第2節(jié)微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)

（第1課時(shí)）

向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細(xì)菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會(huì)在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？

應(yīng)該先對制作用具和原料進(jìn)行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發(fā)酵條件，避免雜菌進(jìn)入。酸奶這需要應(yīng)用無菌技術(shù)和微生物的培養(yǎng)技術(shù)一、微生物概述1.微生物的概念：_________________________的統(tǒng)稱。包括_______________________________等

2._____________，_______________________是研究和應(yīng)用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)。防止雜菌污染獲得純凈的微生物培養(yǎng)物3.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的條件：①要為人們需要的微生物提供合適的___________條件；②要確保__________________，并將需要的微生物分離出來。營養(yǎng)和環(huán)境其他微生物無法混入難以用肉眼觀察的微小生物細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物

人們按照__________________________，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，即培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的配制1.培養(yǎng)基的概念微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求2.培養(yǎng)基作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3.培養(yǎng)基類型：液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基菌落不含凝固劑（如瓊脂）在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂后制成的瓊脂固體培養(yǎng)基，是實(shí)驗(yàn)室中最常用的培養(yǎng)基之一呈液態(tài)狀態(tài)微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長形成肉眼可見的菌落補(bǔ)充資料：培養(yǎng)基的類型及用途劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定允許特定種類的微生物生長,同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基4、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成:（1）基本成分：水、碳源、氮源、無機(jī)鹽。碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：氮源NH4＋、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：來源于動(dòng)物，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì)無機(jī)鹽Zn、Cu、Mn、Co、Mo等大量元素：微量元素：Ca、K、Mg等牛肉膏、蛋白胨：自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物注意：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。如氨基酸等。2025/7/29

為什么培養(yǎng)基需要氮源？

培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。（2）特殊需求：滿足微生物對

______________________的需求④培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供_____的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加_______；②培養(yǎng)霉菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至_____；③培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至_____________；維生素酸性中性或弱堿性無氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000ml水例：某種細(xì)菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣三、無菌技術(shù)2.手段：主要包括____和____，主要包括兩個(gè)方面：（1）對實(shí)驗(yàn)操作的____、操作者的________，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的____、________和______等進(jìn)行滅菌。

無菌技術(shù)除用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？消毒滅菌空間衣著和手器皿接種用具培養(yǎng)基1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是

。防止雜菌污染

無菌技術(shù)還能有效避免操作者被微生物感染。3.消毒（1）概念：

指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。（2）常用的消毒方法①煮沸消毒法：

100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min適合一些不耐高溫的液體，如牛奶。可以殺死牛奶中的絕大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營養(yǎng)成分。用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。③化學(xué)藥劑消毒法:④紫外線消毒法：

接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前可用紫外線照射30min?？蓺⑺牢矬w表面和空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。4.滅菌（1）概念：

指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無性生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。

芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。孢子（2）常用的滅菌方法①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌效果最好，100kPa、121℃下維持15～30min，工具為高壓蒸汽滅菌鍋，常用于培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌。②干熱滅菌：將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱，在160～170℃的熱空氣中維持2～3h。常用于耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿）、金屬用具等。③灼燒滅菌：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層（外焰）灼燒，可以迅速徹底地滅菌。適用于微生物的接種工具，如涂布器、接種環(huán)、接種針或其它金屬用具，試管口、瓶口等容易被污染的部位③灼燒滅菌：四、微生物的純培養(yǎng)1.概念：（1）培養(yǎng)物：

在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。（2）純培養(yǎng)物：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體（3）純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程微生物的純培養(yǎng)包括___________、____、

____、____①配制培養(yǎng)基②滅菌③接種④分離和培養(yǎng)2.步驟：2025/7/29探究·實(shí)踐·酵母菌的純培養(yǎng)1.培養(yǎng)原理

菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。微生物群分散或稀釋單個(gè)細(xì)胞單個(gè)菌落繁殖2.獲得單菌落的方法：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物形成的純培養(yǎng)物。（1）制備培養(yǎng)基：①配制培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。②滅菌：

將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15～30min。培養(yǎng)基滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋探究·實(shí)踐·酵母菌的純培養(yǎng)3.方法步驟

將5～8套培養(yǎng)皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃滅菌2h。培養(yǎng)皿滅菌：①拔出錐形瓶的棉塞②將瓶口迅速通過火焰③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10～20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋倒平板的具體操作步驟④等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來放置既可以防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。③倒平板待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板注意事項(xiàng)：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。

防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。4.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。問題討論（2）接種和分離酵母菌

通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作(平板劃線法)，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞⑥將皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線注意：不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連平板劃線法的具體劃法注意：①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；②劃線首尾不能相接；③每次劃線前接種環(huán)進(jìn)行滅菌；④劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。12345第1區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第2區(qū)劃線接種環(huán)滅菌第3區(qū)劃線接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌2025/7/29

為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒時(shí)期目的取菌種前每次劃線前接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上原有微生物殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個(gè)細(xì)胞殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者（3）培養(yǎng)酵母菌

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。4.結(jié)果分析與評價(jià)（1）在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有，說明了什么？

在未接種的培養(yǎng)基表面應(yīng)該沒有菌落生長，如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染或滅菌不徹底。警示：在實(shí)驗(yàn)室中，切不可吃東西、喝水，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。（2）在接種酵母菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了單菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致？如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？

在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到單菌落。如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特點(diǎn)，則說明純化酵母菌的操作成功；如果觀察到了不同形態(tài)的菌落，可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規(guī)范等原因引起的。（3）你是如何記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的？

提示：可以在培養(yǎng)12h和24h后，觀察菌落的大小、形狀、顏色。培養(yǎng)24h后，菌落的大小、形狀是否發(fā)生變化，菌落顏色是否加深，光澤度是否增加，等等評估論點(diǎn)的可信程度

所謂“酵素”，就是“酶”的另一種說法。“酵素”制作就是利用微生物進(jìn)行無氧呼吸的原理，進(jìn)行像制作泡菜一樣的發(fā)酵。這樣制作的“酵素”中可能有糖類(包括-些簡單的糖和膳食纖維等)、蛋白質(zhì)(包括多種酶)、有機(jī)酸等成分，不存在它獨(dú)有的、特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，其中甚至可能含有微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，食用后可能會(huì)