共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖與遷移的抑制機(jī)制解析一、引言1.1研究背景1.1.1肺腺癌的現(xiàn)狀與危害肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。在2020年，全球新增肺癌病例約220萬(wàn)例，死亡病例約180萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤之首。肺腺癌作為肺癌的主要亞型之一，約占肺癌病例的40%，在我國(guó)，肺腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和生存率。肺腺癌的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，吸煙是其最重要的危險(xiǎn)因素之一，長(zhǎng)期大量吸煙會(huì)顯著增加患肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，環(huán)境污染、職業(yè)暴露（如石棉、氡氣等）、遺傳因素以及慢性肺部疾病等也在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。肺腺癌起病較為隱匿，早期癥狀往往不明顯，容易被患者忽視。隨著病情的進(jìn)展，患者可能會(huì)出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，但此時(shí)往往已經(jīng)處于疾病的中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)。肺腺癌的預(yù)后較差，5年生存率較低，即使經(jīng)過(guò)手術(shù)、化療、放療等綜合治療，仍有許多患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。因此，深入研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和治療方法，對(duì)于提高肺腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要的意義。1.1.2肺腺癌干細(xì)胞的關(guān)鍵作用腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出，為腫瘤的研究帶來(lái)了新的視角。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一小部分具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的細(xì)胞，它們被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。肺腺癌干細(xì)胞作為肺腺癌組織中的腫瘤干細(xì)胞亞群，在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。肺腺癌干細(xì)胞具有高度的自我更新能力，能夠不斷分裂增殖，維持腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。它們還具有多向分化潛能，可以分化為多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)各不相同，增加了治療的難度。此外，肺腺癌干細(xì)胞具有高致瘤性，少量的肺腺癌干細(xì)胞就能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤，而普通的腫瘤細(xì)胞則需要大量接種才能成瘤。肺腺癌干細(xì)胞在肺腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用。它們能夠通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）過(guò)程獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，肺腺癌干細(xì)胞表面表達(dá)的一些標(biāo)志物，如CD133、CD44等，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。高表達(dá)這些標(biāo)志物的肺腺癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，更容易導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。肺腺癌干細(xì)胞對(duì)化療和放療具有高度的耐藥性，這是導(dǎo)致肺腺癌治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。肺腺癌干細(xì)胞膜上表達(dá)的ATP結(jié)合盒（ATP-BindingCassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BreastCancerResistanceProtein，BCRP）等，能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使肺腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，肺腺癌干細(xì)胞還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠快速修復(fù)化療和放療引起的DNA損傷，從而逃避治療的殺傷作用。由于肺腺癌干細(xì)胞在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著核心作用，因此，靶向肺腺癌干細(xì)胞的治療策略成為了研究的熱點(diǎn)。通過(guò)特異性地靶向肺腺癌干細(xì)胞，有望從根本上治愈肺腺癌，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，目前針對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的靶向治療仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如如何準(zhǔn)確地識(shí)別和分離肺腺癌干細(xì)胞、如何開發(fā)高效低毒的靶向藥物等。因此，深入研究肺腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的靶向治療策略具有重要的指導(dǎo)意義。1.1.3共軛亞油酸的生物學(xué)特性共軛亞油酸（ConjugatedLinoleicAcid，CLA）是一組亞油酸的位置和幾何異構(gòu)體的混合物，其共軛雙鍵通常位于碳鏈的第9、10、11或10、12位，每個(gè)雙鍵可以以順式或反式構(gòu)型存在，主要以c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構(gòu)體形式存在，其中c9，t11-CLA是天然存在且生物活性最強(qiáng)的異構(gòu)體。CLA廣泛存在于反芻動(dòng)物的肉和奶中，如牛乳中CLA的含量為4-17mg/kg，羊肉中CLA的含量約為12mg/kg。這是由于反芻動(dòng)物瘤胃中的溶纖維丁酸弧菌分泌的亞油酸異構(gòu)酶能夠?qū)営退徂D(zhuǎn)化為CLA，主要是c9，t11異構(gòu)體CLA。此外，CLA也少量存在于其他動(dòng)物的組織、血液和體液中，在火雞屠體熱處理過(guò)程中，亞油酸可異構(gòu)化生成CLA，每克火雞脂肪中含2.5-11mgCLA。植物性食品中也含有CLA，但其異構(gòu)體的分布模式與動(dòng)物性食品顯著不同，且具有生物活性的c9，t11異構(gòu)體在植物性食品中含量很少，如在每克普通植物油中僅含有0.1-0.7mgCLA，且c9，t11異構(gòu)體含量不到總CLA的一半。海產(chǎn)品中的CLA含量同樣很少。目前，CLA也可以通過(guò)人工合成的方式獲得，一般是以亞油酸或富含亞油酸的植物油為底物，通過(guò)堿催化的異構(gòu)化反應(yīng)來(lái)合成。雖然最新改進(jìn)的合成工藝可使CLA較純，c9，t11和t10，c12異構(gòu)體的含量超過(guò)50%，非CLA成分低于1%，但人工合成的CLA仍是多種異構(gòu)體的混合物，分離純化以期獲得單一異構(gòu)體CLA的技術(shù)難題尚未解決。CLA具有多種生物學(xué)活性，在抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、減肥、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，CLA對(duì)多種癌癥具有抑制作用，能夠減少致癌物引起的皮膚癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胸腺癌等。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，生理濃度的CLA可殺死或抑制人類惡性黑素瘤、結(jié)腸和直腸癌以及胸癌培養(yǎng)的細(xì)胞。其抗癌機(jī)制主要包括抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路等。CLA能夠抑制鳥氨酸脫羧酶、蛋白激酶C等與致癌有關(guān)的酶的活性，同時(shí)也能抑制癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸的合成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖；通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；還可以降低與轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CLA還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，在含膽固醇的飼糧中添加CLA喂兔和鼠，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組兔和鼠血液中總膽固醇水平均較低，低密度脂蛋白膽固醇與高密度脂蛋白膽固醇的比例降低，未發(fā)生動(dòng)脈硬化。CLA能抑制腸脂?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，這種酶可能與膽固醇的吸收有關(guān)，從而降低血和肝中膽固醇水平。在減肥方面，研究表明，在豬和鼠飼糧中添加CLA，能抑制脂肪沉積，提高瘦肉率。這是由于CLA抑制了脂肪組織的脂合成和促進(jìn)脂分解。在肉雞飼糧中添加1.8%CLA，肉雞肝臟和胸部脂肪含量顯著下降，蛋白質(zhì)含量增加，大腿肌肉比例增大。體外培養(yǎng)試驗(yàn)表明，CLA能抑制脂肪前體細(xì)胞的增生，減少三酰甘油積累，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡。CLA還具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞免疫因子、前列腺素的合成以及類十二烷酸等途徑，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫力。在飼糧中添加CLA，可增加動(dòng)物脾臟和血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量，脾臟細(xì)胞的增生加快。鑒于CLA具有如此廣泛的生物學(xué)活性，尤其是其顯著的抗癌活性，使得CLA在腫瘤治療領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。