常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)

由于核酸分子雜交口勺高度特異性及檢測措施的敏捷性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本

技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆H勺篩選，酶切圖譜的制作，基因序列H勺定量和定性分析及基因

突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定H勺條件下（合適的溫室

度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,

待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核

酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)識的，能與特定日勺核酸序列發(fā)生特異性

互補的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為CDNA探針、基因組探針、寡核首

酸探針、RNA探針等。

周相雜交

固相雜交（solid-phasehybridization）是將變性口勺DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或

尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。

斑步雜交（dothybridization）

是道先將被測日勺DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的J標(biāo)識好日勺DNA或RNA探

針進(jìn)行雜交。該法H勺特點是操作簡樸，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，

可在同一張膜上同步進(jìn)行多種樣品口勺檢測；根據(jù)斑點雜并的成果，可以推算出雜交陽性日勺拷

貝數(shù)。該法日勺缺陷是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，并且特異性較差，有一定比例口勺假

陽性。

印跡雜交(blottinghybridization)

Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并

在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對

應(yīng)構(gòu)造的已標(biāo)識日勺探針進(jìn)行那時交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測特定大小分子

的含量?？蛇M(jìn)行克隆基因的酸切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及

限制性長度多態(tài)性分析(RELP)等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二

醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子

的量與大小。該法是研究基因體現(xiàn)常用的措施，可推臬出癌基因的體現(xiàn)程度。

差異雜交(differentialhyoridization)

是將基因組文庫口勺重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合日勺不一樣cDNA探

針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的jmRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交,

分析兩張濾膜上對應(yīng)位置雜交信息以分離差異體現(xiàn)日勺基因。合用于基因組不太復(fù)雜的）真核生

物（如酵母）體現(xiàn)基因的比較，假陽性率較低。但對基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人）,

則因工作量太大，體現(xiàn)的序列所占比例較低（僅5%左右），價值不大。

cDNA微點隈雜交（cDNAmicroarrayhybridization）

是指將CDNA克隆或CDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如:

尼龍膜或活化日勺載玻片）以微點陣，然后用混合日勺不?柱DNA探針與微點陣上的JDNA進(jìn)行

雜交。再運用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點陣上H勺雜交信息。它比差異雜

交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，合用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺陷是無法克

服保守的同源序列及重序?qū)?雜交信息日勺干擾。

寡核甘酸微點隈雜交（oligonucleotidemicroarrayhybridization）

是在特殊的固相支持物上原位合成寡核甘酸，使它共價結(jié)合于支持物表面，與平均長度為

20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和敏捷度。應(yīng)用共聚焦顯

微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。合用于低豐度mRNA11勺檢測，以辨別基因家族不

一樣組員的差異體現(xiàn)特性，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不一樣組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作

量較大、成本較高、速度較慢等弱點。

液相雜交(solutionhbridization)

指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)識的已知的酸單鏈(探針)在溶液中保溫，使之形

成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然

后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測H勺核酸量。

遞減雜交(subtractivehybridizatio)

是運用兩種來源一致而功能不一樣日勺組織細(xì)胞提取mRNA(或逆轉(zhuǎn)錄成時CDNA)，在一定日勺

條件卜.以過量H勺驅(qū)動mRNA或CDNA與測試日勺單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過羥

基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源口勺雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相似的基因

成分，保留特異體現(xiàn)的目的基因或工基因片段。后來者篩選cDNA文庫，可獲得特異體現(xiàn)日勺

目依J基因cDNA全長序列，

核酸原位雜交

用特定標(biāo)識的已知次序核酸作為探針與細(xì)胞級或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對其實行

檢測的措施，稱為核酸原位雜交(nucleicacidhybridizationinsitu)。用來檢測DNA在細(xì)胞

核或染色休上口勺分布，與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因體現(xiàn)水閏：還

用于細(xì)胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。

該法的長處是特異性高，可精確定位；能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同

一組織中其他成分口勺影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高

的敏感性;并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)H勺研究，如基

因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量,

措施更為完善。

DNA分子克隆技術(shù)(也稱基因克隆技術(shù))

在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子

克隆(或基因克隆)。其基本環(huán)節(jié)包括：制備目口勺基因一將目的基因與載體用限制性內(nèi)切能切

割和連接，制成DNA重組一導(dǎo)入宿主細(xì)胞一篩選、鑒定一擴增和體現(xiàn)。載體(vecors)在

細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動重組的I分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。重要

