Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省海洋局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定方法范圍本文件描述了大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌分離純化、鑒定和保藏的方法。本文件適用于大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T30744—2014深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范DB37/T4092—2020魚類腸道微生物分離鑒定通用技術(shù)要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

大型海藻macroalgae肉眼可見的、絕大多數(shù)是多細(xì)胞的絲狀體、膜狀體、管狀體或葉狀體植物。主要包括紅藻、綠藻和褐藻。

附生細(xì)菌epiphyticbacteria定殖于大型海藻藻體表面的細(xì)菌。

內(nèi)生細(xì)菌endophyticbacteria生長(zhǎng)在大型海藻藻體內(nèi)部的細(xì)菌。試劑與耗材試劑無菌1×PBS緩沖液：2?mMKH2PO4，0.137?MNaCl，10?mMNa2HPO4，2.7?mMKCl。陳海水：天然海水避光保存三周及以上，使用時(shí)經(jīng)孔徑0.45?μm濾膜過濾的濾液。超純水：符合GB/T6682—2008中一級(jí)水要求。酒精：75％乙醇。次氯酸鈉溶液：濃度2.5％。生理鹽水：0.9％的NaCl溶液。經(jīng)121?℃，20?min滅菌處理。保種液。向配置好的0.9％的NaCl溶液中添加甘油，至終濃度為15％（V/V），將配置好的保種液置于封閉容器儲(chǔ)存。121?℃，20?min滅菌處理。Zobell2216E培養(yǎng)基：5.0?g蛋白胨，1.0?g酵母膏，0.01?gFePO4，20.0?g瓊脂（固體培養(yǎng)基添加），1?000?mL陳海水，pH7.4～7.8。121?℃滅菌20?min。無菌液體石蠟。耗材細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（市售）。槍頭：材料為聚丙烯的微量加樣器套頭，規(guī)格為0.2?mL、1.0?mL和5.0?mL。凍存管：材料為聚丙烯，或其它可耐121?℃高溫和液氮的塑料管，容積大于或等于2.5?mL。其他生物實(shí)驗(yàn)常用耗材：紗布、封口膜。儀器與設(shè)備生化培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度能在0?℃～60?℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。振蕩培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度能在0?℃～60?℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速能在0?r/min～300?r/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。電子天平：精度為0.01?g。玻璃試管：直徑×長(zhǎng)度為18?mm×180?mm的平口玻璃試管和直徑×長(zhǎng)度為15?mm×150?mm的平口玻璃試管。錐形瓶：容量為250?mL的廣口玻璃錐形瓶。脈沖場(chǎng)電泳儀系統(tǒng)：最高輸出電壓350?V，電壓連續(xù)可調(diào)，最大輸出電流0.5?A，轉(zhuǎn)換范圍50?ms到18?h，轉(zhuǎn)換角度為0°～360°，包括電泳儀、水浴循環(huán)儀和電冰槽。其他生物實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器：超凈工作臺(tái)、漩渦振蕩器、高壓滅菌鍋和酒精燈等。藻類樣品采集與處理樣品采集采用隨機(jī)抽樣的方法，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的藻類樣本，每株樣本的重量約為30?g；樣本處理前應(yīng)置于原位海水中或在4?℃冰箱中保存（不超過24?h），2?h內(nèi)處理分析。用121?℃，20?min滅菌過濾后的海水洗滌清除藻體表面附加的沙粒、沉積物、食草動(dòng)物和雜藻，備用。樣品處理附生細(xì)菌樣品的處理稱取藻體樣品2.00?g（精確至0.01?g），置于250?mL無菌錐形瓶中，加入18?mL無菌1×PBS緩沖液，用滅菌封口膜封口，使用振蕩培養(yǎng)箱（溫度25?℃，轉(zhuǎn)速200?r/min）振蕩30?min，獲取藻體表面分離的附生細(xì)菌懸液。內(nèi)生細(xì)菌樣品的處理取洗凈的藻體樣品2.00?g放入燒杯中，先用75％乙醇浸泡，后用2.5％的次氯酸鈉溶液浸泡，浸泡時(shí)間根據(jù)藻體種類及實(shí)際情況確定，浸泡后的藻體使用超純水清洗5次以上。為了確定除菌是否徹底，可將最后一次沖洗液接種在2216E平板上，若無菌落生長(zhǎng)則認(rèn)為藻體表面除菌徹底。藻體表面除菌效果記錄表，見附錄A。取6.2.2.1中表面除菌徹底的藻體置于無菌研缽中，加入18?mL生理鹽水研磨，獲取內(nèi)生細(xì)菌懸液，備用。