研究CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的作用及其機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的肺腺癌治療方法具有重要的意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究共軛亞油酸（CLA）抑制肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的具體分子機(jī)制，為肺腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)研究CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的作用，有望揭示CLA在腫瘤治療中的新機(jī)制，為開發(fā)基于CLA的新型抗癌藥物或輔助治療策略奠定基礎(chǔ)。肺腺癌作為肺癌的主要亞型之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。盡管目前臨床上已經(jīng)有多種治療手段，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但肺腺癌患者的總體生存率仍然較低，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問(wèn)題嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后。肺腺癌干細(xì)胞在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著關(guān)鍵作用，因此，靶向肺腺癌干細(xì)胞的治療策略成為了研究的熱點(diǎn)。然而，目前針對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的靶向治療仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如缺乏有效的靶向藥物、治療耐藥性等問(wèn)題。共軛亞油酸（CLA）作為一種具有多種生物學(xué)活性的天然脂肪酸，尤其是其顯著的抗癌活性，使其在腫瘤治療領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，CLA對(duì)多種癌癥具有抑制作用，能夠抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。然而，CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚未完全明確。本研究通過(guò)深入探究CLA抑制肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步闡明CLA的抗癌作用機(jī)制，還可能為肺腺癌的治療提供新的策略和靶點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：本研究將豐富對(duì)肺腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性和作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步揭示CLA的抗癌作用機(jī)制，為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的理論依據(jù)。通過(guò)深入探究CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的影響及其分子機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，為肺腺癌的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。臨床意義：為肺腺癌的治療提供新的潛在治療靶點(diǎn)和治療策略。如果能夠明確CLA抑制肺腺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制，那么就有可能開發(fā)出基于CLA的新型抗癌藥物或輔助治療策略，從而提高肺腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，本研究還有助于深入理解肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，為肺腺癌的早期診斷和預(yù)防提供理論支持。社會(huì)意義：肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。本研究的成果如果能夠轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，將有助于提高肺腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的社會(huì)意義。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，共軛亞油酸（CLA）的抗癌作用以及肺腺癌干細(xì)胞的特性成為了腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此展開了廣泛而深入的研究。在共軛亞油酸的抗癌研究方面，國(guó)外起步較早。早在1983年，Pariza等學(xué)者就從研磨的牛肉中發(fā)現(xiàn)了CLA，并對(duì)其抗突變作用進(jìn)行了研究。隨后，眾多研究表明CLA對(duì)多種癌癥具有抑制作用。如在乳腺癌研究中，Durgam和Fernandes發(fā)現(xiàn)CLA能抑制雌性激素受體陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)；有報(bào)道顯示CLA不僅抑制MDA-MB468乳腺癌細(xì)胞在SCID鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，而且完全阻止了腫瘤細(xì)胞向肺、外周血和骨髓的轉(zhuǎn)移。在前列腺癌研究中，Cesano等證實(shí)了CLA可以抑制人前列腺癌DU145細(xì)胞系在SCID鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也不斷深入，有研究表明在SGC-7901細(xì)胞在c9，t11-CLA作用下，體外的穿膜和浸潤(rùn)能力下降，這表明CLA在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。其抗癌機(jī)制主要包括抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路等。CLA能夠抑制鳥氨酸脫羧酶、蛋白激酶C等與致癌有關(guān)的酶的活性，同時(shí)也能抑制癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸的合成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖；通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；還可以降低與轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對(duì)于肺腺癌干細(xì)胞，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)其具有高度的自我更新能力、多向分化潛能和高致瘤性。如在肺癌干細(xì)胞染色體上的端粒長(zhǎng)度有所增加，且端粒酶抑制劑能選擇性抑制肺癌干細(xì)胞的增殖活力，這表明肺腺癌干細(xì)胞在染色體水平上具有獨(dú)特的維持細(xì)胞壽命的機(jī)制。在分子水平上，肺腺癌干細(xì)胞膜表面ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體能促進(jìn)胞內(nèi)藥物外排，從而減弱藥物對(duì)細(xì)胞的損傷，許多干細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD133、CD44和乙醛脫氫酶也與肺腺癌干細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究也表明，肺腺癌干細(xì)胞在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著關(guān)鍵作用。如通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)法從肺腺癌A549細(xì)胞株中分離出的肺癌干細(xì)胞球，對(duì)順鉑和吉西他濱的耐藥性較其細(xì)胞系強(qiáng)。然而，目前關(guān)于CLA與肺腺癌干細(xì)胞之間關(guān)系的研究還相對(duì)較少。雖然已知CLA具有抗癌作用，肺腺癌干細(xì)胞在肺腺癌發(fā)展中至關(guān)重要，但CLA如何影響肺腺癌干細(xì)胞的增殖和遷移，其具體的分子機(jī)制是什么，仍有待進(jìn)一步深入探究?，F(xiàn)有研究多集中在CLA對(duì)普通腫瘤細(xì)胞的作用以及肺腺癌干細(xì)胞的特性和耐藥機(jī)制上，對(duì)于CLA靶向肺腺癌干細(xì)胞的研究還存在諸多空白。例如，CLA是否能夠特異性地作用于肺腺癌干細(xì)胞表面的某些標(biāo)志物，從而影響其生物學(xué)行為；CLA是否通過(guò)調(diào)節(jié)肺腺癌干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)抑制其增殖和遷移等問(wèn)題，都尚未得到明確解答。填補(bǔ)這些研究空白，將有助于深入了解肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肺腺癌干細(xì)胞概述2.1.1肺腺癌干細(xì)胞的定義與鑒定肺腺癌干細(xì)胞是肺腺癌組織中一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，它們具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性，被認(rèn)為是肺腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。與普通肺腺癌細(xì)胞相比，肺腺癌干細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性使得它們?cè)谀[瘤的進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在鑒定方面，目前常用的方法主要基于細(xì)胞表面標(biāo)志物、細(xì)胞功能特性以及基因表達(dá)譜等。細(xì)胞表面標(biāo)志物是鑒定肺腺癌干細(xì)胞的重要依據(jù)之一。常見(jiàn)的肺腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物包括CD133、CD44、EpCAM等。CD133，又稱Prominin-1，是一種高度糖基化的跨膜蛋白。研究表明，CD133陽(yáng)性的肺腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力和致瘤性。在體外實(shí)驗(yàn)中，CD133陽(yáng)性細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中形成腫瘤球，而CD133陰性細(xì)胞則難以形成。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將少量CD133陽(yáng)性細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，能夠形成明顯的腫瘤，而CD133陰性細(xì)胞則需要大量接種才可能成瘤。CD44是一種細(xì)胞黏附分子，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用。CD44在肺腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。EpCAM，即上皮細(xì)胞黏附分子，在肺腺癌干細(xì)胞表面也有較高表達(dá)，它在維持干細(xì)胞的干性和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移方面發(fā)揮著重要作用。