目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相似的分子克隆，

就可以深入分析基因的構(gòu)造與功能，伴隨引入的DNA片段不一樣，有兩種DNA庫，一種是

基因組文庫(genomiclibrary),另一種是cDNA庫。

載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和體現(xiàn)的工具。

細(xì)菌質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀構(gòu)造的DNA,分子大小為l-20kb,對細(xì)菌日勺某

些代謝活動和抗藥性表型具有一定口勺作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒H勺基礎(chǔ)上人工改造拼接而

成。最常用日勺質(zhì)粒是PBR322,

噬菌體(phaeg)噬菌體是感染細(xì)菌H勺病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用

野生型人噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA,基因組約為50kb,最常用R勺曉

菌體為入DNA及其衍生系列。

黏性質(zhì)粒(cosmid)是力質(zhì)粒與噬菌體XDNA構(gòu)成日勺?種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。

體現(xiàn)型載體將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體口勺基因序列構(gòu)成

了體現(xiàn)型載體。

基因庫的建造

具有某種生物體所有基歷時隨機片段的重組DNA克隆群體，其具有感光趣的基因片段口勺重

組子，可以通過標(biāo)識探針與基因庫中的重組子雜交等措施而篩選出來，所得到的克隆通過純

化和擴增，可用于進(jìn)一步的研。其主環(huán)節(jié)包括：(1)構(gòu)建基因庫迅速的載體；(2)DNA片

段的制備；(3)DNA片段與載體DNAU勺連接；(4)包裝和接種。

cDNA庫日勺建造

是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酹自mRNA制備的cDNA。cDNA庫包括某特定細(xì)胞口勺所

有CDNA克隆的文庫，不含內(nèi)含子。

特異基因的篩選

常用的措施有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測法，檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選

目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進(jìn)行特異

基因的篩選。

核酸序列測定

DNA的堿基序列決定著基因日勺特性，DNA序列分析（測序，sequencing）是分子生物學(xué)重

要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選H勺癌基因或經(jīng)PCR法擴增H勺基因，最終均需進(jìn)行核酸

序列分析，可藉以理解基因H勺精細(xì)構(gòu)造，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功

能的影響，協(xié)助人工俁成基因、設(shè)計引物，以及研究腫揄的分子發(fā)病機制等。測序是在高辨

別率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)口勺基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的措施有

Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已經(jīng)有DNA序列自動測定儀

問世。化學(xué)降解法是在DNA的片段的）5'端標(biāo)識核素，然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異

地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)識端延伸口勺片段供測讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀

出200-250個核苜酸序列。雙脫氧法是采用核甘酸鏈終止劑,如：2',3'一雙脫氧核昔三磷

酸ddNTP（如ddTTP、ddTTP.ddGTP和ddCTP中的一種）摻入到DNA鏈中以終止鏈依J延長，

與摻入4種正常R<JdNTPrJ混合物提成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不一

樣專一性核甘酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成H勺

DNA核甘酸序列，根據(jù)堿基q補原則，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，反復(fù)性好，輕易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核昔

酸引物及高質(zhì)量日勺DNA聚合酶，便伴隨M13噬菌體載體的發(fā)明和運用，合成的引物輕易獲

得，測序技術(shù)不停改善，故此法已被廣泛應(yīng)用。基脫氧法的自動激光熒光測序儀，使測工作

更迅速和簡便，并且保證高度反復(fù)性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

后同測序，然后反推RNA序列

聚合陋鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù)，是一種運用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA

片斷高效擴增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（甚至少到1個拷貝）。在模板DNA、引物和四種

脫氧核糠核甘酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用很少許模板，在

一對引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時內(nèi)可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應(yīng)分三步：變性、退

火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一種的模板，這樣通過九小時的循環(huán),

每一循環(huán)B勺產(chǎn)物作為種循環(huán)日勺模板，這樣通過數(shù)上時的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異

性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94c變性30秒，55c退火30秒，70-72C延伸30-60秒，

共進(jìn)行30次循環(huán)左右，最終再延伸72c5分鐘，4c冷卻終止反應(yīng)。

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的措施。

2.競爭逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitivereversetranscription-pclymerasechainrectionC-RT-PCR)

