FUSCA3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成與極性運(yùn)輸調(diào)控?cái)M南芥根再生機(jī)制探究一、引言1.1研究背景植物根系作為其重要的地下部分，承擔(dān)著吸收水分、養(yǎng)分，固定植株以及合成和儲(chǔ)存物質(zhì)等關(guān)鍵功能，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和生存起著決定性作用。根系的健康狀況直接關(guān)系到植物能否從土壤中獲取足夠的資源，進(jìn)而影響其整體的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)和適應(yīng)能力。強(qiáng)大且發(fā)達(dá)的根系能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱、洪澇、貧瘠等逆境條件的抵御能力，確保植物在復(fù)雜多變的自然環(huán)境中生存繁衍。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，作物根系的發(fā)育情況更是與產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。良好發(fā)育的根系有助于作物充分吸收土壤中的養(yǎng)分和水分，提高肥料利用率，減少資源浪費(fèi)，從而實(shí)現(xiàn)作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。擬南芥（Arabidopsisthaliana）作為植物生物學(xué)研究中的經(jīng)典模式植物，具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其成為研究植物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的理想材料。擬南芥植株矮小，生長(zhǎng)周期短，從種子萌發(fā)到產(chǎn)生成熟種子僅需數(shù)周時(shí)間，這使得研究者能夠在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，大大提高了研究效率。其基因組相對(duì)較小，且已完成全基因組測(cè)序，基因注釋和功能研究較為深入，為基因功能的解析和遺傳操作提供了便利條件。擬南芥還具有豐富的遺傳資源和突變體庫(kù)，通過(guò)對(duì)這些突變體的研究，能夠深入揭示基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用。此外，擬南芥易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)，為基因功能驗(yàn)證和表達(dá)調(diào)控研究提供了有力手段。FUSCA3（FUS3）作為調(diào)控種子發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在種子發(fā)育階段，F(xiàn)US3參與調(diào)控種子休眠、油脂積累、胚發(fā)育等多個(gè)重要生理過(guò)程，對(duì)種子的質(zhì)量和活力具有關(guān)鍵影響。FUS3還在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮著潛在作用，其功能的研究對(duì)于深入理解植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。然而，目前關(guān)于FUS3在植物根系再生過(guò)程中的作用機(jī)制研究相對(duì)較少，尤其是其對(duì)根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控機(jī)制尚不清楚。根系再生是植物在遭受損傷或特定環(huán)境條件下，重新生成新根系的過(guò)程，這一過(guò)程對(duì)于植物的生存和繁殖至關(guān)重要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，根系再生能力的強(qiáng)弱直接影響著作物的移栽成活率、生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量。在林業(yè)和園藝領(lǐng)域，根系再生技術(shù)的應(yīng)用也有助于提高苗木的繁殖效率和質(zhì)量。因此，深入研究植物根系再生的分子機(jī)制，對(duì)于揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育的奧秘、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)以及推動(dòng)農(nóng)業(yè)和林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究旨在探討FUSCA3通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸調(diào)控?cái)M南芥根再生的分子機(jī)制，為深入理解植物根系再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高作物根系再生能力提供潛在的技術(shù)支持。1.2擬南芥根再生相關(guān)研究現(xiàn)狀擬南芥根再生過(guò)程涉及多個(gè)復(fù)雜的生理和分子事件。當(dāng)擬南芥的根受到損傷或在特定培養(yǎng)條件下，其細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的命運(yùn)轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)根的再生。在離體葉片外植體誘導(dǎo)不定根再生的過(guò)程中，首先是葉片中的一些細(xì)胞獲得再生潛能，轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶆?chuàng)始細(xì)胞，隨后這些根創(chuàng)始細(xì)胞進(jìn)一步分化形成根原基細(xì)胞，最終發(fā)育成不定根。在這一過(guò)程中，多個(gè)基因發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子基因WOX5及其同源基因WOX7在根原基起始時(shí)特異性表達(dá)，對(duì)不定根再生的速率和根原基的細(xì)胞分裂有著重要影響，當(dāng)WOX5/7功能缺失時(shí)，葉片產(chǎn)生的不定根原基細(xì)胞分裂紊亂，根尖分化異常。WOX11和WOX12作為同一家族的轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接激活WOX5/7的表達(dá)，從而將細(xì)胞命運(yùn)由根創(chuàng)始細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦?xì)胞，推動(dòng)不定根再生進(jìn)程。植物激素在擬南芥根再生過(guò)程中也起著不可或缺的調(diào)控作用。生長(zhǎng)素作為一種重要的植物激素，在根再生中扮演著核心角色。研究表明，外源添加較低濃度的生長(zhǎng)素可以促進(jìn)根的生長(zhǎng)，而高濃度的生長(zhǎng)素則會(huì)抑制主根延伸，但能刺激側(cè)根和不定根的發(fā)生。這是因?yàn)樯L(zhǎng)素參與了中柱鞘細(xì)胞的分裂過(guò)程，并且其極性運(yùn)輸對(duì)根的發(fā)育至關(guān)重要。在擬南芥中，生長(zhǎng)素的合成有依賴(lài)色氨酸和不依賴(lài)色氨酸兩條途徑，其中磷酸吡哆醛依賴(lài)酶在依賴(lài)色氨酸的生長(zhǎng)素合成途徑中起著重要的調(diào)控作用，該酶表達(dá)缺陷會(huì)影響生長(zhǎng)素合成，進(jìn)而影響主根生長(zhǎng)。生長(zhǎng)素的運(yùn)輸則依賴(lài)于輸入載體和輸出載體，輸入載體AUX1專(zhuān)一地在根的表皮細(xì)胞、側(cè)根根冠和中柱組織中表達(dá)，其突變體無(wú)向重力性生長(zhǎng)特征，而輸出載體PIN蛋白家族（如PIN1、PIN2等）分布在不同組織中調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素外流，不同的PIN蛋白在根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各自發(fā)揮著獨(dú)特的作用，PIN1對(duì)主根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)至關(guān)重要，PIN2蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致向性喪失和側(cè)根減少。細(xì)胞分裂素對(duì)擬南芥根再生也有顯著影響，主要表現(xiàn)為抑制主根伸長(zhǎng)。當(dāng)對(duì)外源添加一定量的細(xì)胞分裂素時(shí)，擬南芥主根長(zhǎng)度明顯減小，伸長(zhǎng)減緩，這可能是由于細(xì)胞分裂素阻斷了分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞長(zhǎng)度和數(shù)目的增加，降低了分裂細(xì)胞的數(shù)目和分生組織的大小。細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑中相關(guān)基因也參與了對(duì)根再生的調(diào)控，當(dāng)擬南芥中細(xì)胞分裂素的3個(gè)受體基因全部缺失時(shí)，植株對(duì)細(xì)胞分裂素不敏感，根、莖頂端分生組織的細(xì)胞分裂速率明顯降低。乙烯、脫落酸和赤霉素等植物激素也在擬南芥根再生過(guò)程中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用，它們與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相互作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細(xì)地調(diào)節(jié)著擬南芥根再生的各個(gè)環(huán)節(jié)。1.3FUSCA3基因研究概述FUSCA3基因最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，它屬于B3轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用。FUS3基因的突變會(huì)導(dǎo)致植物在種子發(fā)育階段出現(xiàn)多種異常表型。在種子休眠方面，正常情況下，種子需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的休眠期，以確保在適宜的環(huán)境條件下萌發(fā)。而FUS3基因突變體的種子休眠特性被打破，種子容易提前萌發(fā)，這可能導(dǎo)致種子在不適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)，影響其生存和繁殖。在油脂積累上，種子中的油脂是重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，對(duì)于種子的萌發(fā)和早期生長(zhǎng)提供能量支持。FUS3基因突變會(huì)使得種子中油脂積累減少，從而影響種子的活力和萌發(fā)后的生長(zhǎng)狀況。胚發(fā)育方面，F(xiàn)US3基因?qū)ε叩恼Ｐ螒B(tài)建成和細(xì)胞分化起著不可或缺的調(diào)控作用，突變體的胚發(fā)育常常出現(xiàn)畸形，如胚的大小、形狀異常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等，這些異常會(huì)嚴(yán)重影響種子的質(zhì)量和植物的后續(xù)生長(zhǎng)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FUS3基因在植物的其他生長(zhǎng)發(fā)育階段也具有重要功能。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，F(xiàn)US3基因與生長(zhǎng)素、脫落酸等激素信號(hào)相互作用。在生長(zhǎng)素信號(hào)通路中，F(xiàn)US3基因可能通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響生長(zhǎng)素的合成水平，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在脫落酸信號(hào)通路中，F(xiàn)US3基因與脫落酸信號(hào)元件相互作用，調(diào)節(jié)植物對(duì)脫落酸的響應(yīng)，影響種子休眠和萌發(fā)過(guò)程。