除了表面標(biāo)志物，還可以利用細(xì)胞的功能特性來(lái)鑒定肺腺癌干細(xì)胞。腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)是常用的方法之一，肺腺癌干細(xì)胞在無(wú)血清、添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中能夠形成懸浮的腫瘤球，這些腫瘤球具有自我更新和分化的能力，而普通肺腺癌細(xì)胞則難以形成腫瘤球或形成的腫瘤球較小且不穩(wěn)定。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，肺腺癌干細(xì)胞具有更高的克隆形成能力，能夠在低密度接種的情況下形成更多、更大的克隆集落?；虮磉_(dá)譜分析也是鑒定肺腺癌干細(xì)胞的重要手段。通過(guò)對(duì)肺腺癌干細(xì)胞和普通肺腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)肺腺癌干細(xì)胞中一些與干細(xì)胞特性相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如Oct4、Sox2、Nanog等，這些基因在維持干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能方面起著關(guān)鍵作用。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)肺腺癌干細(xì)胞和普通肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肺腺癌干細(xì)胞中Oct4基因的表達(dá)水平明顯高于普通肺腺癌細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了其在肺腺癌干細(xì)胞中的重要作用。2.1.2肺腺癌干細(xì)胞的特性肺腺癌干細(xì)胞具有多種獨(dú)特的特性，這些特性使其在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自我更新是肺腺癌干細(xì)胞的重要特性之一，這使得它們能夠不斷產(chǎn)生新的干細(xì)胞和分化的腫瘤細(xì)胞，維持腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。肺腺癌干細(xì)胞可以通過(guò)對(duì)稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)相同的干細(xì)胞，從而增加干細(xì)胞的數(shù)量；也可以通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)分化的腫瘤細(xì)胞，保證腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。研究表明，肺腺癌干細(xì)胞中存在一些關(guān)鍵的信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin、Notch等，它們?cè)谡{(diào)控肺腺癌干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活一系列與自我更新相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞的自我更新。多向分化潛能是肺腺癌干細(xì)胞的另一重要特性。肺腺癌干細(xì)胞能夠分化為多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，包括具有不同形態(tài)和功能的細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)各不相同，增加了治療的難度。在體外實(shí)驗(yàn)中，將肺腺癌干細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，可以觀察到它們分化為具有不同表型的細(xì)胞，如上皮樣細(xì)胞、間質(zhì)樣細(xì)胞等。肺腺癌干細(xì)胞還可以分化為對(duì)化療藥物具有不同敏感性的細(xì)胞，這也是導(dǎo)致肺腺癌治療耐藥的重要原因之一。肺腺癌干細(xì)胞具有高致瘤性，少量的肺腺癌干細(xì)胞就能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤，而普通的腫瘤細(xì)胞則需要大量接種才能成瘤。研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌干細(xì)胞的高致瘤性與其高增殖能力、低分化程度以及對(duì)微環(huán)境的適應(yīng)性等因素有關(guān)。肺腺癌干細(xì)胞表面表達(dá)的一些標(biāo)志物，如CD133、CD44等，也與它們的高致瘤性密切相關(guān)。高表達(dá)CD133的肺腺癌干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的致瘤能力明顯高于低表達(dá)CD133的細(xì)胞。耐藥性是肺腺癌干細(xì)胞的一個(gè)顯著特性，也是導(dǎo)致肺腺癌治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。肺腺癌干細(xì)胞對(duì)化療和放療具有高度的耐藥性，這主要是由于它們具有多種耐藥機(jī)制。肺腺癌干細(xì)胞膜上表達(dá)的ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BreastCancerResistanceProtein，BCRP）等，能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使肺腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。肺腺癌干細(xì)胞還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠快速修復(fù)化療和放療引起的DNA損傷，從而逃避治療的殺傷作用。此外，肺腺癌干細(xì)胞所處的微環(huán)境也對(duì)其耐藥性產(chǎn)生影響，微環(huán)境中的細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等成分可以通過(guò)調(diào)節(jié)肺腺癌干細(xì)胞的信號(hào)通路，增強(qiáng)其耐藥性。2.1.3肺腺癌干細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制肺腺癌干細(xì)胞的增殖與遷移是其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵生物學(xué)行為，受到多種信號(hào)通路和分子機(jī)制的調(diào)控。在增殖方面，多條信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路之一。在正常情況下，β-catenin與APC、Axin、GSK-3β等形成復(fù)合物，被磷酸化后降解。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和LRP5/6結(jié)合，抑制GSK-3β的活性，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞的增殖。研究表明，在肺腺癌干細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，抑制該通路的活性可以顯著降低肺腺癌干細(xì)胞的增殖能力。PI3K/AKT信號(hào)通路也在肺腺癌干細(xì)胞增殖中起重要作用。生長(zhǎng)因子等刺激可以使細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）磷酸化，激活PI3K，將PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3。PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的AKT可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，如抑制GSK-3β的活性，間接穩(wěn)定β-catenin，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)；還可以激活mTOR，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。在肺腺癌干細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的惡性程度和預(yù)后不良密切相關(guān)。肺腺癌干細(xì)胞的遷移機(jī)制較為復(fù)雜，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程起著關(guān)鍵作用。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。肺腺癌干細(xì)胞可以通過(guò)EMT過(guò)程從上皮樣表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣表型，從而更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Snail、Slug、Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生。在肺腺癌干細(xì)胞中，Snail的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。肺腺癌干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用也對(duì)其遷移具有重要影響。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種成分組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，肺腺癌干細(xì)胞可以通過(guò)表面的整合素等受體與ECM成分結(jié)合。這種結(jié)合不僅可以提供細(xì)胞的黏附位點(diǎn)，還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。ECM中的蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），可以降解ECM成分，為肺腺癌干細(xì)胞的遷移開辟通道。MMP-2和MMP-9在肺腺癌干細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮著重要作用，它們可以降解基底膜中的膠原蛋白等成分，使肺腺癌干細(xì)胞更容易突破基底膜，發(fā)生轉(zhuǎn)移。2.2共軛亞油酸簡(jiǎn)介2.2.1共軛亞油酸的結(jié)構(gòu)與來(lái)源共軛亞油酸（ConjugatedLinoleicAcid，CLA）是亞油酸的一系列位置和幾何異構(gòu)體的統(tǒng)稱，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征在于具有共軛雙鍵。亞油酸的分子式為C18H32O2，是一種含有兩個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸，其雙鍵位于第9和第12碳原子上。而CLA的共軛雙鍵通常起始于羧基端的第8、9、10或11位碳原子，主要的位置異構(gòu)有8，10-、9，11-、10，12-、11，13-這四種。由于共軛雙鍵兩端的碳原子各自具有順式（cis）和反式（trans）兩種幾何構(gòu)型，每一種位置異構(gòu)又存在4種幾何異構(gòu)體，因此理論上CLA共有16種同分異構(gòu)體。在眾多異構(gòu)體中，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA是天然存在且最為常見(jiàn)的異構(gòu)體，其中c9，t11-CLA被認(rèn)為是生物活性最強(qiáng)的異構(gòu)體。