A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義瘢痕是人體創(chuàng)傷修復(fù)過程中必然產(chǎn)生的一種結(jié)果，其形成機(jī)制涉及復(fù)雜的細(xì)胞和分子生物學(xué)過程。當(dāng)皮膚受到深度損傷，如燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷、嚴(yán)重切割傷等，超過真皮層的修復(fù)能力時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)瘢痕形成程序。在這個(gè)過程中，成纖維細(xì)胞被大量激活，它們遷移到傷口部位，增殖并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，主要是膠原蛋白。正常情況下，創(chuàng)傷愈合后瘢痕會(huì)逐漸成熟、軟化，顏色變淺，對(duì)外觀和功能的影響較小。然而，在某些個(gè)體中，由于遺傳、創(chuàng)傷部位、創(chuàng)傷深度、炎癥反應(yīng)等多種因素的影響，瘢痕組織會(huì)過度增生，形成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出于皮膚表面，顏色鮮紅，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面高低不平，不僅嚴(yán)重影響皮膚的美觀，給患者帶來較大的心理壓力，尤其是發(fā)生在面部、頸部、手部等暴露部位的增生性瘢痕，會(huì)對(duì)患者的社交、職業(yè)選擇等方面產(chǎn)生負(fù)面影響，降低患者的生活質(zhì)量。此外，增生性瘢痕還會(huì)引發(fā)局部不適癥狀，如瘙癢、疼痛等，特別是在天氣炎熱、出汗多或摩擦?xí)r，癥狀可能會(huì)加重，嚴(yán)重干擾患者的日常生活。若增生性瘢痕發(fā)生在關(guān)節(jié)部位，由于瘢痕組織缺乏彈性，會(huì)限制關(guān)節(jié)的正常活動(dòng)，隨著時(shí)間的推移，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)攣縮、畸形，進(jìn)一步影響肢體功能，甚至造成肌肉萎縮、關(guān)節(jié)僵硬等嚴(yán)重后果，給患者的身體和心理帶來雙重折磨。目前，臨床上針對(duì)增生性瘢痕的治療方法眾多，包括手術(shù)切除、激光治療、放射治療、藥物治療、壓力治療等。手術(shù)切除適用于較大或嚴(yán)重影響功能的瘢痕，但存在術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，且手術(shù)本身會(huì)再次造成創(chuàng)傷，可能形成新的瘢痕。激光治療利用激光的熱效應(yīng)，對(duì)瘢痕組織進(jìn)行氣化、磨削，改善瘢痕外觀，但對(duì)于較厚的增生性瘢痕效果有限，且可能引起色素沉著、皮膚灼傷等并發(fā)癥。放射治療通過放射線抑制瘢痕組織中細(xì)胞的增殖，但其副作用較大，可能導(dǎo)致皮膚放射性損傷、致癌等風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用受到一定限制。藥物治療常用的藥物有糖皮質(zhì)激素類藥物、氟尿嘧啶等，糖皮質(zhì)激素通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖來減輕瘢痕增生，但長(zhǎng)期使用可能會(huì)引起皮膚萎縮、色素沉著、內(nèi)分泌紊亂等不良反應(yīng)；氟尿嘧啶作為一種抗代謝藥物，可抑制細(xì)胞DNA合成，從而抑制瘢痕形成，但也可能出現(xiàn)局部疼痛、潰瘍、過敏等副作用。壓力治療則是通過佩戴彈力繃帶、壓力衣等，對(duì)瘢痕部位施加持續(xù)的壓力，減少瘢痕的血液供應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，但需要長(zhǎng)期堅(jiān)持，患者依從性較差，且對(duì)于已經(jīng)形成的較嚴(yán)重的增生性瘢痕效果欠佳。近年來，A型肉毒毒素在增生性瘢痕治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。A型肉毒毒素是一種由肉毒梭狀芽胞桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，臨床常用其來干擾周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢突觸前膜釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛性麻痹，廣泛應(yīng)用于美容整形、神經(jīng)內(nèi)科等領(lǐng)域。在增生性瘢痕治療中，A型肉毒毒素展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它可以降低創(chuàng)面周圍的張力，減少因張力刺激導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞增殖信號(hào)，從而抑制瘢痕組織里成纖維細(xì)胞的增生。相關(guān)研究表明，A型肉毒毒素能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，減少膠原蛋白的合成和分泌，使瘢痕組織變軟、變平。此外，A型肉毒毒素還可以通過減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，降低瘢痕的疼痛和瘙癢感，顯著改善患者的癥狀。與傳統(tǒng)治療方法相比，A型肉毒毒素治療具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、不良反應(yīng)相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)，為增生性瘢痕的治療提供了新的思路和方法。本研究通過深入探究A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，旨在進(jìn)一步揭示其治療增生性瘢痕的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望推動(dòng)A型肉毒毒素在增生性瘢痕治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為廣大增生性瘢痕患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量的改善，同時(shí)也有助于豐富瘢痕治療的醫(yī)學(xué)理論體系，促進(jìn)相關(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2研究目的本研究旨在深入探究A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的抑制作用及其潛在機(jī)制。具體而言，通過一系列體外實(shí)驗(yàn)，明確A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、膠原蛋白合成與分泌等生物學(xué)行為的影響，從細(xì)胞和分子層面揭示其作用機(jī)制。同時(shí)，通過對(duì)比不同濃度A型肉毒毒素的作用效果，確定其最佳作用濃度，為臨床治療增生性瘢痕提供精準(zhǔn)的用藥參考。此外，本研究還期望通過對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的研究，為開發(fā)基于A型肉毒毒素的新型治療策略提供理論基礎(chǔ)，推動(dòng)增生性瘢痕治療領(lǐng)域的發(fā)展，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，A型肉毒毒素用于增生性瘢痕治療的研究開展較早。2002年，有學(xué)者首次提出將A型肉毒毒素應(yīng)用于瘢痕治療的設(shè)想，隨后相關(guān)研究逐漸增多。多項(xiàng)臨床研究表明，A型肉毒毒素局部注射能夠有效改善增生性瘢痕的外觀和質(zhì)地，減小瘢痕寬度，降低瘢痕的硬度和厚度。例如，一項(xiàng)針對(duì)面部手術(shù)切口瘢痕的研究，將A型肉毒毒素注射于術(shù)后切口周圍，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組瘢痕在溫哥華瘢痕量表評(píng)分上有顯著改善，瘢痕更加平坦、柔軟，顏色也更接近正常皮膚。在機(jī)制研究方面，國外學(xué)者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。其作用機(jī)制可能與阻斷神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿的釋放，降低局部肌肉張力，從而減少對(duì)成纖維細(xì)胞的機(jī)械刺激有關(guān)；同時(shí)，也可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制膠原蛋白的合成和分泌。此外，還有研究關(guān)注到A型肉毒毒素對(duì)瘢痕內(nèi)血管生成的影響，發(fā)現(xiàn)其可以減少瘢痕組織中的血管數(shù)量，降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，從而減少瘢痕的血液供應(yīng)，抑制瘢痕增生。國內(nèi)對(duì)于A型肉毒毒素治療增生性瘢痕的研究也取得了不少成果。臨床實(shí)踐中，國內(nèi)醫(yī)生廣泛將A型肉毒毒素應(yīng)用于各種類型的增生性瘢痕治療，包括燒傷后瘢痕、創(chuàng)傷后瘢痕、手術(shù)后瘢痕等，并積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。在聯(lián)合治療方面，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了諸多探索。例如，將A型肉毒毒素與激光治療相結(jié)合，先用A型肉毒毒素降低瘢痕的張力和厚度，再利用激光改善瘢痕的色澤和表面平整度，取得了比單一治療更好的效果。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，國內(nèi)學(xué)者深入探究了A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素能夠抑制成纖維細(xì)胞中與增殖、分化相關(guān)基因的表達(dá)，如cyclinD1、α-SMA等，從而抑制細(xì)胞的增殖和向肌成纖維細(xì)胞的分化。同時(shí)，通過調(diào)節(jié)P38MAPK等信號(hào)通路，影響細(xì)胞的凋亡和膠原蛋白的合成代謝。然而，當(dāng)前關(guān)于A型肉毒毒素治療增生性瘢痕的研究仍存在一些不足之處。在臨床研究方面，雖然多數(shù)研究表明A型肉毒毒素治療有效，但不同研究之間的治療方案（如注射劑量、注射頻率、注射時(shí)間點(diǎn)等）差異較大，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，這給臨床推廣和應(yīng)用帶來了一定困難。此外，對(duì)于治療后的長(zhǎng)期效果和安全性評(píng)估還不夠充分，部分研究隨訪時(shí)間較短，難以全面了解其遠(yuǎn)期療效和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。在機(jī)制研究方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些相關(guān)的信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)，但具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未完全明確，對(duì)于不同個(gè)體對(duì)A型肉毒毒素治療反應(yīng)差異的原因也缺乏深入研究。