低豐度RNA定量的好措施。

3.多重PCR(multiplesPCR)在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長，發(fā)生

多處缺失的般狡@丁?嬖荒0宓募父鑾頡?br>

4.多種PCR可同步加入多套以生物素標(biāo)識的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。

5.反向PCR(iversepolymerasechainreaction)對一種己知日勺DNA片段兩側(cè)W、J未知序列進(jìn)

行擴增和研究。

6.不對稱PCR在擴增循環(huán)中引入不一樣引物濃度，以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測定，以理解

目的基因的序列。

7.錨定PCR(anchoredpolymerasechainreaction)協(xié)助克服序列未知或序列未全知帶來H勺

障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補H勺引物連接于一?段帶限制性內(nèi)切酶位點H勺錨

上，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用卜，將未知序列擴增出來。

8.著色互補試驗或熒光PCR（colorcomplementationassayorfluorescentPCR）原理是用

不一樣熒光染粒，分別標(biāo)識于不一樣寡核甘酸引物上，同步擴增多種DNA片段，反應(yīng)完畢

后，運用分子篩選去多出的引物。用紫外線照射擴增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染

料顏色的組合，假如某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合，假如某一DNA區(qū)帶缺失，則會

缺乏對應(yīng)的顏色。

9.雙溫PCR（two-temperaturePCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般

常用溫度是94-95C和4M7C?？梢蕴岣叻磻?yīng)的速度和特異性。

上述這些PCR技術(shù)日勺應(yīng)用：（1）PCR技術(shù)擴增特定序列為基礎(chǔ)，采用多種措施進(jìn)行檢測，

如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過

選擇性擴增CDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過選擇性擴增CDNA中的特殊片

段，產(chǎn)生針對尚未克隆的基因的探針；（3）從微量mRNA中產(chǎn)生CDNA文庫；（4）產(chǎn)生大

量用于序列分析的DNA；（5）分析基因突變；（6）做染色體步移。

10.原位PCR技術(shù)：PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的多種標(biāo)本的DNA,

但擴增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位，因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特性相

聯(lián)絡(luò)，這是該技術(shù)一種局限性。原位雜交雖具有良好H勺定位能力，但由于其敏感性問題，尤

其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（InsituPCR,

簡稱ISPCR）,它可使擴增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR

和原位雜交的局限性，具有良好H勺應(yīng)用前景。目前，己經(jīng)有多種設(shè)計日勺原位PCR擴增儀系

統(tǒng)問世，使操作簡便，軟件靈活，已成為拉增固定細(xì)胞那石蠟包埋組織中特定DNA和RNA

序列的有用工具。

ISPCR的技術(shù)特點

（1）既具有PCR的特異性與高敏捷性，又具有原位雜交日勺定位精確性；（2）測到低于2個

拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列，甚至可檢測出單一細(xì)胞中的僅含一種拷貝的原病毒DNA：

（3）有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析；（4）可用于正常或惡性

細(xì)胞，感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。

ISPCR日勺基本措施

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)H勺綾事，實質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再

進(jìn)行原位雜交的技術(shù)，操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過程，首先在合適處理的細(xì)胞和組

織切片上滴加PCR反應(yīng)液，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴增，最終通過標(biāo)識的探針

進(jìn)行原位雜交檢測擴增產(chǎn)物。

初步應(yīng)用

有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功日勺第一篇報道是對感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)

從一細(xì)胞中檢查，通過PCR擴增，僅用150堿基對H勺短探針就可通過ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)

的visna病毒。從開始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴增后再涂片做ISH（原位雜交）檢查，已發(fā)展到

用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織措施做原位PCR檢查。有老式的標(biāo)識探針R勺原

位PCR法（間接法），也有將標(biāo)識物先標(biāo)識PCRII勺引物，讓標(biāo)識物擴增后再行ISH檢查的

直接法。因此，目前就原位PCR措施而言，尚未能獲得統(tǒng)一，也即未能比較出哪一種措施

最可靠簡便，各家報道的原位PCR技術(shù)中，在標(biāo)本處理和種類上尚不?樣（細(xì)胞懸液、涂

片、組織切片等），想檢測日勺靶核酸也不一樣（病毒或體細(xì)胞口勺DNA或mRNA）,擴增日勺措

施上有不一樣（單引物、多引物），最終顯示的措施也不一樣（直接法、間接法）。這些還均

有待在此后口勺工作中積累經(jīng)驗，以求一致。

原位PCR應(yīng)用的課題，目前正片于開始階段，還很局限，對人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝

基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不一樣亞型的測定，歸納起來，重要

應(yīng)用于兩方面；（1）檢測外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、

CMV等;（2）內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Igl向mRNA

片段、癌基因片段等。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將特定的遺傳信息傳遞到真核細(xì)胞中，這種能力不僅革新了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中許多基本問題的

研究，也推進(jìn)了診斷和治療方面的分子技術(shù)發(fā)展，并使基因治療成為也許。目前基因轉(zhuǎn)移技

術(shù)已廣泛用于基因口勺構(gòu)造和功能分析、基因體現(xiàn)與調(diào)控、基因治療與轉(zhuǎn)基因動物等研究。本

部分將簡介目前基因轉(zhuǎn)移的重要措施；重點簡介基因轉(zhuǎn)移的病毒措施的基因轉(zhuǎn)染

(transfection)技術(shù)。

基因運載系統(tǒng)

將某一特定日勺靶基因傳遞到靶細(xì)胞，需要應(yīng)用某一基因運載系統(tǒng)，目前將這一系統(tǒng)概括為兩

大類：非病毒辣措施和病毒措施。

1.基因轉(zhuǎn)移的非病毒措施

直接注射法將具有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細(xì)胞攝入DNA燕進(jìn)行體現(xiàn),

在肌細(xì)胞中，基因體現(xiàn)可持續(xù)數(shù)月。

磷酸鈣共沉淀法將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀，附著于細(xì)胞

膜并通過細(xì)胞內(nèi)存作用耐是入細(xì)胞質(zhì)。該措施的轉(zhuǎn)化效率一般很低。

脂質(zhì)體乘法指質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運載外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞日勺載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)

的基因轉(zhuǎn)移日勺最大優(yōu)勢在于能在活體內(nèi)應(yīng)用。

受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移依托受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

措施是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細(xì)胞表面

的肥體所識別。如若將DNA在體內(nèi)運送至肝內(nèi)，可以選將DNA和能與肝細(xì)胞受體特異結(jié)合

的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過細(xì)胞內(nèi)吞過程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝

取。應(yīng)用該措施轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的體現(xiàn)持續(xù)時間較短，在評估實際應(yīng)用前影上還在

某些問題。

顯微注射法在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細(xì)胞玻璃針地接注入細(xì)胞，該法適合于多種培養(yǎng)生長

的細(xì)胞，但需要一定的設(shè)備和操作用支巧。

電穿孔法運用脈沖場將DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。

微粒子轟擊法（基因槍）近幾年發(fā)展較快的轉(zhuǎn)移措施。使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入培

胞或活的哺乳動物組織內(nèi)。亞微粒的鈣和金能自發(fā)地吸附DNA,將這些微彈加強速到很的

速度轟擊細(xì)胞。試驗成果表明，用這種措施靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細(xì)

胞中體現(xiàn)。

胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞是從受精卵開始分裂至4個國胞階段未分化和具有多種潛能H勺生

殖細(xì)胞，能在體外培養(yǎng)，可作為正面細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因動物，以研究基因定向整合或基因剔

險及基因及能。

精子載體法近來發(fā)現(xiàn)用精子和NDA一劑孵育，可捕捉得DNA。通過受精過程，將外源性基

因?qū)胧芫?，可捕捉得物物，大大間化了轉(zhuǎn)基因動物H勺制備過程。

2.基因轉(zhuǎn)移的病毒的措施

病毒作為基因轉(zhuǎn)移時是基為遞送有有并工具，病毒載體時長處有：（1）在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中傳播

重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分：（2）在也許將有有制陷日勺或突變的基因置于病毒調(diào)

整信號的控制下以進(jìn)行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分，并能進(jìn)分

離；（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其重要缺陷是病毒載體對外源基因的最大容納最只有2500bp。目

前常用的病毒載體有下列幾種。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上，

病毒進(jìn)入細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄作用，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進(jìn)入細(xì)胞核并整合

在細(xì)胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端反復(fù)序列

（LTR）,LTR內(nèi)側(cè)尚有為復(fù)制所必需的其他次序，包括包裝信號。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體