細(xì)菌樣品的分離與純化細(xì)菌樣品的分離附生細(xì)菌取1?mL附生細(xì)菌懸液（6.2.1），加入生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得稀釋倍數(shù)分別為10倍、100倍和1?000倍的樣品稀釋液，振蕩混勻，備用。取6.2.1和7.1.1.1制備的樣品各100?μL，分別涂布于Zobell2216E固體培養(yǎng)基上。25?℃培養(yǎng)72?h，每24?h觀察記錄單菌落形態(tài)特征，記錄表格見附錄B。內(nèi)生細(xì)菌取1?mL內(nèi)生細(xì)菌懸液（6.2.2.2），加入生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得稀釋倍數(shù)10倍、100倍和1?000倍的樣品稀釋液，振蕩混勻，備用。取6.2.2.2和7.1.2.1制備的樣品各100?μL，分別涂布于Zobell2216E固體培養(yǎng)基上。25?℃培養(yǎng)72?h，每24?h觀察記錄單菌落形態(tài)特征，記錄表格見附錄B。細(xì)菌樣品的純化根據(jù)菌落生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài)特征，選擇合適稀釋度（每培養(yǎng)皿30個(gè)～300個(gè)菌落）的培養(yǎng)皿，進(jìn)行單菌落挑取，劃線純化。方法如下：菌落數(shù)在30左右的培養(yǎng)皿，每個(gè)菌落都挑取，進(jìn)行劃線純化；菌落數(shù)在50左右的培養(yǎng)皿，挑取1/2個(gè)培養(yǎng)皿上的單菌落，進(jìn)行劃線純化；菌落數(shù)在100左右的培養(yǎng)皿，挑取1/4個(gè)培養(yǎng)皿上的單菌落，進(jìn)行劃線純化；菌落數(shù)大于100的培養(yǎng)皿，挑取特殊的其它培養(yǎng)皿上沒有出現(xiàn)過的菌落，進(jìn)行劃線純化。觀察劃線菌落形態(tài)特征是否一致，如不一致，再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)菌株，并填寫附錄B菌落形態(tài)特征統(tǒng)計(jì)表。藻類細(xì)菌鑒定與保藏細(xì)菌的鑒定DNA提取將獲得的純培養(yǎng)菌株（7.2.2）接種于斜面培養(yǎng)試管，培養(yǎng)獲得適齡斜面菌苔，加入4.5?mL滅菌后的生理鹽水通過漩渦振蕩器振蕩得到菌懸液。按照GB/T30744相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行基因組DNA提取。細(xì)菌基因組16SrRNA基因擴(kuò)增采用細(xì)菌通用的正向引物338F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和反向引物806R(3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’)對(duì)16SrRNA的V3＋V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)對(duì)擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，按照DB37/T4092—2020相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列比對(duì)對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與模式菌數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud進(jìn)行序列比對(duì)，選取序列相似度最高的前10個(gè)菌種的序列，與待鑒定菌的序列通過MEGA中鄰接法、最大似然法和最小進(jìn)化法三種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將細(xì)菌鑒定到種。細(xì)菌的保藏石蠟油封存在斜面培養(yǎng)物上，加封一層（2?cm～3?cm）無菌液體石蠟，然后置于15?℃培養(yǎng)箱中保存。填寫《菌株信息記錄表》，見附錄C。冷凍保存將獲得的純培養(yǎng)菌株（7.2.2）接種于斜面培養(yǎng)試管，獲得適齡斜面菌苔，加入4.5?mL滅菌后的保種液，通過漩渦振蕩器振蕩斜面培養(yǎng)試管，將細(xì)菌培養(yǎng)物振蕩至保種液中，或直接向液體培養(yǎng)物中添加甘油，至終濃度為15％（V/V）。隨后，轉(zhuǎn)移至凍存管中，做好標(biāo)記，保存于-20?℃冰箱或經(jīng)預(yù)冷凍（-20?℃，20?min；-40?℃，20?min～30?min；-60?℃，20?min～30?min）處理后長(zhǎng)期保存于超低溫（-80?℃）條件下。保藏的菌種不能反復(fù)凍融，如取用保藏菌株，需及時(shí)重新保藏菌種。填寫附錄C菌株信息記錄表。

（資料性）

大型海藻表面除菌效果記錄表大型海藻表面除菌效果記錄表見表A.1。大型海藻表面除菌效果記錄表浸泡時(shí)間75％酒精浸泡3?min5?min2.5％次氯酸鈉浸泡板1板2板3板1板2板33?min5?min10?min15?min“＋”代表有菌落長(zhǎng)出；“－”代表無菌落記錄者校對(duì)者審核者

（資料性）

菌落形態(tài)特征記錄表菌落形態(tài)特征記錄表見表B.1。菌落形態(tài)特征記錄表菌種編號(hào)顏色大小形狀質(zhì)地有無光澤是否濕潤(rùn)是否透明是否凸起培養(yǎng)時(shí)間記錄人記錄時(shí)間記錄者校對(duì)者審核者

（資料性）

菌株信息記錄表菌株信