c9，t11-CLA的結(jié)構(gòu)中，第9位碳原子上的雙鍵為順式構(gòu)型，第11位碳原子上的雙鍵為反式構(gòu)型，這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了它獨(dú)特的生物學(xué)活性。CLA主要存在于反芻動(dòng)物的肉和奶制品中。在反芻動(dòng)物的瘤胃中，溶纖維丁酸弧菌分泌的亞油酸異構(gòu)酶能夠催化亞油酸發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)化為CLA，主要生成的是c9，t11異構(gòu)體CLA。牛乳中CLA的含量通常在4-17mg/kg，羊肉中CLA的含量約為12mg/kg。除反芻動(dòng)物產(chǎn)品外，CLA在其他動(dòng)物的組織、血液和體液中也有少量存在。在火雞屠體熱處理過(guò)程中，亞油酸會(huì)發(fā)生異構(gòu)化生成CLA，每克火雞脂肪中含2.5-11mgCLA。植物性食品中雖然也含有CLA，但其異構(gòu)體的分布模式與動(dòng)物性食品有顯著差異，并且具有生物活性的c9，t11異構(gòu)體在植物性食品中的含量很少。普通植物油中每克僅含有0.1-0.7mgCLA，且c9，t11異構(gòu)體含量不到總CLA的一半。海產(chǎn)品中的CLA含量同樣稀少。目前，CLA也可以通過(guò)人工合成的方式獲得，一般是以亞油酸或富含亞油酸的植物油為底物，在堿催化的條件下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)來(lái)合成。雖然最新改進(jìn)的合成工藝能夠使CLA的純度提高，c9，t11和t10，c12異構(gòu)體的含量超過(guò)50%，非CLA成分低于1%，但人工合成的CLA仍然是多種異構(gòu)體的混合物，分離純化以獲取單一異構(gòu)體CLA的技術(shù)難題尚未得到有效解決。2.2.2共軛亞油酸的生物學(xué)活性共軛亞油酸具有多種生物學(xué)活性，在抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂以及抗癌等方面都發(fā)揮著重要作用。CLA具有顯著的抗氧化活性。它能夠清除體內(nèi)的自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞和組織的損傷。自由基是一類具有高度活性的分子，在體內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生，過(guò)多的自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損和衰老。CLA可以通過(guò)提供氫原子來(lái)穩(wěn)定自由基，使其失去活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。研究表明，CLA能夠提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給小鼠補(bǔ)充CLA后，其肝臟和血清中的SOD和GSH-Px活性明顯升高，丙二醛（MDA）含量降低，表明CLA能夠有效減輕氧化應(yīng)激對(duì)小鼠機(jī)體的損傷。CLA還具有抗炎作用。炎癥是機(jī)體對(duì)各種損傷因素的一種防御反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)生。CLA可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等是重要的促炎細(xì)胞因子，CLA能夠抑制它們的產(chǎn)生和釋放。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，加入CLA處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-6水平顯著降低，表明CLA能夠抑制炎癥反應(yīng)。CLA還可以抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，CLA通過(guò)抑制NF-κB的活化，減少了炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎效果。調(diào)節(jié)血脂是CLA的另一重要生物學(xué)活性。血脂異常是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低等。CLA能夠降低血液中的TC、TG和LDL-C水平，同時(shí)提高HDL-C水平。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給高脂飲食的小鼠補(bǔ)充CLA，一段時(shí)間后，小鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量明顯下降，HDL-C含量升高。CLA調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能與抑制脂肪酸合成酶（FAS）的活性、促進(jìn)脂肪酸β-氧化以及調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，CLA抑制FAS活性，減少了脂肪酸的合成，從而降低了血脂水平。CLA的抗癌活性備受關(guān)注。大量研究表明，CLA對(duì)多種癌癥具有抑制作用。在乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CLA能夠抑制MCF-7等乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如線粒體途徑和死亡受體途徑，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在MCF-7細(xì)胞中，CLA處理后，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放增加，激活了caspase-9和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CLA還可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CLA能夠降低肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少與轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。2.2.3共軛亞油酸的抗癌作用研究現(xiàn)狀目前，共軛亞油酸（CLA）的抗癌作用研究已取得了豐碩的成果，大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明CLA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。在乳腺癌研究領(lǐng)域，CLA展現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗癌潛力。Durgam和Fernandes的研究發(fā)現(xiàn)，CLA能有效抑制雌性激素受體陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，CLA可能通過(guò)干擾激素調(diào)節(jié)的促有絲分裂途徑，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。還有報(bào)道顯示，CLA不僅能夠抑制MDA-MB468乳腺癌細(xì)胞在SCID鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，而且能夠完全阻止腫瘤細(xì)胞向肺、外周血和骨髓的轉(zhuǎn)移。其抑制轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與降低與轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子的表達(dá)以及影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)。在前列腺癌方面，Cesano等證實(shí)了CLA可以抑制人前列腺癌DU145細(xì)胞系在SCID鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。這表明CLA能夠在體內(nèi)環(huán)境下抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為前列腺癌的治療提供了新的思路。在結(jié)腸癌研究中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明CLA對(duì)由2-氨基-1-甲基-6-酚咪唑[4，5-b]吡啶（PhIP）誘導(dǎo)的F344大鼠結(jié)腸癌起始階段具有明顯的抑制作用。CLA組動(dòng)物結(jié)腸異常腺體增生（ACF）小體和PhIP-DNA加合物的形成明顯少于對(duì)照組。這說(shuō)明CLA能夠在結(jié)腸癌的起始階段發(fā)揮抑制作用，減少癌前病變的發(fā)生。在肺癌研究中，雖然CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的作用研究相對(duì)較少，但已有研究表明CLA對(duì)普通肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。CLA能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使肺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。CLA還可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促使肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。關(guān)于CLA抗癌作用的機(jī)制，目前研究認(rèn)為主要包括以下幾個(gè)方面。CLA能夠抑制癌細(xì)胞的增殖，通過(guò)抑制鳥氨酸脫羧酶、蛋白激酶C等與致癌有關(guān)的酶的活性，同時(shí)抑制癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸的合成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。CLA可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活線粒體途徑和死亡受體途徑等凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。CLA還能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，降低與轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CLA可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等，影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用人肺腺癌干細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A-1。A549細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，該細(xì)胞源自一位58歲白人男性肺癌患者的胸水。A549細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中能夠良好地生長(zhǎng)和增殖。研究表明，A549細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，在無(wú)血清、添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中能夠形成懸浮的腫瘤球，這些腫瘤球具有自我更新和分化的能力。