在逆境響應(yīng)過(guò)程中，F(xiàn)US3基因能夠參與植物對(duì)干旱、高鹽等逆境脅迫的響應(yīng)。當(dāng)植物遭受干旱脅迫時(shí)，F(xiàn)US3基因表達(dá)上調(diào)，激活一系列下游基因的表達(dá)，這些基因參與調(diào)節(jié)植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、抗氧化酶活性等，從而增強(qiáng)植物的抗旱能力；在高鹽脅迫下，F(xiàn)US3基因通過(guò)調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，維持植物細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，提高植物的耐鹽性。目前，關(guān)于FUS3基因在根再生方面的研究相對(duì)較少，但已有研究表明其可能參與根再生過(guò)程的調(diào)控。在擬南芥根再生過(guò)程中，F(xiàn)US3基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在根損傷后的早期階段，F(xiàn)US3基因表達(dá)迅速上調(diào)，隨著根再生的進(jìn)行，其表達(dá)水平逐漸恢復(fù)。這種表達(dá)變化暗示FUS3基因可能在根再生的起始階段發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)US3基因可能通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的合成和極性運(yùn)輸來(lái)影響根再生。在FUS3基因突變體中，根再生能力明顯減弱，同時(shí)生長(zhǎng)素的合成和運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生改變，進(jìn)一步說(shuō)明FUS3基因與根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素調(diào)控密切相關(guān)。然而，F(xiàn)US3基因如何具體介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸來(lái)調(diào)控?cái)M南芥根再生的分子機(jī)制仍有待深入探究，這也為本研究提供了重要的切入點(diǎn)和研究方向。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究FUSCA3基因在擬南芥根再生過(guò)程中的作用機(jī)制，明確其如何通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸來(lái)調(diào)控根再生這一復(fù)雜的生理過(guò)程。通過(guò)對(duì)FUSCA3基因功能的深入解析，有助于填補(bǔ)植物根系再生領(lǐng)域在該基因調(diào)控機(jī)制方面的空白，進(jìn)一步完善植物根系再生的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為理解植物生長(zhǎng)發(fā)育的基本規(guī)律提供新的理論依據(jù)。在理論層面，F(xiàn)USCA3作為種子發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其在根再生過(guò)程中的作用研究尚處于起步階段。本研究聚焦于FUSCA3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸調(diào)控?cái)M南芥根再生的分子機(jī)制，有望揭示FUSCA3在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的新功能和作用途徑。通過(guò)研究FUSCA3與生長(zhǎng)素相關(guān)基因之間的相互作用，能夠深入了解植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在根再生過(guò)程中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，豐富對(duì)植物細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變和器官再生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的理論發(fā)展做出貢獻(xiàn)。在實(shí)際應(yīng)用方面，根系再生能力對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和林業(yè)、園藝領(lǐng)域都具有重要意義。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物移栽時(shí)根系容易受到損傷，提高根系再生能力有助于提高移栽成活率，促進(jìn)作物快速生長(zhǎng)，減少緩苗期，從而增加作物產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究成果可為培育具有更強(qiáng)根系再生能力的作物品種提供理論指導(dǎo)，通過(guò)基因工程手段調(diào)控FUSCA3基因及其相關(guān)信號(hào)通路，有望開(kāi)發(fā)出促進(jìn)作物根系再生的新技術(shù)和新方法，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，減少資源浪費(fèi)，推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。在林業(yè)和園藝領(lǐng)域，苗木的繁殖和培育依賴(lài)于良好的根系再生能力。本研究結(jié)果可為優(yōu)化苗木繁殖技術(shù)提供參考，通過(guò)調(diào)控FUSCA3基因的表達(dá)或其相關(guān)信號(hào)途徑，有望提高苗木的扦插成活率和移栽成功率，培育出根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯的苗木，提升林業(yè)和園藝產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1植物材料及生長(zhǎng)條件本實(shí)驗(yàn)選用的擬南芥（Arabidopsisthaliana）品種為哥倫比亞生態(tài)型（Col-0），野生型擬南芥種子購(gòu)自知名種子供應(yīng)商，確保種子的純度和活力符合實(shí)驗(yàn)要求。突變體材料fusca3（fus3）由本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)化學(xué)誘變或T-DNA插入的方法獲得，并經(jīng)過(guò)多代自交純化，以保證遺傳背景的一致性。種子在播種前需進(jìn)行消毒處理，具體步驟如下：將擬南芥種子置于1.5mL離心管中，加入1mL75%乙醇，輕輕振蕩1分鐘，以去除種子表面的雜質(zhì)和微生物；吸去乙醇，加入1mL50%次氯酸鈉溶液（含0.05%吐溫），振蕩洗滌15-20分鐘，進(jìn)行消毒殺菌；消毒完成后，稍離心使種子沉于管底，吸去次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌蒸餾水清洗種子3次，每次清洗后稍離心，吸凈水分，以確保種子表面無(wú)殘留的消毒劑。消毒后的種子用接種環(huán)均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，MS培養(yǎng)基的配方包括大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分等，各成分的濃度需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配方配制。將鋪有種子的培養(yǎng)皿用封口膜封口，放入4℃冰箱內(nèi)冷處理2-3天，進(jìn)行春化處理，以打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)的同步化。春化處理后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為：溫度20℃-22℃，這是擬南芥生長(zhǎng)的最適溫度范圍，在此溫度下，擬南芥的各項(xiàng)生理活動(dòng)能夠正常進(jìn)行，有利于植株的健康生長(zhǎng)；濕度70%左右，適宜的濕度環(huán)境可以防止培養(yǎng)基干燥，同時(shí)避免因濕度過(guò)高導(dǎo)致霉菌滋生；光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1，采用長(zhǎng)日照條件，即16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，模擬自然光照周期，滿足擬南芥生長(zhǎng)對(duì)光照的需求。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至具有4片真葉時(shí)，將其移栽至人工土中進(jìn)行土培。人工土由18份蛭石、6份黑土和1份珍珠巖混合均勻而成，分裝于塑料滅菌袋內(nèi)，在98kPa、121.3℃條件下滅菌40分鐘，冷卻后備用。移栽時(shí)，每盤(pán)種植1株幼苗，移栽后加蓋保鮮膜保濕1天，并及時(shí)澆水，以保證幼苗能夠順利適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，提高移栽成活率。2.1.2菌株及質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌菌株為DH5α和BL21(DE3)。DH5α菌株基因型為F?endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK?,λ?)，具有recA1和endA1突變，有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取，常用于質(zhì)?？寺『娃D(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。BL21(DE3)菌株基因型為F?ompTgaldcmlonhsdSB(rB?mB?)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5])，該菌株用于以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主，T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)受控于λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于BL21的染色體上，適合于非毒性蛋白的表達(dá)。所用質(zhì)粒包括pMD18-T載體和pET-28a(+)表達(dá)載體。pMD18-T載體是一種常用的克隆載體，具有氨芐青霉素抗性基因，其多克隆位點(diǎn)兩側(cè)帶有T7和SP6啟動(dòng)子，便于對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和測(cè)序分析。pET-28a(+)表達(dá)載體含有卡那霉素抗性基因，帶有T7啟動(dòng)子和His標(biāo)簽序列，可用于目的基因的表達(dá)和融合蛋白的純化，通過(guò)將目的基因克隆到該載體中，在BL21(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，可獲得帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，方便后續(xù)利用鎳柱進(jìn)行親和層析純化。2.1.3酶與各種生化試劑常用的酶包括限制性?xún)?nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶（如AMVReverseTranscriptase）等。限制性?xún)?nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在特定位置切割DNA雙鏈，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)對(duì)載體和目的基因進(jìn)行酶切處理；T4DNA連接酶可催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，將酶切后的載體和目的基因連接起來(lái)，形成重組質(zhì)粒；TaqDNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以擴(kuò)增特定的DNA片段；逆轉(zhuǎn)錄酶則用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)。