此外，目前的研究主要集中在細(xì)胞和動(dòng)物水平，對(duì)于人體的作用機(jī)制和效果驗(yàn)證還需要更多的臨床研究來支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1增生性瘢痕概述2.1.1增生性瘢痕的形成機(jī)制增生性瘢痕的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，與正常的傷口愈合過程密切相關(guān)，但又存在顯著差異。正常傷口愈合主要經(jīng)歷三個(gè)階段：炎癥期、增殖期和重塑期。當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，首先進(jìn)入炎癥期，血小板迅速聚集在傷口處，形成血凝塊，起到止血作用。同時(shí)，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到傷口部位，釋放多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，這些細(xì)胞因子一方面引發(fā)炎癥反應(yīng)，清除傷口處的細(xì)菌和壞死組織，另一方面激活成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞，為后續(xù)的修復(fù)過程做準(zhǔn)備。隨著炎癥反應(yīng)的逐漸消退，傷口進(jìn)入增殖期。此時(shí)，成纖維細(xì)胞大量增殖并遷移到傷口部位，它們合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，主要包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等。其中，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在瘢痕形成過程中起著關(guān)鍵作用。成纖維細(xì)胞合成的前膠原蛋白分子在細(xì)胞外被酶解，形成具有特定結(jié)構(gòu)的膠原纖維，這些膠原纖維相互交織，逐漸填充傷口缺損部位，形成肉芽組織。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成新生血管，為傷口愈合提供營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)組織修復(fù)。在傷口愈合的重塑期，成纖維細(xì)胞繼續(xù)合成和降解膠原蛋白，使瘢痕組織中的膠原纖維逐漸排列整齊，瘢痕的硬度和彈性逐漸改善，顏色也逐漸變淺。正常情況下，這三個(gè)階段相互協(xié)調(diào)，有序進(jìn)行，最終形成的瘢痕組織與周圍正常組織基本相似，對(duì)皮膚的外觀和功能影響較小。然而，在某些因素的影響下，傷口愈合過程可能會(huì)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。其中，成纖維細(xì)胞的異常增殖和功能失調(diào)是增生性瘢痕形成的關(guān)鍵因素之一。在增生性瘢痕組織中，成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，且處于持續(xù)的增殖狀態(tài)，其增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常傷口愈合時(shí)的水平。同時(shí)，這些成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白的能力也顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，瘢痕組織不斷增生。研究表明，多種細(xì)胞因子參與了對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和功能的調(diào)控。例如，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是一種在瘢痕形成過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化和膠原蛋白的合成。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)瘢痕形成。此外，血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等細(xì)胞因子也可以通過不同的信號(hào)途徑刺激成纖維細(xì)胞的增殖和功能活動(dòng)。除了成纖維細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用外，細(xì)胞外基質(zhì)的代謝失衡也是增生性瘢痕形成的重要原因。正常情況下，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在增生性瘢痕組織中，由于成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分過多，同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等降解酶的活性降低或其抑制劑的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。這種代謝失衡使得瘢痕組織不斷增厚、變硬，形成增生性瘢痕。此外，傷口的張力、感染、局部血液循環(huán)等因素也會(huì)影響增生性瘢痕的形成。傷口張力過大時(shí)，會(huì)刺激成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，增加瘢痕增生的風(fēng)險(xiǎn)。感染會(huì)延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)的時(shí)間，導(dǎo)致更多的細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)瘢痕形成。局部血液循環(huán)不良會(huì)影響傷口的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的清除，不利于傷口的正常愈合，也容易導(dǎo)致瘢痕增生。2.1.2增生性瘢痕的臨床表現(xiàn)與危害增生性瘢痕具有典型的臨床表現(xiàn)，在外觀上，增生性瘢痕突出于皮膚表面，呈紅色或紫紅色，表面高低不平，質(zhì)地堅(jiān)硬，與周圍正常皮膚界限清晰。其形狀多樣，可呈條索狀、斑塊狀、蟹足狀等。瘢痕的大小和范圍因創(chuàng)傷的程度、部位以及個(gè)體差異而異，小的增生性瘢痕可能僅局限于傷口周圍，而大的瘢痕則可能累及大片皮膚區(qū)域。在癥狀方面，增生性瘢痕常伴有瘙癢、疼痛等不適感覺。瘙癢癥狀較為常見，尤其是在瘢痕形成的早期和恢復(fù)過程中，患者往往會(huì)感到難以忍受的瘙癢，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。疼痛一般表現(xiàn)為刺痛、灼痛或脹痛，在瘢痕受到摩擦、壓迫或溫度變化時(shí)，疼痛癥狀可能會(huì)加重。此外，部分患者還可能出現(xiàn)瘢痕局部皮膚感覺異常，如麻木、刺痛等。增生性瘢痕對(duì)患者的生理和心理均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響。從生理角度來看，若增生性瘢痕發(fā)生在關(guān)節(jié)部位，由于瘢痕組織缺乏彈性，會(huì)限制關(guān)節(jié)的正?；顒?dòng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)度減小。隨著時(shí)間的推移，可能會(huì)引起關(guān)節(jié)攣縮、畸形，進(jìn)一步影響肢體的功能。例如，手部關(guān)節(jié)處的增生性瘢痕可導(dǎo)致手指屈伸障礙，影響手部的抓握、捏取等精細(xì)動(dòng)作；膝關(guān)節(jié)處的瘢痕則會(huì)影響行走和下蹲等活動(dòng)。長(zhǎng)期的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限還可能導(dǎo)致肌肉萎縮、關(guān)節(jié)僵硬等并發(fā)癥，給患者的身體帶來更大的痛苦。如果增生性瘢痕位于眼部周圍，可能會(huì)影響眼瞼的正常開合，導(dǎo)致眼瞼外翻、閉合不全等問題，進(jìn)而引發(fā)眼部感染、角膜損傷等嚴(yán)重后果，威脅視力健康。位于口唇周圍的瘢痕可能會(huì)影響口唇的正常運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致進(jìn)食、語言功能障礙。從心理角度來看，增生性瘢痕對(duì)患者的心理健康造成的影響同樣不容忽視。由于增生性瘢痕嚴(yán)重影響皮膚的美觀，尤其是發(fā)生在面部、頸部、手部等暴露部位的瘢痕，會(huì)使患者在社交場(chǎng)合中產(chǎn)生自卑、焦慮、抑郁等負(fù)面情緒。患者可能會(huì)因?yàn)轳：鄱桓遗c人交往，避免參加社交活動(dòng)，甚至對(duì)自己的外貌產(chǎn)生厭惡感，嚴(yán)重影響自信心和自尊心。長(zhǎng)期的心理壓力還可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)睡眠障礙、食欲不振等問題，進(jìn)一步影響身體健康。此外，一些患者可能會(huì)因?yàn)閷?duì)瘢痕治療效果的擔(dān)憂和期望，而承受巨大的心理負(fù)擔(dān)，影響生活質(zhì)量和心理健康。2.2成纖維細(xì)胞在增生性瘢痕中的作用2.2.1成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性成纖維細(xì)胞作為結(jié)締組織中最為常見的細(xì)胞類型，起源于胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞。其形態(tài)表現(xiàn)出多樣性，在體外培養(yǎng)環(huán)境下，常見的形態(tài)有梭形、多角形以及扁平星形等。這些形態(tài)并非固定不變，會(huì)依據(jù)細(xì)胞自身的功能狀態(tài)以及所處的附著物理性狀發(fā)生動(dòng)態(tài)改變。例如，當(dāng)細(xì)胞處于活躍的增殖和合成狀態(tài)時(shí)，其形態(tài)可能更為飽滿，胞體較大；而當(dāng)細(xì)胞功能活動(dòng)減弱，進(jìn)入相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)逐漸變得細(xì)長(zhǎng)，胞體縮小。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面，成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)弱嗜堿性。通過電鏡觀察，可以清晰地看到其胞質(zhì)中存在豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體以及發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為蛋白質(zhì)的合成提供了場(chǎng)所，游離核糖體參與蛋白質(zhì)的合成過程，而發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體則在蛋白質(zhì)的加工、修飾和運(yùn)輸方面發(fā)揮著重要作用。這些豐富的細(xì)胞器充分表明成纖維細(xì)胞具備強(qiáng)大的合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。在細(xì)胞代謝過程中，成纖維細(xì)胞能夠攝取所需的氨基酸，如脯氨酸和賴氨酸等，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體上進(jìn)行前α多肽鏈的合成。隨后，多肽鏈被輸送至高爾基復(fù)合體，在這里經(jīng)過進(jìn)一步的加工和組裝，形成前膠原分子。前膠原分子通過分泌囊泡被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，并通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外。在細(xì)胞外，前膠原分子在前膠原肽酶的催化作用下，去除尾段，轉(zhuǎn)變?yōu)樵z原分子。