有CMV和SVo

DNA病毒載體重要有腺病毒有關(guān)病毒載體，腺端正毒我體，皰疹病毒載體。對DNA病毒

載體的研究是目前基因基因治療研究中的重點領(lǐng)域o

常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定H勺載體和導(dǎo)入措施，基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的具有靶基因H勺

質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)體現(xiàn)。轉(zhuǎn)染措施有多種，根據(jù)不一樣的細(xì)胞，貼壁或懸

浮細(xì)所可選用不一樣的措施，其目的是要到達(dá)設(shè)置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的原因有多種，

包括轉(zhuǎn)染措施、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度、靶細(xì)胞的生長狀態(tài)等，下面重點簡介向幾種

常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)：

靶細(xì)胞的）準(zhǔn)備被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長狀態(tài)怎樣，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。

如為貼壁生長H勺細(xì)胞，一股規(guī)定在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種

于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿依J60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時換一將

近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細(xì)胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。

靶基因質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備汨于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其了化學(xué)物質(zhì)的污

染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。應(yīng)用酚一氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以到達(dá)此原

則，F(xiàn)I前大多采用進(jìn)口的術(shù)提取純化試劑盒。

詳細(xì)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)H勺轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法

及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后，一般在轉(zhuǎn)染后48小時，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)體

現(xiàn)。根據(jù)不一樣H勺試驗?zāi)康模?8小時后即可進(jìn)行靶基因體現(xiàn)日勺檢測等試驗。如若建立穩(wěn)定

日勺細(xì)胞系，則可對■靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不一樣基因載體中所具有的抗性標(biāo)志選用對應(yīng)口勺藥

物，最常用的直核體現(xiàn)基因載體H勺標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

轉(zhuǎn)基因動物H勺建立和應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動物是以試驗措施交源基因?qū)胨拗魇芫鸦虺跗谂咛ゼ?xì)胞染色體基因組內(nèi)，使其穩(wěn)

定整合和遺傳給后裔動物，它重要采用顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法、精子載體法、

電轉(zhuǎn)移法與胚胎干細(xì)胞法，

轉(zhuǎn)基因動物模型打勺建立，推進(jìn)了腫瘤在分子水平上口勺研究，它使人們認(rèn)識到激活的原痛基因

日勺異常體現(xiàn)及功能失常，是腫瘤發(fā)生日勺初階段。將癌基因與特定細(xì)胞的調(diào)控序列連在一起，

可使癌基因在特定細(xì)胞中體現(xiàn)，研究靶細(xì)胞對不一樣癌基因的易感性，闡明某一癌基因?qū)μ?/p>

定細(xì)胞生長、分化及功能II勺影響；它還可以研究多種基因H勺協(xié)同作用，有助于對多環(huán)節(jié)致癌

機進(jìn)行深和H勺探討。

轉(zhuǎn)基因小鼠不僅用以研究癌基因的功能，還可以通過使某一基因功能丟失（如用基因剔除技

術(shù)）研究抑癌基因在腫瘤發(fā)一中的作用。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠對致癌原的測試，為腫瘤的防止,

治療及發(fā)現(xiàn)新口勺致癌物質(zhì)都提供了有價值研究工具。

基因突變的檢測措施

基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究口勺熱點之一，檢測措施也隨之迅速發(fā)展。人類細(xì)胞癌

基因的突變類型已如上所述，對于基因突變H勺檢測，1985此前，運用Southern印跡法，可

以篩選出基因H勺缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測H勺突變，只能應(yīng)

用復(fù)雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)

是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突

變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR日勺基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出日勺新措施不停出現(xiàn),

目前已達(dá)二十余種，自動化程度也愈來愈高，分析時間大大縮短，分析成果的精確性也有很

大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandcomformationalpolymorphism,SSCP)

和異源雙性分析法(heteroduplexanalysis,HA)。下面分別簡介幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突

變檢測措施，可根據(jù)檢測目的和試驗室條件選擇時參照.

PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短H勺單鏈DNA和RNA分子依其

大街基序列不一樣而形成不一樣構(gòu)象，一種堿基H勺變化將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上H勺移

動速度變化。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級構(gòu)造，這種二級構(gòu)造依賴于

其堿基構(gòu)成，雖然一種堿基U勺不一樣，也會形成不一樣的二級構(gòu)造而出刺同U勺遷移率。由于

該法簡樸迅速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測不不小于200bp

的PCR產(chǎn)物時，突變檢出率可達(dá)70%-95%,片段不小于400bp時，檢出率僅為50%左右,

該法也許會存在1%日勺假陽性率。應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類型

對檢測的敏捷度無大的影響，同步該法不能測定突變?nèi)丈拙_位點,還需通過序列分析來確定。

Sarkar等認(rèn)為對于不小于200bp/J片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應(yīng)用

PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、

胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53

突變最常用的措施，僅檢刻第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85%以上的p53基因突變。由于該法簡

便迅速，尤其適合大樣本基因突變研究的篩選工作。

異源雙鏈分析法(HA)HA法直接在變性凝膠上分離雜交時突變型-野生型DNA雙鏈。由

于突變和野生型DNA形成日勺異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性徽膠中

電泳時，會產(chǎn)生與對應(yīng)的同源雙DNA不一樣口勺遷移率。該法與SSCP相似，所不一樣的是

SSCP分離的是單鏈DNA,HA法分離口勺是雙鏈DNA,也只適合于小片段的I分析。但HA對

某些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結(jié)合使相，可使突變檢出率提高到近100%。

突變體富集PCR法(mutant-enrichedPCR)本法的基本原理是運用ras基因家族某個密碼

子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古

巴子有BgIII位點。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片

段，在兩次擴增反應(yīng)之間用對應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴增II勺DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)

入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。

變性梯度凝膠電泳法(denaturinggradinentelectrophoresis,DGGE)DGGE法分析PCR產(chǎn)

物，假如突變發(fā)生在最先解鏈日勺DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100%,檢測片段可達(dá)lkb,最適

圍為100bp-500bp,基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一

致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈依JDNA鏈中有一種堿基變

化時，會在不一樣R勺時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化日勺程

而被分離。由于本法是運用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用H勺電泳裝置，合成

的PCR引物最佳在5'末端加一段40bh50bp的GC夾，以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。

在DGGEI向基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度替代化學(xué)變性劑的TGGE法(溫度梯度凝膠電泳

temperaturegradientgelelectrophoresiszTGGE)oDGGE和TGGE均有商品化的J電泳裝置，

該法一經(jīng)建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選。

化學(xué)切割錯配法(chemicalcleavageofmismatch,CCM)CCM為在Maxam-Gilbert測序法

日勺基礎(chǔ)上發(fā)展H勺一項檢測突變口勺技術(shù)，其檢測突變口勺精確性可與DNA測序相仿。其基本原

理為將待測含DNA片段與對應(yīng)的J野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異

源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配H勺C能被羥胺或哌咤切割，錯配的T能被四氧化餓切割，

經(jīng)變性凝膠電泳即可確定與否存在突變。該法檢出率很高，也是檢片段最長的措施，已經(jīng)有

報功檢測了L7kb片段，板如同步對正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100%。應(yīng)用熒光檢

測系統(tǒng)可增強敏感度，可檢測到10個細(xì)胞中的1個突變細(xì)胞。該法中II勺化學(xué)試劑有毒，又

發(fā)展了碳二亞胺檢測法(catodiimide,CDI),CDI為無毒物質(zhì)，也可檢測大片段DNA的點突

變。

等位基因特異性寡核苜酸分析法(allele-specificoligonucleotide,ASO)ASO為一種以雜交

為基礎(chǔ)對已知突變口勺檢測技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計一段20bp左右的寡核甘酸片

段，其中包括了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增H勺樣品DNA雜

交?？梢杂枚喾N突變類型的寡核甘酸探針，同步以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，

則表運河樣品中存在與該ASO探針對應(yīng)時點突變，ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置原則對

照防止假陽性和假陰性。目前已經(jīng)有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。

DNA芯片技術(shù)(DNAchip)DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術(shù)，它集

合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)識探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)?？捎糜诨?/p>

因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣

闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核昔酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此

之間重疊1個堿基，并覆蓋所有所需檢測口勺基因，將熒光標(biāo)識的正常DNA和突變DNA發(fā)別

與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基口勺差異，正常和突變的DNA將會得到不一樣

的雜交圖譜，通過共匯集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定與否存

在突變，該措施迅速簡樸、片動化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿?，將在基因突變檢測中心發(fā)