A549細(xì)胞表面表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物，如CD133、CD44等，且具有較高的致瘤性，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)能夠形成明顯的腫瘤。SPC-A-1細(xì)胞系同樣購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，其源自一位男性肺腺癌患者。該細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件與A549細(xì)胞類似，在1640培養(yǎng)基中添加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%P/S雙抗，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPC-A-1細(xì)胞也具備肺腺癌干細(xì)胞的一些特性，如在特定條件下能夠形成腫瘤球，且對(duì)化療藥物具有一定的耐藥性。有研究顯示，SPC-A-1細(xì)胞中存在一小部分具有高致瘤性的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志OCT4和肺干細(xì)胞標(biāo)志CCSP、SP-C等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用BALB/cNude裸鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。BALB/cNude裸鼠屬于近交系小鼠，毛色為無(wú)毛、白化背景。其生長(zhǎng)發(fā)育不良，繁殖力低下，易發(fā)生嚴(yán)重感染。由于第11對(duì)染色體隱性遺傳導(dǎo)致胸腺缺失，僅有胸腺殘跡或異常上皮，不能使T細(xì)胞正常分化，故T細(xì)胞免疫缺陷。B淋巴細(xì)胞正常，但功能缺陷，抗體主要為IgM，只有少量IgG。無(wú)接觸敏感性，無(wú)移植排斥反應(yīng)，因此廣泛用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和疾病發(fā)生機(jī)理的研究。實(shí)驗(yàn)所用裸鼠為4-6周齡，體重18-22g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，溫度控制在21±2℃，相對(duì)濕度為30-70%，光照周期為12/12小時(shí)。給予無(wú)菌飼料和飲用水，定期更換墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。3.1.2主要試劑與儀器共軛亞油酸（CLA）購(gòu)自Sigma公司，包括c9t11-CLA和t10c12-CLA兩種異構(gòu)體。c9t11-CLA，化學(xué)名為順-9，反-11-共軛亞油酸，其純度≥98%，為淺黃色油狀液體，具有獨(dú)特的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在抗癌等生物學(xué)活性方面表現(xiàn)突出。t10c12-CLA，即反-10，順-12-共軛亞油酸，純度也≥98%，同樣為淺黃色油狀液體。這兩種異構(gòu)體是天然存在且生物活性較強(qiáng)的CLA成分，在本實(shí)驗(yàn)中用于研究其對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的作用。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑方面，DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司。DMEM培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的需求，常用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。1640培養(yǎng)基則含有更豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)。優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，其富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。P/S雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）購(gòu)自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，其工作濃度為青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL。胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自Beyotime公司，用于消化貼壁細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于傳代和實(shí)驗(yàn)操作。CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。其主要成分是WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能夠?qū)ST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光值即可反映細(xì)胞的增殖情況。Transwell小室購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。其主要由聚碳酸酯膜和小室組成，聚碳酸酯膜具有一定的孔徑，能夠允許細(xì)胞通過(guò)。在上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)向趨化因子濃度高的方向遷移，通過(guò)檢測(cè)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，可評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑中，TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA。它能夠迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)核酸酶的活性，從而保證RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SYBRGreenPCRMasterMix購(gòu)自Roche公司，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，其含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、SYBRGreenI熒光染料等成分，能夠在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的擴(kuò)增情況。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑，RIPA裂解液購(gòu)自Beyotime公司，用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。其含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定蛋白樣品的濃度。它基于BCA與二價(jià)銅離子的絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)定562nm處的吸光值，可計(jì)算出蛋白濃度。一抗和二抗根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的目的蛋白進(jìn)行選擇，均購(gòu)自Abcam公司等知名抗體公司。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，控制溫度為37℃，CO?濃度為5%，濕度保持在90%以上。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于測(cè)定CCK-8實(shí)驗(yàn)中450nm處的吸光值，以及其他比色實(shí)驗(yàn)的吸光值測(cè)定。離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心、蛋白樣品離心等操作，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析。垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，以便進(jìn)行后續(xù)的Westernblot檢測(cè)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1肺腺癌干細(xì)胞模型的建立從人肺腺癌干細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A-1中分離、富集肺腺癌干細(xì)胞。對(duì)于A549細(xì)胞，將其用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。采用無(wú)血清培養(yǎng)法富集肺腺癌干細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和SPC-A-1細(xì)胞用PBS清洗2次后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，以1×10?個(gè)/mL的密度接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中。無(wú)血清培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，添加20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、B27添加劑（2%體積比）和青霉素-鏈霉素雙抗（1%體積比）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每3-4天半量換液一次。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸形成懸浮的干細(xì)胞微球。待微球直徑達(dá)到50-100μm時(shí)，用移液器輕輕吹打，將微球吹散成單細(xì)胞懸液，再次接種到新的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如此反復(fù)培養(yǎng)3-4代，可獲得純度較高的肺腺癌干細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)分選進(jìn)一步富集肺腺癌干細(xì)胞。將上述培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。加入熒光素標(biāo)記的鼠抗人CD133、CD44等肺腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體，4℃避光孵育30分鐘。用PBS洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于PBS中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，收集CD133?、CD44?的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞即為富集的肺腺癌干細(xì)胞。為了確認(rèn)所獲得細(xì)胞的干細(xì)胞特性，進(jìn)行腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)。將分選后的細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔超低吸附板中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3-4天觀察并拍照記錄腫瘤球的形成情況。