眾多原膠原分子按照特定的方式排列組合，最終形成具有周期性橫紋的膠原原纖維，進(jìn)而相互結(jié)合形成膠原纖維。根據(jù)成纖維細(xì)胞的功能活動(dòng)狀態(tài)，可以將其分為成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞兩種類型。其中，成纖維細(xì)胞的功能活動(dòng)較為旺盛，細(xì)胞和細(xì)胞核的體積相對(duì)較大，輪廓清晰可辨，核仁大而明顯，這表明其基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成活動(dòng)頻繁。細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)明顯的弱嗜堿性，進(jìn)一步印證了其活躍的蛋白質(zhì)合成和分泌功能。而處于成熟期或靜止?fàn)顟B(tài)的纖維細(xì)胞，胞體顯著變小，呈長(zhǎng)梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體的發(fā)達(dá)程度明顯降低。此時(shí)，纖維細(xì)胞的功能活動(dòng)相對(duì)不活躍，細(xì)胞輪廓變得模糊，核小且著色深，核仁不明顯，細(xì)胞質(zhì)的含量也較少。不過，當(dāng)受到外傷等外界因素刺激時(shí)，部分纖維細(xì)胞能夠重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細(xì)胞，恢復(fù)其功能活動(dòng)，積極參與組織損傷后的修復(fù)過程。這一轉(zhuǎn)變過程涉及到細(xì)胞內(nèi)一系列基因表達(dá)和信號(hào)通路的調(diào)控，使得纖維細(xì)胞重新獲得增殖和合成蛋白質(zhì)的能力，為組織修復(fù)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在組織修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞發(fā)揮著不可或缺的重要作用。以皮膚傷口愈合為例，當(dāng)皮膚受到創(chuàng)傷后，成纖維細(xì)胞會(huì)迅速做出反應(yīng)。在傷口愈合的早期階段，成纖維細(xì)胞通過有絲分裂進(jìn)行大量增殖，細(xì)胞數(shù)量急劇增加。從受傷后的4-5天或6天開始，成纖維細(xì)胞逐漸進(jìn)入合成和分泌階段，大量合成和分泌膠原纖維和基質(zhì)成分。這些膠原纖維和基質(zhì)成分與新生的毛細(xì)血管等共同構(gòu)成肉芽組織。肉芽組織具有填充傷口組織缺損的作用，為表皮細(xì)胞的遷移和覆蓋創(chuàng)造了條件。在傷口愈合的后期，成纖維細(xì)胞還會(huì)分泌膠原酶，參與修復(fù)后組織的改建過程。膠原酶能夠降解多余的膠原纖維，調(diào)整瘢痕組織的結(jié)構(gòu)和成分，使其逐漸成熟和穩(wěn)定。此外，在某些病理?xiàng)l件下，以成纖維細(xì)胞為主要細(xì)胞成分的肉芽組織或增生組織塊可能會(huì)在非骨組織內(nèi)發(fā)生鈣化，進(jìn)而引發(fā)異位骨化現(xiàn)象。雖然目前對(duì)于異位骨化的具體參與細(xì)胞及其機(jī)制尚未完全明確，但研究表明未分化間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等都有可能參與這一復(fù)雜的過程。2.2.2成纖維細(xì)胞與瘢痕形成的關(guān)系在瘢痕形成的過程中，成纖維細(xì)胞扮演著核心角色，其一系列活動(dòng)直接推動(dòng)了瘢痕的形成與發(fā)展。在創(chuàng)傷發(fā)生后，機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制被啟動(dòng)，成纖維細(xì)胞首先表現(xiàn)出的是增殖活動(dòng)的顯著增強(qiáng)。此時(shí)，傷口部位的微環(huán)境發(fā)生了劇烈變化，炎癥細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等。這些細(xì)胞因子如同信號(hào)分子，激活了成纖維細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路，促使成纖維細(xì)胞從相對(duì)靜止的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S的增殖狀態(tài)。在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的作用下，成纖維細(xì)胞不斷進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞數(shù)量迅速增多。研究表明，在增生性瘢痕組織中，成纖維細(xì)胞的增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常傷口愈合時(shí)的水平，這種過度增殖使得瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的數(shù)量大量積聚，為后續(xù)瘢痕的形成奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。隨著增殖活動(dòng)的進(jìn)行，成纖維細(xì)胞開始向肌成纖維細(xì)胞分化。這一分化過程同樣受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)控。在TGF-β等細(xì)胞因子的刺激下，成纖維細(xì)胞逐漸表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），從而轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，它不僅具備收縮能力，還能夠合成和分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)成分。其收縮特性在傷口愈合過程中有助于傷口的收縮和閉合，但在增生性瘢痕形成過程中，過度的收縮可能導(dǎo)致瘢痕組織的攣縮，影響皮膚的正常功能和外觀。同時(shí)，肌成纖維細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)了瘢痕組織的形成和發(fā)展。合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)是成纖維細(xì)胞促進(jìn)瘢痕形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等成分組成，其中膠原蛋白是最為主要的成分。成纖維細(xì)胞在合成膠原蛋白時(shí)，首先在細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成前膠原蛋白分子。前膠原蛋白分子經(jīng)過一系列的加工和修飾后，被分泌到細(xì)胞外。在細(xì)胞外，前膠原蛋白分子在相關(guān)酶的作用下，去除部分肽段，形成具有特定結(jié)構(gòu)的膠原纖維。這些膠原纖維相互交織，形成了瘢痕組織的基本框架。在增生性瘢痕中，成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的能力顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致膠原纖維大量沉積。研究發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量明顯高于正常皮膚組織，且Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白的比例發(fā)生改變。這種異常的膠原合成和沉積使得瘢痕組織的硬度增加，彈性降低，外觀上表現(xiàn)為突出于皮膚表面、質(zhì)地堅(jiān)硬的瘢痕。除了膠原蛋白，成纖維細(xì)胞還合成和分泌其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，如彈性蛋白和纖連蛋白等。彈性蛋白賦予組織彈性和回縮能力，而在增生性瘢痕中，彈性蛋白的合成和分布異常，導(dǎo)致瘢痕組織缺乏彈性。纖連蛋白則在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮重要作用，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖。在瘢痕形成過程中，纖連蛋白的表達(dá)增加，進(jìn)一步促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的活動(dòng)，加速了瘢痕的形成。成纖維細(xì)胞的凋亡失衡也是瘢痕形成的重要因素。在正常的傷口愈合過程中，成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)傷口愈合完成后，多余的成纖維細(xì)胞會(huì)通過凋亡的方式被清除，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在增生性瘢痕組織中，成纖維細(xì)胞的凋亡受到抑制。研究表明，多種抗凋亡因子的表達(dá)增加，如Bcl-2等，同時(shí)促凋亡因子的表達(dá)減少，使得成纖維細(xì)胞難以發(fā)生凋亡。這種凋亡失衡導(dǎo)致成纖維細(xì)胞在瘢痕組織中持續(xù)存在并不斷增殖，進(jìn)一步加劇了瘢痕的增生。2.3A型肉毒毒素的特性與作用機(jī)制2.3.1A型肉毒毒素的結(jié)構(gòu)與特性A型肉毒毒素是一種由肉毒梭狀芽胞桿菌產(chǎn)生的大分子蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素，其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特且復(fù)雜。完整的A型肉毒毒素分子由一條重鏈（H鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為100kD）和一條輕鏈（L鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為50kD）通過一個(gè)二硫鍵緊密連接而成，整體相對(duì)分子質(zhì)量約為150kD。重鏈在毒素與神經(jīng)細(xì)胞的識(shí)別、結(jié)合以及內(nèi)化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞表面的受體，使毒素分子得以進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部。輕鏈則是毒素發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵部位，它屬于Zn2?依賴的蛋白水解酶家族，具有蛋白水解酶活性，能夠特異性地作用于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的特定底物，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。從穩(wěn)定性方面來看，A型肉毒毒素在合適的保存條件下具有較好的穩(wěn)定性。一般來說，其凍干粉制劑在低溫（2-8℃）環(huán)境中能夠長(zhǎng)時(shí)間保存，活性損失較小。這使得其在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中相對(duì)較為方便，有利于臨床的廣泛應(yīng)用。然而，當(dāng)A型肉毒毒素處于溶液狀態(tài)時(shí)，其穩(wěn)定性會(huì)受到多種因素的影響，如溫度、pH值、保存時(shí)間等。高溫和極端pH值環(huán)境會(huì)使毒素分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其活性降低甚至喪失。因此，在臨床使用時(shí)，通常需要現(xiàn)配現(xiàn)用，以確保其有效性。A型肉毒毒素具有極強(qiáng)的毒力，是目前已知毒性最強(qiáng)的生物毒素之一。其毒力主要體現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)肌肉接頭的作用上，極微量的毒素即可導(dǎo)致肌肉松弛性麻痹。