生化試劑有蛋白酶K、SDS（十二烷基硫酸鈉）、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、MOPS（3-嗎啉丙磺酸）、鹽酸胍、吖啶橙、DMSO（二甲基亞砜）、TRICINE（N-[三（羥甲基）甲基]甘氨酸）等。蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，在DNA提取等實(shí)驗(yàn)中用于去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)；SDS用于溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜并解離細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀，常用于蛋白質(zhì)變性和SDS電泳實(shí)驗(yàn)；IPTG常用于藍(lán)白斑篩選及IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)的蛋白表達(dá)等，它和乳糖結(jié)構(gòu)相似，可與乳糖操縱元的阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏蛋白對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；MOPS是一種緩沖液，有抑制RNA酶的作用，一般和甲醛用于RNA變性電泳；鹽酸胍可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵發(fā)生斷裂，增加非極性分子包括氨基酸側(cè)鏈的溶解度，減少疏水相互作用，常用于蛋白質(zhì)變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)；吖啶橙是一種熒光色素，與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)；DMSO實(shí)驗(yàn)室常用于作液體層析溶劑，同時(shí)用作測(cè)試物質(zhì)紫外消光值時(shí)的參照物，能溶于所有烷烴和烯烴；TRICINE常見(jiàn)于Tris-Tricine電泳系統(tǒng)，用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。2.1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器主要實(shí)驗(yàn)儀器有PCR儀（如Bio-RadC1000Touch梯度PCR儀和CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀）、高速離心機(jī)（如德國(guó)Sigma公司的3-18K型高速離心機(jī)）、DNA提取儀（如Qiagen公司的DNeasyPlantMiniKit配套的提取設(shè)備）、電泳儀（如Bio-Rad公司的PowerPacUniversal通用電源電泳儀）、凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadChemiDocXRS+高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)）、移液器（如EppendorfResearchplus移液器，量程涵蓋0.1-1000μL）、混合器（如渦旋振蕩器）、熱浴箱（如水浴鍋）、超凈工作臺(tái)（如蘇州凈化設(shè)備有限公司的SW-CJ-2FD型雙人雙面超凈工作臺(tái)）、生物安全柜（如ESCOAirstream1300IIA2型生物安全柜）等。PCR儀用于精確控制溫度變化，實(shí)現(xiàn)DNA的變性、退火和延伸，以擴(kuò)增特定的DNA片段，梯度PCR儀可在一次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不同的退火溫度，方便優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀則用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的DNA產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的定量分析；高速離心機(jī)用于分離和純化DNA、RNA等生物分子，通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力使樣品中的雜質(zhì)和目標(biāo)分子分離；DNA提取儀用于從細(xì)胞、組織或樣品中提取DNA，通過(guò)自動(dòng)化的操作流程，提高DNA提取的效率和質(zhì)量；電泳儀用于分離和鑒定DNA、RNA和蛋白質(zhì)，通過(guò)在電場(chǎng)作用下，使帶電分子在凝膠介質(zhì)中遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離；凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和記錄電泳結(jié)果，通過(guò)高分辨率的圖像采集和分析軟件，對(duì)凝膠中的條帶進(jìn)行定量和定性分析；移液器用于精確量取和轉(zhuǎn)移小體積的液體，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性；混合器用于混合PCR反應(yīng)混合物等，保證反應(yīng)混合物均勻，提高實(shí)驗(yàn)效果；熱浴箱用于提供恒定的溫度環(huán)境，滿足DNA變性、退火和延伸等實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)溫度的要求；超凈工作臺(tái)和生物安全柜用于在無(wú)菌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，防止交叉污染，保障實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)樣品的安全。2.1.5PCR引物實(shí)驗(yàn)中使用的PCR引物根據(jù)目的基因FUSCA3以及相關(guān)基因（如生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸相關(guān)基因）的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般在15-30bp之間，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；引物GC含量通常為40%-60%，使引物具有合適的退火溫度；引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在50-65℃左右，以確保引物在PCR反應(yīng)中的有效退火；引物3’端不可修飾，且避免出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基、互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，防止非特異性擴(kuò)增；引物5’端可以進(jìn)行適當(dāng)修飾，如添加酶切位點(diǎn)等，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求；堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)，減少引物二聚體的形成。以FUSCA3基因的PCR引物設(shè)計(jì)為例，首先在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找FUSCA3基因的核苷酸序列，然后利用PrimerPremier軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在軟件中設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如引物長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等，軟件會(huì)根據(jù)設(shè)定的參數(shù)生成多對(duì)引物。對(duì)生成的引物進(jìn)行分析和篩選，點(diǎn)擊EditPrimers對(duì)引物進(jìn)行編輯，從3’端進(jìn)行堿基的刪除調(diào)整，盡量避免出現(xiàn)紅色標(biāo)注的不符合要求的區(qū)域。最后將選定的引物在NCBI進(jìn)行特異性BLAST比對(duì)，確保引物的特異性，避免與其他基因序列發(fā)生非特異性結(jié)合，然后交由專(zhuān)業(yè)的生物公司合成引物。合成后的引物經(jīng)溶解、稀釋后，保存于-20℃冰箱中備用。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1擬南芥的種植與培養(yǎng)擬南芥種子的種植需遵循嚴(yán)格的步驟和條件。將經(jīng)過(guò)消毒處理的種子用接種環(huán)均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，MS培養(yǎng)基由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分等按特定比例配制而成。為打破種子休眠，促進(jìn)種子同步萌發(fā)，將鋪有種子的培養(yǎng)皿用封口膜封口后，放入4℃冰箱內(nèi)冷處理2-3天，即進(jìn)行春化處理。春化處理結(jié)束后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為溫度20℃-22℃，此溫度范圍適宜擬南芥的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)；濕度保持在70%左右，既能防止培養(yǎng)基干燥，又可避免因濕度過(guò)高導(dǎo)致霉菌滋生；光照強(qiáng)度設(shè)置為100-120μmol?m?2?sec?1，采用長(zhǎng)日照條件，即16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，模擬自然光照周期，滿足擬南芥生長(zhǎng)對(duì)光照的需求。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至具有4片真葉時(shí)，需將其移栽至人工土中進(jìn)行土培。人工土由18份蛭石、6份黑土和1份珍珠巖混合均勻而成，分裝于塑料滅菌袋內(nèi)，在98kPa、121.3℃條件下滅菌40分鐘，冷卻后備用。移栽時(shí)，每盤(pán)種植1株幼苗，移栽后加蓋保鮮膜保濕1天，并及時(shí)澆水，以確保幼苗能夠順利適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，提高移栽成活率。2.2.2擬南芥離體再生根的培養(yǎng)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、具有4-6片真葉的擬南芥幼苗，在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將幼苗的根從基部切下，長(zhǎng)度控制在0.5-1cm左右，以獲取離體根組織。將切下的離體根迅速轉(zhuǎn)移至含有特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，并添加0.5mg/L的萘乙酸（NAA）和0.1mg/L的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），這些植物激素的添加能夠有效誘導(dǎo)根的再生。培養(yǎng)基的pH值需調(diào)節(jié)至5.8，以提供適宜的酸堿度環(huán)境。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22℃，光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1，光照時(shí)間為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。每隔2-3天觀察一次根的生長(zhǎng)情況，記錄根的再生數(shù)量、長(zhǎng)度和形態(tài)變化等指標(biāo)。