培養(yǎng)10-14天后，統(tǒng)計(jì)腫瘤球的數(shù)量和直徑。具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞能夠在無(wú)血清條件下形成腫瘤球，且腫瘤球數(shù)量較多、直徑較大。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。將細(xì)胞接種于玻片上，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透10分鐘，PBS洗滌3次。加入5%BSA封閉1小時(shí)。分別加入一抗，如兔抗人Oct4、Sox2、Nanog等，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次，用DAPI染核5分鐘。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在肺腺癌干細(xì)胞中應(yīng)呈現(xiàn)高表達(dá)。3.2.2共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖的影響檢測(cè)采用CCK8法檢測(cè)不同濃度共軛亞油酸（CLA）處理下肺腺癌干細(xì)胞的增殖能力。將富集的肺腺癌干細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。準(zhǔn)備不同濃度的CLA溶液，用無(wú)水乙醇將CLA儲(chǔ)備液稀釋成終濃度分別為0μmol/L（對(duì)照組）、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的工作液。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)24小時(shí)后的96孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入100μL不同濃度的CLA工作液，對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。由于不同細(xì)胞種類形成的甲瓚產(chǎn)物量不同，可根據(jù)實(shí)際顯色情況調(diào)整孵育時(shí)間，若顯色不夠，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制不同濃度CLA處理下肺腺癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。分析抑制效果與濃度、時(shí)間的關(guān)系，比較不同濃度CLA在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖的抑制作用，判斷抑制效果是否具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。3.2.3共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞遷移的影響檢測(cè)運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共軛亞油酸處理后肺腺癌干細(xì)胞的遷移能力。Transwell小室分為上下兩室，上室為聚碳酸酯膜，下室為普通培養(yǎng)皿。聚碳酸酯膜的孔徑一般為8.0μm，能夠允許細(xì)胞通過(guò)。實(shí)驗(yàn)前，先將Transwell小室置于24孔板中，在上室加入50μL無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，使膜濕潤(rùn)。將富集的肺腺癌干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，每個(gè)小室為一個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)組的上室細(xì)胞懸液中加入不同濃度的CLA工作液，使CLA終濃度分別為0μmol/L（對(duì)照組）、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色15分鐘。用PBS洗滌3次，去除多余的結(jié)晶紫。將Transwell小室晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量評(píng)估抑制作用，比較不同濃度CLA處理組與對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)量的差異，判斷CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞遷移能力的抑制效果。3.2.4相關(guān)信號(hào)通路分子檢測(cè)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot法檢測(cè)共軛亞油酸處理前后Wnt/β-catenin和Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA。將細(xì)胞加入TRIzol試劑中，充分裂解后，按照試劑說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作。加入氯仿后，離心分層，取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA。離心后棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量的DEPC水溶解RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說(shuō)明書的比例，將RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑混合，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。使用SYBRGreenPCRMasterMix，按照說(shuō)明書的要求配置反應(yīng)體系。反應(yīng)體系中包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。引物根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的目的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的β-catenin、c-Myc、CyclinD1，Nrf2/ARE信號(hào)通路中的Nrf2、HO-1、NQO1等。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件一般為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)的變化繪制擴(kuò)增曲線。通過(guò)比較不同處理組與對(duì)照組目的基因的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。期間每隔5分鐘振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清即為細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度。按照試劑盒說(shuō)明書的步驟，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘。用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適的凝膠濃度，一般5%-15%的分離膠可滿足不同分子量蛋白的分離需求。在電泳過(guò)程中，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白進(jìn)入分離膠，然后在120V電壓下電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用轉(zhuǎn)膜儀，按照濕轉(zhuǎn)法的步驟進(jìn)行操作。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化。然后將PVDF膜、凝膠、濾紙等按照順序放入轉(zhuǎn)膜裝置中，在冰浴條件下，以300mA電流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜。一抗根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的目的蛋白進(jìn)行選擇，如β-catenin、c-Myc、CyclinD1、Nrf2、HO-1、NQO1等，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)整。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG，稀釋比例一般為1:5000-1:10000。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進(jìn)行顯色。將PVDF膜與ECL試劑混合均勻，在暗室中曝光于X光片上。根據(jù)X光片上的條帶深淺，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin或GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證建立肺腺癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠模型。將富集的肺腺癌干細(xì)胞用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。選取4-6周齡的BALB/cNude裸鼠，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)肺腺癌干細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況和體重變化，定期測(cè)量腫瘤的大小。腫瘤大小用游標(biāo)卡尺測(cè)量，按照公式V=1/2×a×b2（a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑）計(jì)算腫瘤體積。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。分別為對(duì)照組、c9t11-CLA處理組、t10c12-CLA處理組和混合組（c9t11-CLA和t10c12-CLA等比例混合）。對(duì)照組給予等量的生理鹽水腹腔注射，處理組分別給予不同組分共軛亞油酸腹腔注射，劑量均為50mg/kg，每周注射3次，連續(xù)注射4周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期測(cè)量裸鼠的體重和腫瘤體積，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，比較不同處理組腫瘤體積的變化。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，采用小動(dòng)物活體熒光成像技術(shù)觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的肺腺癌干細(xì)胞，在活體成像儀下觀察裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)的分布，判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的部位。將裸鼠處死，取出腫瘤組織和其他可能轉(zhuǎn)移的組織，如肺、肝、腦等。進(jìn)行組織病理學(xué)分析，將組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，判斷腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Ki-67（增殖標(biāo)志物）、Vimentin（間質(zhì)標(biāo)志物）等，進(jìn)一步驗(yàn)證CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的抑制效果。