據(jù)研究，人的致死劑量約為0.1-1.0μg，這意味著即使是非常少量的毒素進(jìn)入人體，也可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的中毒癥狀，甚至危及生命。然而，在臨床應(yīng)用中，通過嚴(yán)格控制劑量和注射部位，A型肉毒毒素能夠被安全有效地用于治療多種疾病，如眼瞼痙攣、面肌痙攣、痙攣性斜頸等肌肉痙攣性疾病，以及美容整形領(lǐng)域的除皺、瘦臉等。同時(shí)，在增生性瘢痕治療方面，適量的A型肉毒毒素也展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。2.3.2A型肉毒毒素的作用機(jī)制A型肉毒毒素的主要作用機(jī)制是抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)至神經(jīng)末梢時(shí)，神經(jīng)末梢會(huì)釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿與肌肉細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，引發(fā)肌肉收縮。而A型肉毒毒素能夠特異性地作用于神經(jīng)末梢，其重鏈?zhǔn)紫扰c神經(jīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然后通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后，輕鏈在Zn2?的作用下被激活，發(fā)揮其蛋白水解酶活性，特異性地水解突觸前膜上的SNAP-25蛋白（突觸體相關(guān)蛋白-25）。SNAP-25蛋白是參與細(xì)胞內(nèi)吞、胞吐功能的SNARE蛋白家族的重要成員，它在乙酰膽堿的釋放過程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)SNAP-25蛋白被水解后，含乙酰膽堿的小泡不能正常結(jié)合到突觸前膜的胞漿膜，從而無法釋放乙酰膽堿。這樣一來，神經(jīng)沖動(dòng)就不能有效地刺激所支配的肌肉收縮，導(dǎo)致肌肉松弛性麻痹。需要注意的是，A型肉毒毒素的這種作用是暫時(shí)的、可逆的。隨著時(shí)間的推移，肉毒毒素在神經(jīng)末梢內(nèi)會(huì)逐漸降解、失活，同時(shí)神經(jīng)末梢會(huì)發(fā)生新軸突發(fā)芽再生，原來的神經(jīng)肌肉接頭重新恢復(fù)活性，肉毒毒素的作用也就逐漸消失。在瘢痕治療中，A型肉毒毒素的作用途徑主要通過以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。首先，降低創(chuàng)面周圍的張力。由于A型肉毒毒素能夠使肌肉松弛，減少肌肉的收縮力，從而降低了創(chuàng)面周圍的張力。研究表明，創(chuàng)面張力是影響瘢痕形成的重要因素之一，過高的張力會(huì)刺激成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，增加瘢痕增生的風(fēng)險(xiǎn)。通過降低創(chuàng)面周圍的張力，A型肉毒毒素可以減少對(duì)成纖維細(xì)胞的機(jī)械刺激，抑制其增殖和膠原蛋白的合成，從而起到抑制瘢痕增生的作用。其次，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)。細(xì)胞因子在瘢痕形成過程中起著重要的調(diào)控作用，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等。A型肉毒毒素可以通過影響神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素能夠降低瘢痕組織中TGF-β的表達(dá)水平，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，從而減輕瘢痕增生。此外，A型肉毒毒素還可能通過影響成纖維細(xì)胞的凋亡和遷移等生物學(xué)行為，進(jìn)一步抑制瘢痕的形成和發(fā)展。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1標(biāo)本來源增生性瘢痕組織標(biāo)本取自[醫(yī)院名稱]整形燒傷科行瘢痕切除手術(shù)的患者。共收集[X]例患者的瘢痕組織，患者年齡范圍在[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲，其中男性[男性人數(shù)]例，女性[女性人數(shù)]例。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：患者瘢痕形成時(shí)間在[最短時(shí)間]-[最長(zhǎng)時(shí)間]之間，經(jīng)臨床確診為增生性瘢痕；瘢痕部位包括但不限于四肢、軀干、頭面部等；患者在手術(shù)前未接受過局部或全身的抗瘢痕治療，如藥物注射、激光治療、放射治療等；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。在手術(shù)過程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生使用無菌手術(shù)器械，在切除瘢痕組織時(shí)，切取大小約為1cm×1cm×0.5cm的瘢痕組織塊。所取組織塊立即放入含有預(yù)冷的、添加了雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液的無菌離心管中。迅速將裝有標(biāo)本的離心管置于冰盒中，在30分鐘內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。在實(shí)驗(yàn)室中，首先將標(biāo)本置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用PBS緩沖液沖洗3次，以去除標(biāo)本表面的血液、組織液等雜質(zhì)。隨后，使用眼科剪仔細(xì)去除標(biāo)本表面的表皮及皮下脂肪組織，僅保留瘢痕組織的真皮層部分。將處理后的瘢痕組織用于后續(xù)的成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：A型肉毒毒素（[生產(chǎn)廠家]，規(guī)格：[具體規(guī)格]），使用前用無菌生理鹽水按照不同實(shí)驗(yàn)需求稀釋成相應(yīng)濃度。細(xì)胞培養(yǎng)基選用高糖DMEM培養(yǎng)基（[品牌]，美國），并添加10%胎牛血清（[品牌]，澳大利亞）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，[品牌]，中國）。細(xì)胞消化液為0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（[品牌]，中國）。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（[品牌]，日本）用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（[品牌]，中國）用于分析細(xì)胞凋亡情況；Transwell小室（[品牌]，美國，孔徑：[具體孔徑]μm）及配套的無血清DMEM培養(yǎng)基用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；天狼星紅染色試劑盒（[品牌]，中國）用于檢測(cè)膠原蛋白含量。此外，還使用了RIPA裂解液（[品牌]，中國）、BCA蛋白定量試劑盒（[品牌]，中國）、SDS凝膠制備試劑盒（[品牌]，中國）、PVDF膜（[品牌]，美國）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（[品牌]，中國）等用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。主要儀器有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌]，美國），設(shè)定條件為37℃、5%CO?、飽和濕度，用于細(xì)胞的培養(yǎng)；超凈工作臺(tái)（[品牌]，中國），為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境；倒置相差顯微鏡（[品牌]，日本），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（[品牌]，美國），可在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，用于CCK-8實(shí)驗(yàn)和BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)；高速冷凍離心機(jī)（[品牌]，德國），能夠在低溫下進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞和蛋白樣品的處理；Transwell小室配套的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（[品牌]，美國）；熒光顯微鏡（[品牌]，日本），用于觀察細(xì)胞凋亡和免疫熒光染色結(jié)果；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（[品牌]，美國），用于蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌]，美國），用于檢測(cè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定采用組織塊貼壁法進(jìn)行增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。將處理好的瘢痕組織用眼科剪剪成約1mm×1mm×1mm大小的組織塊，均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶底部，組織塊間距約為0.5-1cm。向培養(yǎng)瓶中加入3-4mL含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊均勻分布，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并更換一次培養(yǎng)基。一般在培養(yǎng)3-5天后，可見組織塊周圍有細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈梭形或多角形，形態(tài)較為規(guī)則。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。在消化過程中，通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、間隙增大、部分細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞完全脫離瓶壁，形成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向離心管中加入適量的新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，然后按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，取出蓋玻片。用PBS緩沖液沖洗蓋玻片3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)。然后將蓋玻片放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，固定完成后，再次用PBS緩沖液沖洗3次。接下來進(jìn)行通透處理，將蓋玻片浸泡在0.3%TritonX-100溶液中10-15分鐘，使細(xì)胞膜通透性增加，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞。通透處理后，用PBS緩沖液沖洗3次。