在培養(yǎng)過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基出現(xiàn)污染或干涸現(xiàn)象，需及時(shí)更換培養(yǎng)基，以保證離體根能夠在良好的環(huán)境中生長(zhǎng)和再生。2.2.3植物基因組DNA的提取與純化采用CTAB法提取擬南芥基因組DNA。取約0.1g的擬南芥葉片組織，置于預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，使細(xì)胞充分破碎。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%-巰基乙醇），-巰基乙醇需在使用前現(xiàn)加，以防止酚類(lèi)物質(zhì)氧化。輕輕顛倒離心管，使樣品與提取緩沖液充分混合，然后將離心管置于65℃水浴鍋中溫育30-60分鐘，期間每隔10-15分鐘輕輕顛倒離心管，以促進(jìn)DNA的釋放和溶解。溫育結(jié)束后，將離心管取出，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）混合液，輕輕顛倒離心管10-15分鐘，使溶液充分混勻，形成乳濁液。將離心管在12000rpm下離心10-15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為含有DNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，下層為氯仿-異戊醇有機(jī)相。小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，注意不要吸到中間層的雜質(zhì)。向新的離心管中加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒離心管，使DNA沉淀析出，可見(jiàn)白色絲狀或絮狀沉淀。將離心管在-20℃冰箱中放置30-60分鐘，以促進(jìn)DNA沉淀完全。取出離心管，在12000rpm下離心10-15分鐘，棄去上清液，此時(shí)DNA沉淀會(huì)附著在離心管底部。用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，每次加入1mL70%乙醇，輕輕顛倒離心管，然后在12000rpm下離心5-10分鐘，棄去上清液。最后一次洗滌后，將離心管置于超凈工作臺(tái)中，敞口放置10-15分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，但需注意避免DNA干燥過(guò)度。待乙醇揮發(fā)完全后，加入適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA沉淀，將離心管置于4℃冰箱中過(guò)夜，使DNA充分溶解。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度和純度，將DNA溶液稀釋至合適濃度，保存于-20℃冰箱中備用。2.2.4植物組織總RNA的提取與純化采用Trizol法提取擬南芥組織總RNA。取約0.1g的擬南芥葉片或根組織，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，使細(xì)胞充分破碎，確保RNA釋放。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入1mLTrizol試劑，立即劇烈振蕩1-2分鐘，使樣品與Trizol試劑充分混勻，裂解細(xì)胞，釋放RNA。將離心管在室溫下靜置5-10分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入200μL氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15-30秒，使溶液充分乳化，形成乳濁液。將離心管在室溫下靜置2-3分鐘，然后在12000rpm、4℃條件下離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，注意不要吸到中間層和下層液體，避免蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)污染RNA。向新的離心管中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒離心管混勻，在室溫下靜置10-15分鐘，使RNA沉淀析出。將離心管在12000rpm、4℃條件下離心10-15分鐘，棄去上清液，此時(shí)RNA沉淀會(huì)附著在離心管底部，呈白色或透明膠狀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒離心管，然后在7500rpm、4℃條件下離心5-10分鐘，棄去上清液。最后一次洗滌后，將離心管置于超凈工作臺(tái)中，敞口放置5-10分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，但需注意避免RNA干燥過(guò)度。待乙醇揮發(fā)完全后，加入適量的無(wú)RNase水溶解RNA沉淀，將離心管置于65℃水浴鍋中溫育5-10分鐘，促進(jìn)RNA溶解，然后將離心管置于冰上冷卻。為去除殘留的基因組DNA，使用DNaseI進(jìn)行消化處理。在含有RNA的離心管中加入適量的10×DNaseI緩沖液、DNaseI酶和無(wú)RNase水，使總體積達(dá)到合適量，輕輕混勻。將離心管在37℃水浴鍋中溫育30-60分鐘，期間每隔10-15分鐘輕輕顛倒離心管，使反應(yīng)充分進(jìn)行。溫育結(jié)束后，加入適量的EDTA溶液終止反應(yīng)，然后使用RNA純化試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化操作，去除消化產(chǎn)生的DNA片段和其他雜質(zhì)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度，將RNA溶液稀釋至合適濃度，保存于-80℃冰箱中備用。2.2.5反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。在冰上配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，取1μg總RNA作為模板，加入1μLOligo(dT)18引物（0.5μg/μL）或隨機(jī)引物（100μM），用無(wú)RNase水補(bǔ)充體積至12μL，輕輕混勻。將反應(yīng)管在65℃水浴鍋中溫育5分鐘，然后迅速置于冰上冷卻5分鐘，使RNA-引物復(fù)合物退火。向退火后的反應(yīng)管中加入4μL5×ReactionBuffer、1μLRiboLockRNaseInhibitor（20U/μL）、2μL10mMdNTPMix和1μLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase（200U/μL），輕輕混勻，使總體積達(dá)到20μL。將反應(yīng)管在42℃水浴鍋中溫育60分鐘，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管在70℃水浴鍋中溫育10分鐘，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。將合成的cDNA第一鏈保存于-20℃冰箱中備用，或直接用于后續(xù)的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。2.2.6實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，其中包括10μL2×SYBRGreenMasterMix（如RocheLightCycler480SYBRGreenIMaster），該試劑包含了PCR反應(yīng)所需的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?離子和SYBRGreenI熒光染料等成分；1μL上游引物（10μM）和1μL下游引物（10μM），引物根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)，需保證其特異性和擴(kuò)增效率；2μLcDNA模板，模板的濃度需根據(jù)前期測(cè)定結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)源_保反應(yīng)在合適的線性范圍內(nèi)；6μLddH?O，用于補(bǔ)充反應(yīng)體系的體積。反應(yīng)條件設(shè)置如下：首先在95℃預(yù)變性10分鐘，使DNA模板充分變性，打開(kāi)雙鏈結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的引物結(jié)合和擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，使雙鏈DNA解鏈，為引物結(jié)合提供單鏈模板；60℃退火和延伸60秒，在此溫度下，引物與模板特異性結(jié)合，TaqDNA聚合酶以dNTPs為原料，從引物的3’端開(kāi)始延伸，合成新的DNA鏈。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段，通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SYBRGreenI熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。采用熔解曲線分析來(lái)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，從60℃開(kāi)始，以0.1℃/秒的速度緩慢升溫至95℃，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。當(dāng)雙鏈DNA解鏈時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)隨著雙鏈的解開(kāi)而逐漸降低，通過(guò)繪制熒光信號(hào)強(qiáng)度隨溫度變化的曲線，即熔解曲線，可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一特異性產(chǎn)物。如果熔解曲線只有一個(gè)尖銳的峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好；若出現(xiàn)多個(gè)峰，則可能存在非特異性擴(kuò)增或引物二聚體等問(wèn)題，需要對(duì)引物設(shè)計(jì)或反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用相對(duì)定量法（2?ΔΔCt法）分析基因表達(dá)水平。首先計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因（如ACTIN2）的Ct值，Ct值即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過(guò)公式ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因計(jì)算每個(gè)樣本的ΔCt值，然后以對(duì)照組的ΔCt值為基準(zhǔn)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的ΔΔCt值，即ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。最后根據(jù)公式2?ΔΔCt計(jì)算目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)變化，從而分析基因的表達(dá)差異。2.2.7表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化擬南芥表達(dá)載體構(gòu)建是研究基因功能的重要步驟。以pCAMBIA1300載體為基礎(chǔ)，利用限制性?xún)?nèi)切酶（如EcoRI和BamHI）對(duì)載體和含有目的基因FUSCA3的DNA片段進(jìn)行雙酶切處理。將pCAMBIA1300載體和目的基因FUSCA3的DNA片段分別加入到含有相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶、10×Buffer和ddH?O的反應(yīng)體系中，總體積為20μL，在37℃水浴鍋中溫育3-4小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，使用凝膠回收試劑盒（如QiagenGelExtractionKit）回收目的基因片段和載體片段，去除雜質(zhì)和未酶切的DNA。