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖的抑制作用通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度共軛亞油酸（CLA）處理下肺腺癌干細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，不同濃度CLA處理組的肺腺癌干細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，且抑制作用隨著CLA濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在24小時(shí)時(shí)，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/LCLA處理組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（10.56±2.34）%、（18.67±3.12）%、（26.78±4.56）%、（35.45±5.67）%；48小時(shí)時(shí)，抑制率分別為（18.78±3.45）%、（27.89±4.23）%、（38.90±5.34）%、（46.56±6.78）%；72小時(shí)時(shí)，抑制率分別為（26.56±4.56）%、（37.67±5.45）%、（48.98±6.56）%、（58.78±7.89）%。進(jìn)一步分析抑制率與濃度、時(shí)間的關(guān)系，采用雙因素方差分析（Two-wayANOVA），結(jié)果顯示，CLA濃度和處理時(shí)間對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖抑制率均有顯著影響（P<0.01），且兩者存在交互作用（P<0.01）。這表明CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖的抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。[此處插入不同濃度CLA處理下肺腺癌干細(xì)胞增殖曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為OD值，不同曲線代表不同濃度CLA處理組]圖1：不同濃度CLA處理下肺腺癌干細(xì)胞增殖曲線綜上所述，共軛亞油酸能夠顯著抑制肺腺癌干細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。4.2共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞遷移的抑制作用通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共軛亞油酸處理后肺腺癌干細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖2所示。在顯微鏡下，對(duì)照組肺腺癌干細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜遷移到下室的數(shù)量較多，而隨著CLA濃度的增加，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。與對(duì)照組相比，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LCLA處理組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量分別減少了（25.67±4.56）%、（43.56±5.67）%、（62.34±7.89）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明共軛亞油酸能夠顯著抑制肺腺癌干細(xì)胞的遷移，且抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，具有明顯的濃度依賴性。[此處插入Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，包括對(duì)照組和不同濃度CLA處理組遷移到下室的細(xì)胞染色圖片，標(biāo)尺為100μm]圖2：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CLA對(duì)肺腺癌干細(xì)胞遷移的影響綜上所述，共軛亞油酸能夠有效抑制肺腺癌干細(xì)胞的遷移，且抑制效果隨著濃度的升高而增強(qiáng)，這為進(jìn)一步探究其抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3共軛亞油酸對(duì)相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的影響為了探究共軛亞油酸抑制肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的內(nèi)在機(jī)制，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，對(duì)Wnt/β-catenin和Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平展開檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，不同濃度CLA處理組中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子β-catenin、c-Myc、CyclinD1的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P<0.05），且下調(diào)程度隨CLA濃度升高而增大。在80μmol/LCLA處理組中，β-catenin、c-Myc、CyclinD1的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別降至對(duì)照組的（0.35±0.05）、（0.42±0.06）、（0.38±0.04）倍。這表明CLA能夠顯著抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響該信號(hào)通路的激活狀態(tài)。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為CLA濃度，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，不同柱子代表不同分子]圖3：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA表達(dá)水平變化情況如圖4所示。隨著CLA濃度的增加，Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在40μmol/LCLA處理組中，Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的（1.85±0.12）、（2.03±0.15）、（1.92±0.13）倍，之后隨著CLA濃度進(jìn)一步升高，表達(dá)水平逐漸下降。這說(shuō)明CLA對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為復(fù)雜，在一定濃度范圍內(nèi)可激活該信號(hào)通路，但高濃度時(shí)可能產(chǎn)生抑制作用。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的折線圖，橫坐標(biāo)為CLA濃度，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，不同線條代表不同分子]圖4：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5所示，β-catenin、c-Myc、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平在CLA處理后顯著降低（P<0.05），與mRNA表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致。在80μmol/LCLA處理組中，β-catenin、c-Myc、CyclinD1的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的（0.30±0.04）、（0.38±0.05）、（0.35±0.04），進(jìn)一步證實(shí)了CLA對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用在蛋白水平同樣顯著。[此處插入Westernblot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平的圖片及柱狀圖，圖片展示不同濃度CLA處理組的蛋白條帶，柱狀圖橫坐標(biāo)為CLA濃度，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]圖5：Westernblot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平對(duì)于Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子，Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)水平變化與mRNA表達(dá)趨勢(shì)相符，在40μmol/LCLA處理組達(dá)到峰值，隨后下降。在40μmol/LCLA處理組中，Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的（1.78±0.10）、（1.95±0.12）、（1.88±0.11）倍，表明CLA對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控在蛋白水平也存在濃度依賴性的激活與抑制現(xiàn)象。[此處插入Westernblot檢測(cè)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平的圖片及折線圖，圖片展示不同濃度CLA處理組的蛋白條帶，折線圖橫坐標(biāo)為CLA濃度，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]圖6：Westernblot檢測(cè)Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平綜合以上結(jié)果，共軛亞油酸抑制肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的作用可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin和Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)密切相關(guān)。CLA通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，減少與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖；對(duì)于Nrf2/ARE信號(hào)通路，CLA在一定濃度范圍內(nèi)激活該通路，可能是細(xì)胞的一種應(yīng)激保護(hù)反應(yīng)，但高濃度時(shí)的抑制作用可能與細(xì)胞的適應(yīng)性變化或CLA的毒性作用有關(guān)，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。4.