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫封閉30-60分鐘，以減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，不洗，直接加入稀釋好的兔抗人波形蛋白一抗，4℃孵育過夜。次日，取出蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5-10分鐘。加入稀釋好的羊抗兔IgG二抗（帶有熒光標(biāo)記），室溫避光孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5-10分鐘。最后，用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，室溫避光染色5-10分鐘。染色完成后，用PBS緩沖液沖洗3次，將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光（波形蛋白陽性表達(dá)），細(xì)胞核被染成藍(lán)色，則可鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。3.2.2A型肉毒毒素處理細(xì)胞分組將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板、6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別用于不同的檢測(cè)指標(biāo)。其中，96孔板每孔接種100μL細(xì)胞懸液，6孔板每孔接種2mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種適量細(xì)胞懸液，使細(xì)胞均勻分布。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)不同濃度的A型肉毒毒素實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入等體積的不含A型肉毒毒素的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為10U/mL、20U/mL、40U/mL、80U/mL的A型肉毒毒素溶液。選擇這幾個(gè)濃度梯度是基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同濃度的A型肉毒毒素作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后的效果進(jìn)行了初步觀察，發(fā)現(xiàn)10U/mL-80U/mL濃度范圍內(nèi)能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生較為明顯的生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該濃度范圍在其他類似研究中也被證明能夠有效影響成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能。每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在加入A型肉毒毒素后，繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。在不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)），向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死細(xì)胞則無此功能。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。然后使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。在培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，收集6孔板中的細(xì)胞，用PBS緩沖液沖洗2-3次，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2-3次。對(duì)于細(xì)胞周期檢測(cè)，將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。次日，離心棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。加入含有RNaseA（100μg/mL）的PI染液（50μg/mL），37℃避光孵育30-60分鐘。然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，分析處于G0/G1期、S期、G2/M期的細(xì)胞比例。對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。將洗滌后的細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。運(yùn)用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入100μL無血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入600μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)，使小室水化。在培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，收集細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。將24孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。用PBS緩沖液沖洗小室2-3次，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘。固定完成后，用PBS緩沖液沖洗2-3次，加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗2-3次，將小室晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率=（實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)）×100%。采用天狼星紅染色法檢測(cè)細(xì)胞膠原蛋白合成與分泌情況。在培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定完成后，用PBS緩沖液沖洗2-3次。向培養(yǎng)瓶中加入天狼星紅染液，室溫染色1-2小時(shí)。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗2-3次，去除未結(jié)合的染液。然后加入0.1mol/LNaOH溶液，振蕩10-15分鐘，使結(jié)合在膠原蛋白上的天狼星紅染料釋放到溶液中。將溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。吸光度值越高，表明細(xì)胞合成和分泌的膠原蛋白含量越多。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響采用MTT法檢測(cè)不同濃度A型肉毒毒素作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后的細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以吸光度（OD）值表示，計(jì)算細(xì)胞活力百分比并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體數(shù)據(jù)見表1。表1A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響（OD值，x±s，n=6）組別24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)對(duì)照組0.526±0.0310.689±0.0420.856±0.05110U/mLA型肉毒毒素組0.498±0.028*0.635±0.038*0.762±0.045*20U/mLA型肉毒毒素組0.456±0.025*0.578±0.035*0.654±0.040*40U/mLA型肉毒毒素組0.398±0.022*0.489±0.032*0.521±0.035*80U/mLA型肉毒毒素組0.325±0.018*0.376±0.028*0.405±0.030*注：與對(duì)照組比較，*P<0.05由表1可知，在不同作用時(shí)間下，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且隨著A型肉毒毒素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低。在24小時(shí)時(shí)，10U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞活力較對(duì)照組略有下降，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；20U/mL、40U/mL、80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞活力下降更為明顯。48小時(shí)時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞活力僅為對(duì)照組的54.6%。72小時(shí)時(shí)，細(xì)胞活力下降趨勢(shì)更為顯著，80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞活力降至對(duì)照組的47.3%。這表明A型肉毒毒素能夠有效抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的活力，且抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。4.2A型肉毒毒素對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同濃度A型肉毒毒素作用48小時(shí)后的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞周期分布和凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以百分比形式呈現(xiàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表2和圖1。表2A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞周期和凋亡的影響（x±s，n=6）組別G0/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）凋亡率（%）對(duì)照組52.34±3.1231.56±2.5416.10±1.853.56±0.5410U/mLA型肉毒毒素組58.67±3.56*25.45±2.23*15.88±1.766.89±0.85*20U/mLA型肉毒毒素組65.43±4.02*20.12±1.89*14.45±1.5610.23±1.20*40U/mLA型肉毒毒素組70.56±4.50*16.34±1.55*13.10±1.3015.67±1.50*80U/mLA型肉毒毒素組75.32±5.01*12.25±1.20*12.43±1.2520.56±2.00*注：與對(duì)照組比較，*P<0.05從表2數(shù)據(jù)可以看出，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，80U/mLA型肉毒毒素組G0/G1期細(xì)胞比例達(dá)到75.32%。同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），呈現(xiàn)出濃度依賴性下降趨勢(shì)。這表明A型肉毒毒素能夠?qū)⒃錾择：鄢衫w維細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期）和分裂期（G2/M期），從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。