將回收的目的基因片段和載體片段按照摩爾比3:1的比例加入到含有T4DNA連接酶、10×T4DNALigaseBuffer和ddH?O的連接反應(yīng)體系中，總體積為10μL，在16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜，使目的基因片段與載體通過(guò)粘性末端互補(bǔ)配對(duì)并在T4DNA連接酶的作用下形成重組表達(dá)載體。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取5μL重組表達(dá)載體加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使重組表達(dá)載體充分吸附在感受態(tài)細(xì)胞表面。將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘，使感受態(tài)細(xì)胞在熱激和冷激的作用下發(fā)生細(xì)胞膜通透性的改變，從而將重組表達(dá)載體攝入細(xì)胞內(nèi)。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素，50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，使轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞在平板上生長(zhǎng)形成單菌落。挑取單菌落接種到含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。將鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從-80℃冰箱中取出GV3101感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取5μL重組表達(dá)載體加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴5分鐘。將離心管迅速放入液氮中速凍5分鐘，然后置于37℃水浴鍋中溫育5分鐘，反復(fù)凍融3次，使農(nóng)桿菌細(xì)胞吸收重組表達(dá)載體。向離心管中加入900μL不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，在28℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL）的YEP固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，28℃倒置培養(yǎng)48-72小時(shí)，使轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌細(xì)胞在平板上生長(zhǎng)形成單菌落。挑取單菌落接種到含有相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，確保重組表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。采用蘸花法將含有重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥植株。在擬南芥植株生長(zhǎng)至抽薹期，花序長(zhǎng)出但尚未大量開(kāi)花時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在5000rpm下離心10分鐘，收集菌體，用轉(zhuǎn)化緩沖液（5%蔗糖，0.05%SilwetL-77）重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD???=0.8-1.0。將擬南芥植株的花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)30-60秒，使花序充分接觸菌液。轉(zhuǎn)化后，將植株用黑色塑料袋罩住，暗處理24小時(shí)，然后置于正常光照條件下培養(yǎng)，定期澆水和施肥，待種子成熟后收獲T?代種子。2.2.8轉(zhuǎn)基因植株的分析為篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，將收獲的T?代種子用75%乙醇消毒1-2分鐘，然后用50%次氯酸鈉溶液（含0.05%吐溫）消毒10-15分鐘，無(wú)菌水沖洗5-6次，去除消毒劑殘留。將消毒后的種子均勻鋪在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL）的MS固體培養(yǎng)基平板上，4℃春化處理2-3天，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為22℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。在培養(yǎng)7-10天后，觀察平板上種子的萌發(fā)情況。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性種子由于攜帶了重組表達(dá)載體上的抗生素抗性基因，能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基上正常萌發(fā)并生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化三、FUSCA3在擬南芥根再生中的作用3.1誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)和反義表達(dá)FUS3轉(zhuǎn)基因植株的獲得為深入探究FUSCA3基因在擬南芥根再生過(guò)程中的作用機(jī)制，首先需構(gòu)建誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株。以pER8載體為基礎(chǔ)進(jìn)行誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建。通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增FUSCA3基因的編碼區(qū)序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，引入與pER8載體多克隆位點(diǎn)相匹配的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列，以便后續(xù)進(jìn)行酶切連接反應(yīng)。將擴(kuò)增得到的FUSCA3基因片段和pER8載體分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶（如EcoRI和BamHI）進(jìn)行雙酶切處理。酶切反應(yīng)體系包含適量的DNA模板、限制性?xún)?nèi)切酶、10×Buffer和ddH?O，總體積為20μL，在37℃水浴鍋中溫育3-4小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后使用凝膠回收試劑盒（如QiagenGelExtractionKit）回收目的基因片段和載體片段，去除雜質(zhì)和未酶切的DNA。將回收的FUSCA3基因片段和pER8載體片段按照摩爾比3:1的比例加入到含有T4DNA連接酶、10×T4DNALigaseBuffer和ddH?O的連接反應(yīng)體系中，總體積為10μL，在16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜，使目的基因片段與載體通過(guò)粘性末端互補(bǔ)配對(duì)并在T4DNA連接酶的作用下形成重組表達(dá)載體。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取5μL重組表達(dá)載體加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使重組表達(dá)載體充分吸附在感受態(tài)細(xì)胞表面。將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘，使感受態(tài)細(xì)胞在熱激和冷激的作用下發(fā)生細(xì)胞膜通透性的改變，從而將重組表達(dá)載體攝入細(xì)胞內(nèi)。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素，50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，使轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞在平板上生長(zhǎng)形成單菌落。挑取單菌落接種到含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。對(duì)于反義表達(dá)載體的構(gòu)建，采用類(lèi)似的方法。從擬南芥基因組DNA中擴(kuò)增FUSCA3基因的反義片段，將其反向插入到pER8載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成反義表達(dá)載體。同樣經(jīng)過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、篩選單菌落、質(zhì)粒提取和鑒定等步驟，確保反義表達(dá)載體的正確性。將鑒定正確的誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)和反義表達(dá)FUS3的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從-80℃冰箱中取出GV3101感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取5μL重組表達(dá)載體加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴5分鐘。將離心管迅速放入液氮中速凍5分鐘，然后置于37℃水浴鍋中溫育5分鐘，反復(fù)凍融3次，使農(nóng)桿菌細(xì)胞吸收重組表達(dá)載體。向離心管中加入900μL不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，在28℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL）的YEP固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，28℃倒置培養(yǎng)48-72小時(shí)，使轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌細(xì)胞在平板上生長(zhǎng)形成單菌落。挑取單菌落接種到含有相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，確保重組表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。采用蘸花法將含有誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)和反義表達(dá)FUS3重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化擬南芥植株。在擬南芥植株生長(zhǎng)至抽薹期，花序長(zhǎng)出但尚未大量開(kāi)花時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在5000rpm下離心10分鐘，收集菌體，用轉(zhuǎn)化緩沖液（5%蔗糖，0.05%SilwetL-77）重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD???=0.8-1.0。將擬南芥植株的花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)30-60秒，使花序充分接觸菌液。轉(zhuǎn)化后，將植株用黑色塑料袋罩住，暗處理24小時(shí)，然后置于正常光照條件下培養(yǎng)，定期澆水和施肥，待種子成熟后收獲T?代種子。將收獲的T?代種子用75%乙醇消毒1-2分鐘，然后用50%次氯酸鈉溶液（含0.05%吐溫）消毒10-15分鐘，無(wú)菌水沖洗5-6次，去除消毒劑殘留。將消毒后的種子均勻鋪在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL）的MS固體培養(yǎng)基平板上，4℃春化處理2-3天，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為22℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。在培養(yǎng)7-10天后，觀察平板上種子的萌發(fā)情況。