揮非常重要的作用。

連接酶鏈反應(yīng)(ligasechainreactionzLCR)與其他核酸擴增技術(shù)比較，其最大特點為可精

確辨別基因序列中單個基因突變，由Landegree于1988年初次應(yīng)用于鐮刀獎細(xì)胞貧血H勺分

子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5'-磷酸與另一相鄰鏈3'-羥基連接為基礎(chǔ)，

應(yīng)用兩對互補口勺引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對引物分別與模板復(fù)性，若完全互補，

則在連接酹的作用下，使相處兩引物日勺5'■磷酸與3'■羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前

一次H勺連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)口勺模板，假如配對H勺堿基存在突變則不能連接和擴

增。LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這32P標(biāo)識上游引物3'末端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自

顯影加以鑒定，其檢測敏感性到達(dá)200個靶分子。也可設(shè)計1個橫跨兩引物的檢測探針，

用它與LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)識措施。Batt在1994

年發(fā)展了一種更為簡的措施，好微孔板夾心雜交法。由于LCRI內(nèi)迅速、特蛋和敏感的特性，

以及能檢測單個堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合

用以提高其敏感性。

等位基因特異性擴增法(Allele-specificamplification,ASA)ASA于1989年建立，是PCR技

術(shù)應(yīng)用『、J發(fā)展，也稱擴增近礙突變系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)、

等位基因特性PCR(allele-specificPCRZASPCR)等，用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。該法

通過設(shè)計兩個5'端引物，一種與正常DNA互補，一種與突變DNA互補，對于純合性突變，

分別加入這兩種引物及3、端引物進(jìn)行兩個平行PCR,吸有與突變DNA完互補的引物才可延

伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。假如錯配位于引物的3'端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱為ARMS。

ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同步檢測兩種或多種等位基因突變位

點。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和也許發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸，

尤其是當(dāng)錯配堿基為G：T時，這時可通過調(diào)整試驗條件如引物靶DNA,TaqDNA聚合前日勺

濃度等來得高瓜在特異性，在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引

物3'端的第二個堿基引入一種錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以制止錯誤延伸。

RNA隨A切害ij法(RNaseAcleavage)在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或

RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA

探針上錯配H勺堿基為喋吟時，RNaseA在錯配處H勺切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯配堿

基為喀咤時，則其切割效率較高。故假如僅分析被檢DNAH勺一種條鏈，突變檢出率只有30%,

如同步分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70%。該法需要制備RNA探針，增長了操作時

復(fù)雜性，但可用于l-2kbR勺大片段進(jìn)行檢測，并能確定突變位點。于這些優(yōu)越性，它仍被作

為一種經(jīng)典措施用于對未知突變進(jìn)行分析。

染色體原位雜交(Insituhybridizationofchromosome)染色體發(fā)現(xiàn)距今已經(jīng)有150數(shù)年『寸

歷史，染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，伴隨染色體分技術(shù)和分子

生物學(xué)技術(shù)及I發(fā)展。染色體研究范圍也不停擴大，尤其是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細(xì)胞的染

色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面，原

發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)，腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)多種形式的染色體畸

變，如缺失、反復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化重要是腫瘤細(xì)胞核型

的變化。染色體口勺檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為鑒別等方面都重要意義。染

色體的檢測措施進(jìn)展很快，檢測的精確率也不停提高，這里重要簡介熒光原位雜交和PRINS

法。

熒光原位雜交技術(shù)(fluorescentinsituhybridisation,FISH)創(chuàng)立于1986年。1969年Gall

和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)識核甘酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應(yīng)用核素標(biāo)

識的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上兒百

堿基的單拷貝靶核甘酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH具有探針穩(wěn)定、操作安

全，可迅速、多色顯示多種不一樣探針的雜交信號等長處。FISHH勺敏捷感與探針標(biāo)識措施

和檢測儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)識時摻入的修飾核昔酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探

針一般采用隨機引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)識，可使其敏捷度提

高到0.25kb。應(yīng)用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強信噪比，有助于檢測微弱信號，

如應(yīng)用TSA系統(tǒng)(tyramidesignalamplification)能將雜交信號再放大1000倍，可用于單

拷貝基因的定位。FISH辨別率大概為l-3Mb,假如應(yīng)用強變性劑處理染色體，讓DNA分子

從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，辨別率可達(dá)l-2kb