隨著A型肉毒毒素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞凋亡率達(dá)到20.56%，是對(duì)照組的近6倍。這充分說明A型肉毒毒素能夠誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。4.3A型肉毒毒素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用WesternBlot方法檢測(cè)不同濃度A型肉毒毒素作用48小時(shí)后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）等蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以蛋白條帶灰度值表示，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體數(shù)據(jù)見表3和圖2。表3A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（灰度值，x±s，n=6）組別CyclinD1PCNA對(duì)照組1.000±0.0851.000±0.09210U/mLA型肉毒毒素組0.765±0.068*0.721±0.065*20U/mLA型肉毒毒素組0.589±0.055*0.543±0.050*40U/mLA型肉毒毒素組0.423±0.040*0.386±0.035*80U/mLA型肉毒毒素組0.256±0.025*0.228±0.022*注：與對(duì)照組比較，*P<0.05由表3和圖2可知，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CyclinD1和PCNA蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，蛋白表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)。在10U/mLA型肉毒毒素組中，CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)就已出現(xiàn)明顯下降，分別降至對(duì)照組的76.5%和72.1%。80U/mLA型肉毒毒素組中，CyclinD1蛋白表達(dá)僅為對(duì)照組的25.6%，PCNA蛋白表達(dá)為對(duì)照組的22.8%。CyclinD1作為細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)降低表明A型肉毒毒素能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的核蛋白，其表達(dá)水平的顯著下降進(jìn)一步證實(shí)了A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用。五、結(jié)果討論5.1A型肉毒毒素抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的作用在本研究中，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，清晰地觀察到隨著A型肉毒毒素濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的活力呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢(shì)。在24小時(shí)時(shí)，較低濃度的10U/mLA型肉毒毒素就已對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，雖下降幅度相對(duì)較小，但差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著濃度進(jìn)一步增加，20U/mL、40U/mL、80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞活力下降更為明顯。48小時(shí)和72小時(shí)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一趨勢(shì)，且80U/mLA型肉毒毒素組在72小時(shí)時(shí)細(xì)胞活力降至對(duì)照組的47.3%。這表明A型肉毒毒素能夠有效地抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的活力，且這種抑制作用具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性。細(xì)胞活力的下降往往與細(xì)胞增殖受到抑制密切相關(guān)。為了深入探究其作用機(jī)制，本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，80U/mLA型肉毒毒素組G0/G1期細(xì)胞比例達(dá)到75.32%。同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，呈現(xiàn)出濃度依賴性下降趨勢(shì)。細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的核心過程，G0/G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的階段，S期是DNA合成期，G2/M期則是細(xì)胞分裂的時(shí)期。A型肉毒毒素能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，從而有效地抑制了細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用。除了細(xì)胞周期的改變，細(xì)胞凋亡也是影響細(xì)胞增殖的重要因素。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組，且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，80U/mLA型肉毒毒素組細(xì)胞凋亡率達(dá)到20.56%，是對(duì)照組的近6倍。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)調(diào)控時(shí)，會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。A型肉毒毒素誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，使得細(xì)胞數(shù)量減少，從而抑制了細(xì)胞的增殖。這一作用機(jī)制在瘢痕治療中具有重要意義，通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，可以減少瘢痕組織中過度增殖的成纖維細(xì)胞數(shù)量，有利于瘢痕的軟化和消退。為了從分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證A型肉毒毒素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，本研究采用WesternBlot方法檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平的變化直接影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的核蛋白，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CyclinD1和PCNA蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，蛋白表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)。在10U/mLA型肉毒毒素組中，CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)就已出現(xiàn)明顯下降，分別降至對(duì)照組的76.5%和72.1%。80U/mLA型肉毒毒素組中，CyclinD1蛋白表達(dá)僅為對(duì)照組的25.6%，PCNA蛋白表達(dá)為對(duì)照組的22.8%。這些結(jié)果充分表明，A型肉毒毒素能夠通過抑制CyclinD1和PCNA蛋白的表達(dá)，阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而有效地抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。綜上所述，本研究通過多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)等多個(gè)層面，系統(tǒng)地證實(shí)了A型肉毒毒素能夠顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制主要包括將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期和分裂期；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞數(shù)量；以及下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和PCNA的表達(dá)，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解A型肉毒毒素治療增生性瘢痕的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床應(yīng)用提供了有力的理論支持。在臨床治療中，可以根據(jù)本研究結(jié)果，合理選擇A型肉毒毒素的使用劑量和治療時(shí)間，以達(dá)到最佳的治療效果。5.2A型肉毒毒素影響細(xì)胞周期和凋亡的機(jī)制探討細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常增殖和組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而細(xì)胞凋亡則是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在組織發(fā)育、細(xì)胞更新和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在增生性瘢痕形成過程中，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡失衡，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和異常存活，進(jìn)而促進(jìn)瘢痕的形成和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素能夠顯著影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡，深入探討其作用機(jī)制具有重要的理論和臨床意義。從細(xì)胞周期方面來看，A型肉毒毒素可能通過多種途徑將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。一方面，細(xì)胞周期的進(jìn)程受到一系列細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的嚴(yán)格調(diào)控。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，進(jìn)而磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F促進(jìn)與DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞進(jìn)入S期。