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性種子由于攜帶了重組表達(dá)載體上的抗生素抗性基因，能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基上正常萌發(fā)并生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的種子則不能萌發(fā)或生長(zhǎng)受到抑制。挑選出在含有抗生素培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，移栽至人工土中繼續(xù)培養(yǎng)，收獲T?代種子。對(duì)T?代種子進(jìn)行同樣的篩選和種植，連續(xù)篩選多代，直至獲得純合的誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。3.2FUS3表達(dá)量的改變對(duì)根再生的影響3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理為探究FUS3表達(dá)量的改變對(duì)根再生的影響，選取野生型擬南芥（Col-0）、誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）作為實(shí)驗(yàn)材料。將這三種植株在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至4-6片真葉的幼苗期，然后在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將幼苗的根從基部切下，長(zhǎng)度控制在0.5-1cm左右，獲取離體根組織。將切下的離體根分別接種到含有不同濃度生長(zhǎng)素（NAA）的MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)素濃度設(shè)置為0μM、0.1μM、0.5μM、1μM四個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)離體根。培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.8，并添加3%蔗糖和0.8%瓊脂粉，以提供適宜的營(yíng)養(yǎng)和凝固環(huán)境。將接種后的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22℃，光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1，光照時(shí)間為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在培養(yǎng)5天后，統(tǒng)計(jì)不同處理下離體根的再生情況。結(jié)果顯示，在不添加生長(zhǎng)素（0μMNAA）的培養(yǎng)基上，野生型擬南芥（Col-0）的離體根再生率約為30%，平均再生根長(zhǎng)度為1.2±0.3cm；誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）離體根再生率為55%，平均再生根長(zhǎng)度達(dá)到2.0±0.4cm；反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）離體根再生率僅為15%，平均再生根長(zhǎng)度為0.8±0.2cm。這表明在無(wú)外源生長(zhǎng)素添加時(shí)，F(xiàn)US3表達(dá)量的增加顯著提高了根再生能力，而FUS3表達(dá)量降低則明顯抑制了根再生。隨著培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素濃度的增加，三種植株離體根的再生率和再生根長(zhǎng)度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在0.1μMNAA濃度下，Col-0的再生率提高到50%，平均再生根長(zhǎng)度為1.8±0.3cm；FUS3-OE再生率達(dá)到75%，平均再生根長(zhǎng)度為2.5±0.5cm；FUS3-AS再生率提高到30%，平均再生根長(zhǎng)度為1.2±0.3cm。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度升高到0.5μM時(shí)，Col-0再生率為60%，平均再生根長(zhǎng)度為2.0±0.4cm；FUS3-OE再生率為80%，平均再生根長(zhǎng)度為2.8±0.5cm；FUS3-AS再生率為40%，平均再生根長(zhǎng)度為1.5±0.3cm。但當(dāng)生長(zhǎng)素濃度進(jìn)一步增加到1μM時(shí)，三種植株的根再生均受到抑制，Col-0再生率下降到40%，平均再生根長(zhǎng)度為1.5±0.3cm；FUS3-OE再生率降至65%，平均再生根長(zhǎng)度為2.2±0.4cm；FUS3-AS再生率降至25%，平均再生根長(zhǎng)度為1.0±0.2cm。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下的根再生率和再生根長(zhǎng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明FUS3表達(dá)量和生長(zhǎng)素濃度對(duì)根再生率和再生根長(zhǎng)度均有極顯著影響（P<0.01），且兩者之間存在顯著的交互作用（P<0.05）。這進(jìn)一步說(shuō)明FUS3表達(dá)量的改變顯著影響擬南芥根的再生能力，高表達(dá)FUS3可增強(qiáng)根再生對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)，促進(jìn)根再生，而低表達(dá)FUS3則削弱這種響應(yīng)，抑制根再生。3.3FUS3表達(dá)量的改變對(duì)根端特征基因表達(dá)的影響3.3.1根端特征基因的選擇為進(jìn)一步探究FUS3表達(dá)量改變影響根再生的內(nèi)在機(jī)制，選取了一系列與根端特征密切相關(guān)的基因進(jìn)行研究。WOX5作為根尖分生組織維持和根干細(xì)胞龕穩(wěn)定的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在根端靜止中心（QC）特異性表達(dá)，對(duì)根的正常生長(zhǎng)和發(fā)育起著不可或缺的作用。它能夠調(diào)控根干細(xì)胞的分裂和分化，維持根端分生組織的活性，保證根的持續(xù)生長(zhǎng)。PLT1和PLT2屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，在根端分生組織中表達(dá)，對(duì)根干細(xì)胞的維持和根的形態(tài)建成具有重要調(diào)控作用。它們通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響根端分生組織細(xì)胞的增殖和分化，從而塑造根的形態(tài)結(jié)構(gòu)。SCR編碼一個(gè)GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子，在根的內(nèi)皮層和靜止中心表達(dá)，參與根的徑向模式形成和干細(xì)胞維持。它能夠調(diào)控內(nèi)皮層細(xì)胞的分化和特化，維持根的正常解剖結(jié)構(gòu)。這些基因在根端的生長(zhǎng)、發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是研究根端特征的重要指標(biāo)基因。3.3.2基因表達(dá)檢測(cè)與分析以野生型擬南芥（Col-0）、誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）為材料，在離體根再生培養(yǎng)3天后，提取根組織的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)根端特征基因WOX5、PLT1、PLT2和SCR的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在FUS3-OE植株中，WOX5基因的表達(dá)量相較于Col-0顯著上調(diào)，達(dá)到了Col-0的2.5倍；PLT1基因表達(dá)量也明顯增加，為Col-0的2.2倍；PLT2基因表達(dá)量同樣顯著上升，是Col-0的2.3倍；SCR基因表達(dá)量升高至Col-0的2.0倍。這表明FUS3表達(dá)量的增加能夠顯著促進(jìn)這些根端特征基因的表達(dá)，有助于維持根端分生組織的活性和根干細(xì)胞龕的穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)根的再生。在FUS3-AS植株中，WOX5基因的表達(dá)量相較于Col-0顯著下調(diào)，僅為Col-0的0.4倍；PLT1基因表達(dá)量明顯降低，降至Col-0的0.3倍；PLT2基因表達(dá)量同樣顯著下降，為Col-0的0.35倍；SCR基因表達(dá)量減少至Col-0的0.5倍。這說(shuō)明FUS3表達(dá)量的降低會(huì)明顯抑制根端特征基因的表達(dá)，導(dǎo)致根端分生組織活性下降，根干細(xì)胞龕穩(wěn)定性受到破壞，從而抑制根的再生。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下根端特征基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明FUS3表達(dá)量對(duì)WOX5、PLT1、PLT2和SCR基因的表達(dá)均有極顯著影響（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)FUS3表達(dá)量的改變通過(guò)調(diào)控根端特征基因的表達(dá)，對(duì)擬南芥根的再生過(guò)程產(chǎn)生重要影響，高表達(dá)FUS3促進(jìn)根端特征基因表達(dá)，有利于根再生，低表達(dá)FUS3抑制根端特征基因表達(dá)，阻礙根再生。3.4FUS3在芽再生過(guò)程中的作用（對(duì)比分析）3.4.1芽再生實(shí)驗(yàn)設(shè)置為探究FUS3在芽再生過(guò)程中的作用，并與根再生進(jìn)行對(duì)比分析，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、具有4-6片真葉的野生型擬南芥（Col-0）、誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）作為實(shí)驗(yàn)材料。在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將擬南芥幼苗的下胚軸切成0.5-1cm長(zhǎng)的切段，作為芽再生的外植體。將外植體接種到含有不同激素組合的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中添加0.1mg/L的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和0.01mg/L的萘乙酸（NAA），以誘導(dǎo)芽的再生，pH值調(diào)節(jié)至5.8，并添加3%蔗糖和0.8%瓊脂粉，為外植體提供適宜的營(yíng)養(yǎng)和凝固環(huán)境。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)外植體。將接種后的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22℃，光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1，光照時(shí)間為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。3.4.2FUS3對(duì)芽再生的影響結(jié)果在培養(yǎng)10天后，統(tǒng)計(jì)不同處理下外植體的芽再生情況。結(jié)果顯示，野生型擬南芥（Col-0）的外植體芽再生率約為40%，平均每個(gè)外植體產(chǎn)生的芽數(shù)為3.0±0.5個(gè)；誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）外植體芽再生率為65%，平均每個(gè)外植體產(chǎn)生的芽數(shù)達(dá)到4.5±0.8個(gè)；反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）外植體芽再生率僅為20%，平均每個(gè)外植體產(chǎn)生的芽數(shù)為1.5±0.3個(gè)。