子(T)

流速(mL/min)1.0流速變化±0.1mL/min

1.8.1檢測波長變化±5nm

調(diào)節(jié)高效液相色譜儀的檢測波長，分別為225nm、230nm、235nm，測試系統(tǒng)適

用性溶液，實驗數(shù)據(jù)見表10，記錄色譜圖（圖6）。

表12維蘭特羅含量檢測耐用性實驗—檢測波長變化色譜數(shù)據(jù)

4

檢測波長變化tR/minA/×10mAUNTRS

225nm12.1713.5433821.05

230nm12.189.4533791.06

(R)-VL

235nm12.204.7434581.00

RSD(%)0.131.313.10

225nm14.4310.7535931.032.50

230nm14.457.6336260.972.53

(S)-VL

235nm14.443.6236711.032.52

RSD(%)0.071.083.430.61

圖6維蘭特羅含量檢測耐用性實驗—檢測波長變化液相色譜圖

由上表可知，當(dāng)檢測波長調(diào)整量在±5nm范圍內(nèi)變動時，對(R)-VL、(S)-VL的保留

時間、拖尾因子、理論塔板數(shù)變化比較小，RSD<5%，符合規(guī)定；但是對峰面積大小

18

影響比較大。

1.8.2TFA含量比例變化±0.05%

分別配制TFA含量為0.05%、0.10%、0.15%的色譜流動相，脫氣，測試系統(tǒng)適用

性溶液，記錄色譜圖（見圖7），實驗數(shù)據(jù)見表13。

表13維蘭特羅含量檢測耐用性實驗——TFA比例變化色譜數(shù)據(jù)

4

TFA含量變化tR/minA/×10mAUNTRS

0.05%11.7510.0930731.05

0.10%12.189.4533791.06

(R)-VL

0.15%11.989.4233391.010

RSD(%)1.803.925.102.54

0.05%13.857.9533611.032.33

0.10%14.457.3636760.972.53

(S)-VL

0.15%14.227.5136520.972.53

RSD(%)2.144.034.923.504.69

圖7維蘭特羅含量檢測耐用性實驗—TFA比例變化色譜圖

由表13和色譜圖可知，當(dāng)