本研究中，A型肉毒毒素作用后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的形成減少，CDK4/6激酶活性受到抑制，Rb不能被有效磷酸化，E2F無法釋放，從而阻斷了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。另一方面，p21和p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）也參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。p21和p27能夠與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。有研究表明，A型肉毒毒素可能通過上調(diào)p21和p27的表達(dá)，增強(qiáng)它們對(duì)Cyclin-CDK復(fù)合物的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。此外，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路等也與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。A型肉毒毒素可能通過抑制這些信號(hào)通路的激活，減少細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，在PI3K/AKT信號(hào)通路中，AKT的激活可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖。本研究中，A型肉毒毒素可能通過抑制PI3K的表達(dá)或降低AKT的磷酸化水平，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。在細(xì)胞凋亡方面，A型肉毒毒素誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體的膜電位發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活半胱天冬酶-9（caspase-9）。激活的caspase-9再激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究表明，A型肉毒毒素可能通過影響線粒體的功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而激活線粒體凋亡途徑。此外，死亡受體途徑也在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等，與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可招募接頭蛋白FADD和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8被激活，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。A型肉毒毒素可能通過上調(diào)死亡受體的表達(dá)或增強(qiáng)其與配體的結(jié)合能力，激活死亡受體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2家族蛋白也對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。正常情況下，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持平衡，維持細(xì)胞的存活。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，促凋亡蛋白的表達(dá)增加或其活性增強(qiáng)，它們可以與抗凋亡蛋白相互作用，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究中，A型肉毒毒素可能通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，打破Bcl-2家族蛋白之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。5.3與其他治療方法的比較與優(yōu)勢(shì)分析目前臨床上針對(duì)增生性瘢痕的治療方法眾多，各有其特點(diǎn)和局限性。與手術(shù)治療相比，手術(shù)切除增生性瘢痕雖然可以直接去除明顯的瘢痕組織，對(duì)于較大或嚴(yán)重影響功能的瘢痕有一定的治療效果，但手術(shù)本身會(huì)再次造成創(chuàng)傷，術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，單純手術(shù)切除增生性瘢痕的復(fù)發(fā)率可高達(dá)45%-100%，且手術(shù)切口愈合過程中又可能形成新的瘢痕，進(jìn)一步影響患者的外觀和生活質(zhì)量。而A型肉毒毒素治療則無需進(jìn)行手術(shù)切除，避免了手術(shù)帶來的創(chuàng)傷和風(fēng)險(xiǎn)，其通過局部注射的方式，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)周圍正常組織的損傷較小。激光治療利用激光的熱效應(yīng)，對(duì)瘢痕組織進(jìn)行氣化、磨削，能夠改善瘢痕的色澤和表面平整度。然而，激光治療對(duì)于較厚的增生性瘢痕效果有限，往往需要多次治療才能取得一定的效果。同時(shí)，激光治療可能引起色素沉著、皮膚灼傷等并發(fā)癥，尤其是對(duì)于膚色較深的患者，色素沉著的風(fēng)險(xiǎn)更高。與之相比，A型肉毒毒素治療不受瘢痕厚度的限制，能夠直接作用于成纖維細(xì)胞，抑制其增殖和膠原蛋白合成，從而有效減輕瘢痕增生。且在本研究及相關(guān)臨床實(shí)踐中，A型肉毒毒素治療后未出現(xiàn)明顯的色素沉著等皮膚不良反應(yīng)，安全性較高。放射治療通過放射線抑制瘢痕組織中細(xì)胞的增殖，在一定程度上可以減輕瘢痕增生。但是，放射治療的副作用較大，可能導(dǎo)致皮膚放射性損傷，如皮膚紅斑、脫屑、潰瘍等，長(zhǎng)期使用還存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。由于這些潛在的嚴(yán)重副作用，放射治療在臨床應(yīng)用中受到了很大的限制。而A型肉毒毒素治療不存在放射性損傷和致癌風(fēng)險(xiǎn)，其作用機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能來抑制瘢痕增生，對(duì)人體的整體健康影響較小。藥物治療方面，常用的糖皮質(zhì)激素類藥物通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖來減輕瘢痕增生。然而，長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可能會(huì)引起皮膚萎縮、色素沉著、內(nèi)分泌紊亂等不良反應(yīng)。氟尿嘧啶作為一種抗代謝藥物，可抑制細(xì)胞DNA合成，從而抑制瘢痕形成，但也可能出現(xiàn)局部疼痛、潰瘍、過敏等副作用。相比之下，A型肉毒毒素治療的不良反應(yīng)相對(duì)較少。在本研究中，未觀察到明顯的全身性不良反應(yīng)，僅在注射局部可能出現(xiàn)短暫的輕微紅腫、疼痛等，一般在數(shù)天內(nèi)即可自行緩解。且A型肉毒毒素通過特異性地作用于成纖維細(xì)胞，調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能，對(duì)瘢痕組織的作用更為精準(zhǔn)，減少了對(duì)其他正常組織和生理功能的影響。壓力治療通過佩戴彈力繃帶、壓力衣等，對(duì)瘢痕部位施加持續(xù)的壓力，減少瘢痕的血液供應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成。雖然壓力治療是一種相對(duì)安全的治療方法，但需要患者長(zhǎng)期堅(jiān)持佩戴，患者依從性較差。而且，對(duì)于已經(jīng)形成的較嚴(yán)重的增生性瘢痕，壓力治療的效果往往欠佳。A型肉毒毒素治療則無需患者長(zhǎng)期佩戴輔助器具，治療過程相對(duì)簡(jiǎn)便。其可以直接作用于瘢痕組織，迅速發(fā)揮抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的作用，對(duì)于不同程度的增生性瘢痕都有較好的治療效果。5.4研究的局限性與展望本研究雖然在揭示A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的抑制作用方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地控制實(shí)驗(yàn)條件，深入探究藥物對(duì)細(xì)胞的直接作用，但缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中與在體內(nèi)的生理狀態(tài)存在一定差異，體內(nèi)存在復(fù)雜的神經(jīng)、血管、免疫系統(tǒng)等相互作用，這些因素可能會(huì)影響A型肉毒毒素的作用效果和機(jī)制。因此，未來研究需要進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，在更接近人體生理環(huán)境的條件下驗(yàn)證A型肉毒毒素的治療效果和安全性，為臨床應(yīng)用提供更可靠的依據(jù)。其次，本研究的樣本量相對(duì)較小，僅收集了[X]例患者的增生性瘢痕組織標(biāo)本。較小的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的偏差，無法全面反映不同個(gè)體對(duì)A型肉毒毒素的反應(yīng)差異。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，納入不同年齡、性別、瘢痕部位、瘢痕形成原因等多因素的患者樣本，進(jìn)行更深入的分析，以提高研究結(jié)果的普遍性和可靠性。再者，雖然本研究初步探討了A型肉毒毒素影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，但對(duì)于其具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未完全明確。細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因調(diào)控機(jī)制，A型肉毒毒素可能通過多種途徑影響成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為。未來研究可以采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析A型肉毒毒素作用后成纖維細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，深入挖掘其潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，進(jìn)一步完善對(duì)其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。此外，本研究?jī)H考察了A型肉毒毒素單一因素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響，而在臨床實(shí)際應(yīng)用中，往往需要聯(lián)合其他治療方法以提高治療效果。例如，將A型肉毒毒素與激光治療、藥物治療、手術(shù)治療等相結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，更好地改善瘢痕的外觀和功能。因此，未來研究可以開展聯(lián)合治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探索不同治療方法的最佳組合方式和治療時(shí)機(jī)，為臨床治療提供更多的選擇和優(yōu)化方案。展望未來，隨著對(duì)A型肉毒毒素治療增生性瘢痕機(jī)制研究的不斷深入以及臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的積累，有望開發(fā)出更加安全、有效的治療方案。