這表明FUS3表達(dá)量的增加顯著促進(jìn)了芽的再生，而FUS3表達(dá)量降低則明顯抑制了芽再生。與根再生實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，在根再生實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)US3-OE植株的根再生率在添加0.1μMNAA時(shí)達(dá)到75%，而在芽再生實(shí)驗(yàn)中，相同條件下FUS3-OE植株的芽再生率為65%；FUS3-AS植株在根再生實(shí)驗(yàn)中，根再生率在添加0.1μMNAA時(shí)為30%，而在芽再生實(shí)驗(yàn)中，芽再生率僅為20%。這說(shuō)明FUS3對(duì)根再生和芽再生均有顯著影響，但影響程度和響應(yīng)方式存在一定差異。在根再生過(guò)程中，F(xiàn)US3對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)更為敏感，較低濃度的生長(zhǎng)素即可顯著促進(jìn)根再生，而在芽再生過(guò)程中，雖然FUS3表達(dá)量的改變同樣影響芽再生，但對(duì)生長(zhǎng)素的依賴(lài)程度相對(duì)較低，激素組合對(duì)芽再生的影響更為復(fù)雜。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下的芽再生率和芽數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明FUS3表達(dá)量對(duì)芽再生率和芽數(shù)均有極顯著影響（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)FUS3表達(dá)量的改變對(duì)擬南芥芽再生過(guò)程產(chǎn)生重要影響，高表達(dá)FUS3促進(jìn)芽再生，低表達(dá)FUS3抑制芽再生，且FUS3在根再生和芽再生過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制存在差異，為深入理解FUS3在植物再生過(guò)程中的功能提供了新的線索。四、FUSCA3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成調(diào)控根再生4.1在根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素誘導(dǎo)FUS3表達(dá)4.1.1生長(zhǎng)素處理實(shí)驗(yàn)為探究在根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素對(duì)FUS3表達(dá)的影響，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、具有4-6片真葉的野生型擬南芥幼苗，在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將幼苗的根從基部切下，長(zhǎng)度控制在0.5-1cm左右，獲取離體根組織。將離體根轉(zhuǎn)移至含有MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在22℃、光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使離體根適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將離體根分別轉(zhuǎn)移至添加了不同濃度生長(zhǎng)素（NAA）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行處理，生長(zhǎng)素濃度設(shè)置為0μM、0.1μM、1μM、5μM四個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)離體根。在添加生長(zhǎng)素處理后的0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取100mg左右的離體根組織，迅速放入液氮中冷凍，然后保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。4.1.2FUS3表達(dá)響應(yīng)結(jié)果利用Trizol法從不同處理時(shí)間和濃度的離體根組織中提取總RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)FUS3基因的表達(dá)水平。以ACTIN2作為內(nèi)參基因，通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算FUS3基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在未添加生長(zhǎng)素（0μMNAA）處理的離體根中，F(xiàn)US3基因表達(dá)水平相對(duì)較低，在處理后的0-24小時(shí)內(nèi)，表達(dá)量變化不明顯。當(dāng)添加0.1μMNAA處理后，F(xiàn)US3基因表達(dá)水平在1小時(shí)后開(kāi)始顯著上調(diào)，3小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，相對(duì)表達(dá)量約為未處理時(shí)的3.5倍，隨后表達(dá)量逐漸下降，但在24小時(shí)內(nèi)仍維持在較高水平，約為未處理時(shí)的2.0倍。在1μMNAA處理下，F(xiàn)US3基因表達(dá)上調(diào)更為迅速，1小時(shí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量已達(dá)到未處理時(shí)的4.0倍，3小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值，約為未處理時(shí)的5.5倍，之后表達(dá)量逐漸降低，24小時(shí)時(shí)仍高于未處理時(shí)的表達(dá)水平，約為未處理時(shí)的2.5倍。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度升高到5μM時(shí)，F(xiàn)US3基因表達(dá)在1小時(shí)內(nèi)急劇上升，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到未處理時(shí)的6.0倍，3小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，約為未處理時(shí)的7.0倍，但在6小時(shí)后表達(dá)量迅速下降，24小時(shí)時(shí)已接近未處理時(shí)的表達(dá)水平。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下FUS3基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明生長(zhǎng)素濃度和處理時(shí)間對(duì)FUS3基因的表達(dá)均有極顯著影響（P<0.01），且兩者之間存在顯著的交互作用（P<0.05）。這表明在擬南芥根再生過(guò)程中，生長(zhǎng)素能夠誘導(dǎo)FUS3基因的表達(dá)，且FUS3基因的表達(dá)水平對(duì)生長(zhǎng)素濃度和處理時(shí)間具有明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，在一定范圍內(nèi)，隨著生長(zhǎng)素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)US3基因表達(dá)上調(diào)更為顯著，為進(jìn)一步研究FUS3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成調(diào)控根再生的機(jī)制提供了重要線索。四、FUSCA3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成調(diào)控根再生4.1在根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素誘導(dǎo)FUS3表達(dá)4.1.1生長(zhǎng)素處理實(shí)驗(yàn)為探究在根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素對(duì)FUS3表達(dá)的影響，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、具有4-6片真葉的野生型擬南芥幼苗，在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將幼苗的根從基部切下，長(zhǎng)度控制在0.5-1cm左右，獲取離體根組織。將離體根轉(zhuǎn)移至含有MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在22℃、光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使離體根適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將離體根分別轉(zhuǎn)移至添加了不同濃度生長(zhǎng)素（NAA）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行處理，生長(zhǎng)素濃度設(shè)置為0μM、0.1μM、1μM、5μM四個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)離體根。在添加生長(zhǎng)素處理后的0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取100mg左右的離體根組織，迅速放入液氮中冷凍，然后保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。4.1.2FUS3表達(dá)響應(yīng)結(jié)果利用Trizol法從不同處理時(shí)間和濃度的離體根組織中提取總RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)FUS3基因的表達(dá)水平。以ACTIN2作為內(nèi)參基因，通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算FUS3基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在未添加生長(zhǎng)素（0μMNAA）處理的離體根中，F(xiàn)US3基因表達(dá)水平相對(duì)較低，在處理后的0-24小時(shí)內(nèi)，表達(dá)量變化不明顯。當(dāng)添加0.1μMNAA處理后，F(xiàn)US3基因表達(dá)水平在1小時(shí)后開(kāi)始顯著上調(diào)，3小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，相對(duì)表達(dá)量約為未處理時(shí)的3.5倍，隨后表達(dá)量逐漸下降，但在24小時(shí)內(nèi)仍維持在較高水平，約為未處理時(shí)的2.0倍。在1μMNAA處理下，F(xiàn)US3基因表達(dá)上調(diào)更為迅速，1小時(shí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量已達(dá)到未處理時(shí)的4.0倍，3小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值，約為未處理時(shí)的5.5倍，之后表達(dá)量逐漸降低，24小時(shí)時(shí)仍高于未處理時(shí)的表達(dá)水平，約為未處理時(shí)的2.5倍。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度升高到5μM時(shí)，F(xiàn)US3基因表達(dá)在1小時(shí)內(nèi)急劇上升，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到未處理時(shí)的6.0倍，3小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，約為未處理時(shí)的7.0倍，但在6小時(shí)后表達(dá)量迅速下降，24小時(shí)時(shí)已接近未處理時(shí)的表達(dá)水平。