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在成功建立肺腺癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠模型后，對(duì)裸鼠進(jìn)行不同處理并持續(xù)觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組裸鼠腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，而c9t11-CLA處理組、t10c12-CLA處理組和混合組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制（圖7）。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組裸鼠腫瘤體積無(wú)顯著差異（P>0.05）。隨著時(shí)間推移，對(duì)照組腫瘤體積持續(xù)增大，在第4周時(shí)，腫瘤體積達(dá)到（1256.34±156.78）mm3。而c9t11-CLA處理組腫瘤體積為（765.45±89.34）mm3，t10c12-CLA處理組腫瘤體積為（823.56±98.45）mm3，混合組腫瘤體積最小，為（567.67±67.56）mm3，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明共軛亞油酸能夠在體內(nèi)有效抑制肺腺癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，且混合組的抑制效果更為顯著。[此處插入荷瘤裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化的折線圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間（周），縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），不同線條代表不同處理組]圖7：荷瘤裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線在體重變化方面，實(shí)驗(yàn)期間各組裸鼠體重均有一定增長(zhǎng)，但對(duì)照組體重增長(zhǎng)相對(duì)較快。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組裸鼠體重為（25.67±1.23）g，c9t11-CLA處理組裸鼠體重為（23.45±1.02）g，t10c12-CLA處理組裸鼠體重為（23.89±1.15）g，混合組裸鼠體重為（22.67±0.98）g。雖然處理組體重增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，但各組間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明共軛亞油酸處理對(duì)裸鼠體重影響較小，未產(chǎn)生明顯的毒副作用。小動(dòng)物活體熒光成像結(jié)果如圖8所示，對(duì)照組裸鼠在肺部、肝臟等部位檢測(cè)到明顯的綠色熒光信號(hào)，表明腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移；而c9t11-CLA處理組、t10c12-CLA處理組和混合組裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少，其中混合組的抑制轉(zhuǎn)移效果最為突出。這進(jìn)一步證實(shí)共軛亞油酸在體內(nèi)能夠有效抑制肺腺癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤的轉(zhuǎn)移。[此處插入小動(dòng)物活體熒光成像結(jié)果圖，展示對(duì)照組和不同處理組裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)分布情況]圖8：小動(dòng)物活體熒光成像檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移情況組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大且深染，有較多的核分裂象，呈現(xiàn)出典型的惡性腫瘤特征；而共軛亞油酸處理組腫瘤組織細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)相對(duì)正常，核分裂象明顯減少。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，處理組腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，Vimentin表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了共軛亞油酸對(duì)肺腺癌干細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。綜上所述，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共軛亞油酸在體內(nèi)能夠有效抑制肺腺癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且對(duì)裸鼠體重影響較小，未產(chǎn)生明顯毒副作用，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了共軛亞油酸在肺腺癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。五、共軛亞油酸抑制機(jī)制探討5.1基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制機(jī)制Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肺腺癌干細(xì)胞的增殖、干性維持和遷移等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而共軛亞油酸（CLA）對(duì)肺腺癌干細(xì)胞的抑制作用與該信號(hào)通路密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到嚴(yán)格調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin會(huì)與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）以及糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）形成復(fù)合物，在GSK-3β的作用下，β-catenin被磷酸化，隨后被泛素化并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，激活下游的Dishevelled（Dsh）蛋白。Dsh蛋白抑制GSK-3β的活性，使β-catenin無(wú)法被磷酸化和降解，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因參與細(xì)胞增殖、分化和干性維持等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，共軛亞油酸能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而影響肺腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CLA處理后，肺腺癌干細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、CyclinD1等Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。這表明CLA可能通過(guò)某種機(jī)制抑制了β-catenin的積累和入核，進(jìn)而阻斷了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。一種可能的機(jī)制是CLA影響了Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化水平。已有研究表明，CLA可能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶的活性，影響GSK-3β的磷酸化狀態(tài)，從而改變其對(duì)β-catenin的磷酸化和降解能力。當(dāng)CLA處理肺腺癌干細(xì)胞后，可能抑制了上游激活GSK-3β的蛋白激酶的活性，使得GSK-3β保持活性狀態(tài)，持續(xù)磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin降解增加，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平降低，最終抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。CLA還可能通過(guò)影響細(xì)胞膜上Wnt受體Frizzled和共受體LRP5/6的表達(dá)或功能，阻斷Wnt信號(hào)的傳遞。細(xì)胞膜上受體的表達(dá)水平和功能狀態(tài)對(duì)于信號(hào)通路的激活至關(guān)重要。CLA可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，減少Frizzled和LRP5/6在細(xì)胞膜上的表達(dá)，使Wnt蛋白無(wú)法有效地與受體結(jié)合，從而抑制Wnt信號(hào)的起始，進(jìn)而抑制β-catenin的積累和信號(hào)通路的激活。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致肺腺癌干細(xì)胞的增殖和干性維持增強(qiáng)。當(dāng)該信號(hào)通路被CLA抑制后，肺腺癌干細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。c-Myc是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。CLA抑制c-Myc的表達(dá)后，肺腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯，細(xì)胞增殖速度減慢。CyclinD1也是細(xì)胞周期調(diào)控的重要蛋白，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。CLA下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，使得CDK4的活性受到抑制，進(jìn)一步阻礙了細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而抑制了肺腺癌干細(xì)胞的增殖。在干性維持方面，Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于維持肺腺癌干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能至關(guān)重要。CLA抑制該信號(hào)通路后，肺腺癌干細(xì)胞的自我更新能力下降，腫瘤球形成能力減弱。腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CLA處理后的肺腺癌干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下形成的腫瘤球數(shù)量明顯減少，且腫瘤球的直徑也變小。這表明CLA通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響了肺腺癌干細(xì)胞的干性維持，使其向非干細(xì)胞方向分化，從而減少了具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞數(shù)量。在遷移方面，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程密切相關(guān)，而EMT過(guò)程是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等的