一方面，可以根據(jù)不同患者的個(gè)體差異，如基因多態(tài)性、瘢痕的嚴(yán)重程度等，制定個(gè)性化的治療方案，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。另一方面，基于對(duì)作用機(jī)制的深入理解，可能會(huì)研發(fā)出新型的藥物或生物制劑，進(jìn)一步提高治療效果，為廣大增生性瘢痕患者帶來更好的治療體驗(yàn)和生活質(zhì)量。同時(shí)，隨著3D打印、組織工程等新興技術(shù)的發(fā)展，未來也有可能將A型肉毒毒素與這些技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出更加先進(jìn)的瘢痕治療方法。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，A型肉毒毒素能夠顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的活力，且抑制作用呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著A型肉毒毒素濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素能夠?qū)⒃錾择：鄢衫w維細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期）和分裂期（G2/M期），從而有效抑制細(xì)胞的增殖。同時(shí)，A型肉毒毒素還能夠誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著毒素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。從分子層面來看，采用WesternBlot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示A型肉毒毒素能夠顯著下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平。CyclinD1作為細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)降低表明A型肉毒毒素能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的核蛋白，其表達(dá)水平的顯著下降進(jìn)一步證實(shí)了A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用。綜上所述，本研究證實(shí)了A型肉毒毒素通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及下調(diào)CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)等多種途徑，有效地抑制了增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，從而為其在增生性瘢痕治療中的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。6.2對(duì)未來臨床應(yīng)用的展望本研究成果為A型肉毒毒素在增生性瘢痕臨床治療中的應(yīng)用開辟了廣闊前景。在未來的臨床實(shí)踐中，A型肉毒毒素有望成為治療增生性瘢痕的重要手段之一。其抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，為解決增生性瘢痕這一臨床難題提供了新的策略。從治療效果來看，基于本研究中A型肉毒毒素對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的顯著影響，預(yù)計(jì)在臨床上能夠有效減輕瘢痕增生的程度。通過抑制成纖維細(xì)胞的過度增殖，減少膠原蛋白的合成與分泌，可使瘢痕組織逐漸軟化、變平，改善瘢痕的外觀和質(zhì)地。這對(duì)于提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義，尤其是對(duì)于那些因瘢痕影響外觀和功能而承受巨大心理壓力的患者，能夠顯著提升他們的自信心和生活滿意度。在治療方式上，A型肉毒毒素局部注射操作簡(jiǎn)便，對(duì)患者的創(chuàng)傷較小，恢復(fù)時(shí)間相對(duì)較短，這使得它更易于被患者接受。與傳統(tǒng)的手術(shù)治療相比，避免了手術(shù)帶來的較大創(chuàng)傷和較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。而且，其安全性較高，不良反應(yīng)相對(duì)較少，在嚴(yán)格控制劑量和規(guī)范操作的前提下，能夠在保證治療效果的同時(shí)，最大程度地減少對(duì)患者身體的不良影響。這為臨床醫(yī)生提供了一種安全、有效的治療選擇，有助于提高治療的依從性和成功率。此外，未來可以進(jìn)一步探索A型肉毒毒素與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用。例如，與激光治療聯(lián)合使用，先利用A型肉毒毒素抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，減輕瘢痕的厚度和硬度，再通過激光治療改善瘢痕的色澤和表面平整度，可能會(huì)取得更好的綜合治療效果。與藥物治療聯(lián)合時(shí)，如與糖皮質(zhì)激素或其他抗瘢痕藥物聯(lián)合應(yīng)用，通過不同藥物的協(xié)同作用，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制瘢痕的形成和發(fā)展，有望進(jìn)一步提高治療效果。這種聯(lián)合治療的模式將為增生性瘢痕的臨床治療提供更多的可能性，滿足不同患者的個(gè)性化治療需求。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來還有可能開發(fā)出更加精準(zhǔn)、高效的A型肉毒毒素治療方案。通過對(duì)患者個(gè)體差異的深入研究，包括基因多態(tài)性、瘢痕的具體特征等因素，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的治療，根據(jù)每個(gè)患者的具體情況制定最適合的治療劑量、注射時(shí)間和治療周期。同時(shí)，隨著對(duì)A型肉毒毒素作用機(jī)制的進(jìn)一步明確，也有可能研發(fā)出新型的制劑或給藥方式，進(jìn)一步提高其治療效果和安全性。七、參考文獻(xiàn)[1]趙喜彬，楊松林。表皮干細(xì)胞用于瘢痕治療的研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科雜志，2009,5(6):352-355.[2]趙倩楠，周粵閩，孫朝陽。機(jī)械張力對(duì)創(chuàng)傷后增生性瘢痕形成的影響研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2021,37(6):586-590.[3]張釗，劉英宇，劉巖，李倩，梁婷婷，洪凡，馮莉，孫影。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶-2對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2020,38(1):7-12.[4]武鳳蓮，朱東來，王嘉欣，湯云陽，王連英.A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕中TGF-β1和cyclinD1基因表達(dá)影響的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2015,24(6):37-41.[5]回薔，林時(shí)秀，郭冰玉，常鵬，張倩，陶凱.A型肉毒毒素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2019,36(11):1966-1968.[6]王洪濤，韓軍濤，胡大海。炎癥反應(yīng)在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2021,37(5):490-494.[7]管青，王海洪.A型肉毒毒素防止面部美容切口瘢痕增生的效果觀察[J].臨床合理用藥雜志，2018,11(10):104-105.[8]葉亮，易陽艷，王江文.A型肉毒毒素防治病理性瘢痕的臨床研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2021,37(4):538-541.[9]戴杏，梁虹。超脈沖CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合A型肉毒毒素注射治療增生性瘢痕的臨床療效觀察[J].中國美容整形外科雜志，2019,30(10):587-589.[10]龔慧，王楊，劉中波，于兵，孫海峰，曹政.A型肉毒毒素聯(lián)合復(fù)方倍他米松治療大面積增生性瘢痕的臨床療效觀察[J].中國美容整形外科雜志，2021,32(3):158-162.[11]楊青文，李梁，陳遠(yuǎn)征.A型肉毒毒素在增生性瘢痕防治中的研究進(jìn)展[J].中華整形外科雜志，2023,39(6):685-689.[12]吳可佳，吳文育.A型肉毒毒素治療瘢痕的臨床進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2017,26(8):24-26.[2]趙倩楠，周粵閩，孫朝陽。機(jī)械張力對(duì)創(chuàng)傷后增生性瘢痕形成的影響研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2021,37(6):586-590.[3]張釗，劉英宇，劉巖，李倩，梁婷婷，洪凡，馮莉，孫影。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶-2對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2020,38(1):7-12.[4]武鳳蓮，朱東來，王嘉欣，湯云陽，王連英.A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕中TGF-β1和cyclinD1基因表達(dá)影響的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2015,24(6):37-41.[5]回薔，林時(shí)秀，郭冰玉，常鵬，張倩，陶凱.A型肉毒毒素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2019,36(11):1966-1968.[6]王洪濤，韓軍濤，胡大海。炎癥反應(yīng)在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2021,37(5):490-494.[7]管青，王海洪.A型肉毒毒素防止面部美容切口瘢痕增生的效果觀察[J].臨床合理用藥雜志，2018,11(10):104-105.[8]葉亮，易陽艷，王江文.A型肉毒毒素防治病理性瘢痕的臨床研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2021,37(4):538-541.[9]戴杏，梁虹。超脈沖CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合A型肉毒毒素注射治療增生性瘢痕的臨床療效觀察[J].中國美容整形外科雜志，2019,30(10):587-589.[10]龔慧，王楊，劉中波，于兵，孫海峰，曹政.A型肉毒毒素聯(lián)合復(fù)方倍他米松治療大面積增生性瘢痕的臨床療效觀察[J].中國美容整形外科雜志，2021,32(3):158-162.[11]楊青文，李梁，陳遠(yuǎn)征.A型肉毒毒素在增生性瘢痕防治中的研究進(jìn)展[J].中華整形外科雜志，2023,39(6):685-689.[12]吳可佳，吳文育.A型肉毒毒素治療瘢痕的臨床進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2017,26(8):24-26.[3