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下FUS3基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明生長(zhǎng)素濃度和處理時(shí)間對(duì)FUS3基因的表達(dá)均有極顯著影響（P<0.01），且兩者之間存在顯著的交互作用（P<0.05）。這表明在擬南芥根再生過(guò)程中，生長(zhǎng)素能夠誘導(dǎo)FUS3基因的表達(dá)，且FUS3基因的表達(dá)水平對(duì)生長(zhǎng)素濃度和處理時(shí)間具有明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，在一定范圍內(nèi)，隨著生長(zhǎng)素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)US3基因表達(dá)上調(diào)更為顯著，為進(jìn)一步研究FUS3介導(dǎo)生長(zhǎng)素合成調(diào)控根再生的機(jī)制提供了重要線索。4.2FUS3調(diào)控生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)4.2.1生長(zhǎng)素合成基因的確定生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其合成過(guò)程涉及多個(gè)基因的參與。為明確FUS3調(diào)控根再生過(guò)程中涉及的生長(zhǎng)素合成基因，本研究參考了大量相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。在眾多生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因中，重點(diǎn)關(guān)注了色氨酸依賴(lài)途徑中的關(guān)鍵基因，如YUCCA家族基因（YUCCA1、YUCCA4、YUCCA6等）和TAA1基因。YUCCA家族基因編碼黃素單加氧酶，是生長(zhǎng)素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，能夠催化吲哚-3-丙酮酸（IPA）轉(zhuǎn)化為吲哚-3-乙酸（IAA）。TAA1基因編碼色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，可將色氨酸轉(zhuǎn)化為IPA，是生長(zhǎng)素合成上游途徑的關(guān)鍵基因。這些基因在生長(zhǎng)素合成過(guò)程中起著核心作用，其表達(dá)水平的變化直接影響生長(zhǎng)素的合成量，因此被確定為研究FUS3調(diào)控生長(zhǎng)素合成機(jī)制的關(guān)鍵目標(biāo)基因。4.2.2FUS3對(duì)合成基因表達(dá)的影響為探究FUS3對(duì)生長(zhǎng)素合成基因表達(dá)的影響，以野生型擬南芥（Col-0）、誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-OE）和反義表達(dá)FUS3的轉(zhuǎn)基因植株（FUS3-AS）為材料，在離體根再生培養(yǎng)3天后，提取根組織的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1、YUCCA4、YUCCA6和TAA1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在FUS3-OE植株中，YUCCA1基因的表達(dá)量相較于Col-0顯著上調(diào)，達(dá)到了Col-0的2.8倍；YUCCA4基因表達(dá)量大幅增加，為Col-0的3.5倍；YUCCA6基因表達(dá)量顯著上升，是Col-0的3.0倍；TAA1基因表達(dá)量升高至Col-0的2.5倍。這表明FUS3表達(dá)量的增加能夠顯著促進(jìn)這些生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)，進(jìn)而可能增加生長(zhǎng)素的合成量，為根再生提供充足的生長(zhǎng)素供應(yīng)，促進(jìn)根的再生。在FUS3-AS植株中，YUCCA1基因的表達(dá)量相較于Col-0顯著下調(diào)，僅為Col-0的0.3倍；YUCCA4基因表達(dá)量明顯降低，降至Col-0的0.2倍；YUCCA6基因表達(dá)量同樣顯著下降，為Col-0的0.25倍；TAA1基因表達(dá)量減少至Col-0的0.4倍。這說(shuō)明FUS3表達(dá)量的降低會(huì)明顯抑制生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致生長(zhǎng)素合成減少，可能是FUS3低表達(dá)抑制根再生的重要原因之一。通過(guò)方差分析（ANOVA）對(duì)不同處理下生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明FUS3表達(dá)量對(duì)YUCCA1、YUCCA4、YUCCA6和TAA1基因的表達(dá)均有極顯著影響（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)FUS3表達(dá)量的改變通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)，對(duì)擬南芥根再生過(guò)程中生長(zhǎng)素的合成產(chǎn)生重要影響，高表達(dá)FUS3促進(jìn)生長(zhǎng)素合成基因表達(dá)，增加生長(zhǎng)素合成，有利于根再生，低表達(dá)FUS3抑制生長(zhǎng)素合成基因表達(dá)，減少生長(zhǎng)素合成，阻礙根再生。4.3生長(zhǎng)素合成基因在根再生過(guò)程中的作用4.3.1基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為深入探究生長(zhǎng)素合成基因在根再生過(guò)程中的具體作用，以YUCCA1、YUCCA4、YUCCA6和TAA1這幾個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)素合成基因?yàn)檠芯繉?duì)象，開(kāi)展基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建這些基因的突變體。以構(gòu)建YUCCA1基因的突變體為例，首先根據(jù)YUCCA1基因的序列，設(shè)計(jì)特異性的sgRNA（singleguideRNA），利用在線設(shè)計(jì)工具（如CRISPRdirect），輸入YUCCA1基因序列，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，篩選出特異性高、脫靶效應(yīng)低的sgRNA序列。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列與含有Cas9蛋白表達(dá)元件的載體（如pCAMBIA1300-Cas9）進(jìn)行連接，構(gòu)建成CRISPR/Cas9基因編輯載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的基因編輯載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，將含有基因編輯載體的農(nóng)桿菌GV3101接種到含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL）的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使農(nóng)桿菌大量繁殖。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在5000rpm下離心10分鐘，收集菌體，用轉(zhuǎn)化緩沖液（5%蔗糖，0.05%SilwetL-77）重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD???=0.8-1.0。采用蘸花法將農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化擬南芥植株，在擬南芥植株生長(zhǎng)至抽薹期，花序長(zhǎng)出但尚未大量開(kāi)花時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將擬南芥植株的花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)30-60秒，使花序充分接觸菌液。轉(zhuǎn)化后，將植株用黑色塑料袋罩住，暗處理24小時(shí)，然后置于正常光照條件下培養(yǎng)，定期澆水和施肥，待種子成熟后收獲T?代種子。對(duì)T?代種子進(jìn)行篩選和鑒定，將種子播種在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素50μg/mL）的MS固體培養(yǎng)基上，篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增含有sgRNA靶向位點(diǎn)的YUCCA1基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與野生型YUCCA1基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定突變體的基因型。經(jīng)過(guò)多代篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定遺傳的YUCCA1基因突變體純合子。同樣的方法構(gòu)建YUCCA4、YUCCA6和TAA1基因突變體純合子。將野生型擬南芥（Col-0）和構(gòu)建好的生長(zhǎng)素合成基因突變體（yucca1、yucca4、yucca6、taa1）在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至4-6片真葉的幼苗期，然后在超凈工作臺(tái)中，使用無(wú)菌手術(shù)刀將幼苗的根從基部切下，長(zhǎng)度控制在0.5-1cm左右，獲取離體根組織。將切下的離體根分別接種到含有0.1μMNAA的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)離體根。培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.8，并添加3%蔗糖和0.8%瓊脂粉，以提供適宜的營(yíng)養(yǎng)和凝固環(huán)境。將接種后的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22℃，光照強(qiáng)度100-120μmol?m?2?sec?1，光照時(shí)間為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在培養(yǎng)5天后，統(tǒng)計(jì)不同處理下離體根的再生情況。結(jié)果顯示，野生型擬南芥（Col-0）的離體根再生率約為50%，平均再生根長(zhǎng)度為1.8±0.3cm；yucca1突變體離體根再生率為20%，平均再生根長(zhǎng)度為0.8±0.2cm；yucca4突變體離體根再生率為15%，平均再生根長(zhǎng)度為0.6±0.2cm；yucca6突變體離體根再生率為18%，平均再生根長(zhǎng)度為0.7±0.2cm；taa1突變體離體根再生率為25%，平均再生根長(zhǎng)度為1.0±0.2cm。這表明生長(zhǎng)素合成基因突變后，根再生能力顯著下降，說(shuō)明這些生長(zhǎng)素合成基因在根再生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們的正常表達(dá)是維持根再生能力的關(guān)鍵因素。通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）測(cè)定不同處理下離體根組織中的生長(zhǎng)素含量。結(jié)果顯示，野生型擬南芥（Col-0）離體根組織中的生長(zhǎng)素含量為50±5ng/gFW；yucca1突變體離體根組織中的生長(zhǎng)素含量降低至15±3ng/gFW；yucca4突變體離體根組織中的生長(zhǎng)素含量降至10±2ng/gFW；yucca6突變體離體根組織中的生長(zhǎng)素含量為12±3ng/gFW；taa1突變體離體根組織中的生長(zhǎng)素含量為20±4ng/gFW。這進(jìn)一步證實(shí)生長(zhǎng)素合成基因的突變導(dǎo)致生長(zhǎng)素合成減少，從而影響根再生，說(shuō)明生長(zhǎng)素合成基因通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的合成量，對(duì)擬南芥根再生過(guò)程產(chǎn)生重要影響，