天然產物分析技術及方法演講人：日期:目錄02樣品前處理技術01概述03色譜分析技術04波譜與質譜分析05現代聯用技術06結構鑒定與活性評價01概述Chapter天然產物定義與分類生物來源多樣性功能應用導向分類化學結構分類體系天然產物涵蓋動植物、微生物及海洋生物等生命體的初級或次級代謝產物，如生物堿（嗎啡、奎寧）、萜類（薄荷醇、β-胡蘿卜素）、酚類（黃酮、單寧酸）等，其化學結構復雜性和生物活性顯著。根據核心骨架可分為苯丙素類（如香豆素）、甾體類（如膽固醇）、糖苷類（如人參皂苷）等，部分化合物通過糖基化或酯化修飾形成衍生物，增強其水溶性或靶向性。按用途分為藥物先導化合物（紫杉醇）、食品添加劑（姜黃素）、香料（香蘭素）等，其中約60%臨床抗腫瘤藥物直接或間接來源于天然產物。分析目標與重要性活性成分鑒定與定量通過高靈敏度技術（如LC-MS）解析天然產物中微量活性成分（如銀杏內酯），建立含量標準以控制藥材質量，確保臨床療效與安全性。結構修飾與構效關系研究闡明化合物活性基團（如青蒿素過氧橋鍵），指導半合成優(yōu)化（如衍生物雙氫青蒿素），提升藥理特性或降低毒性。資源可持續(xù)利用評估分析珍稀物種（如紅豆杉）中目標成分分布規(guī)律，開發(fā)細胞培養(yǎng)或合成生物學替代方案，緩解野生資源壓力。主要技術路線概覽聯合使用大孔吸附樹脂（初步富集）、高速逆流色譜（無載體分離）、制備型HPLC（高純度獲?。?，解決復雜基質中相似極性化合物共洗脫難題。分離純化技術鏈結構解析技術組合高通量篩選平臺依托NMR（二維HSQC、HMBC譜）、X射線單晶衍射及圓二色譜（絕對構型確定），實現未知化合物立體結構全解析，如海洋環(huán)肽didemninB的構型確認。整合UPLC-QTOF-MS非靶向代謝組學與分子對接虛擬篩選，快速鎖定潛在活性分子，縮短新藥研發(fā)周期。02樣品前處理技術Chapter提取技術（溶劑法、蒸餾法）溶劑萃取法利用不同極性溶劑（如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等）選擇性溶解目標成分，通過固液或液液分離實現高效提取，適用于脂溶性或水溶性化合物的分離富集。01超臨界流體萃取采用高壓二氧化碳等超臨界流體作為溶劑，兼具氣體滲透性和液體溶解性，可高效提取熱不穩(wěn)定成分且無有機溶劑殘留。水蒸氣蒸餾法通過蒸汽攜帶揮發(fā)性成分冷凝收集，特別適用于精油、芳香族化合物的提取，能保持天然產物的原始風味和活性。微波輔助萃取利用微波加熱加速分子運動，破壞細胞結構釋放內容物，顯著縮短提取時間并提高目標物得率。020304分離純化技術（柱色譜、制備色譜）硅膠柱色譜01基于吸附劑硅膠對不同化合物的吸附差異，通過梯度洗脫實現復雜混合物分離，是實驗室最常用的初步純化手段。制備型高效液相色譜（Prep-HPLC）02采用高壓輸液系統(tǒng)和高分辨率色譜柱，可毫克至克級制備高純度單體化合物，適用于結構相似物的精細分離。大孔吸附樹脂技術03利用樹脂孔徑和表面特性選擇性吸附目標物，特別適用于皂苷、黃酮等大分子極性化合物的富集純化。逆流色譜（CCC）04無固體載體的液液分配色譜體系，避免樣品不可逆吸附損失，適合熱敏性及易變性天然產物的制備分離。樣品富集與濃縮方法旋轉蒸發(fā)濃縮通過減壓加熱快速移除溶劑，保留目標物活性，需控制水浴溫度防止熱敏成分降解。固相萃?。⊿PE）采用C18、離子交換等柱填料選擇性吸附目標物，去除基質干擾的同時實現痕量成分的富集。冷凍干燥技術在低溫真空條件下升華水分，完美保留揮發(fā)性成分和生物活性，適用于蛋白質、多糖等熱不穩(wěn)定物質的脫水保存。氮吹濃縮法利用惰性氣體吹掃加速溶劑揮發(fā)，操作溫和且可并行處理多個樣品，廣泛用于農藥殘留分析的前處理環(huán)節(jié)。03色譜分析技術ChapterHPLC采用高壓泵驅動流動相，通過高效固定相實現復雜混合物的快速分離，檢測限可達納克甚至皮克級別，適用于微量成分的定量分析。其核心優(yōu)勢在于對熱不穩(wěn)定、高沸點及大分子化合物的高效分離能力。高效液相色譜（HPLC）高分離效率與靈敏度在天然產物分析中，HPLC常用于黃酮類、生物堿、多糖等活性成分的定性定量研究。例如，通過C18反相色譜柱結合紫外檢測器可精確測定植物提取物中槲皮素的含量。廣泛應用領域除常規(guī)紫外檢測器外，HPLC可與質譜（LC-MS）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）等聯用，顯著提升化合物結構鑒定能力。LC-MS技術尤其適用于未知天然產物的分子量測定和結構解析。多種檢測器聯用技術氣相色譜（GC）揮發(fā)性成分專屬分析GC基于氣-液分配原理，特別適合分析揮發(fā)油、萜烯類等低沸點化合物。配備氫火焰離子化檢測器（FID）時，可實現對薄荷醇、樟腦等成分的ppm級精確檢測。高溫穩(wěn)定性要求由于需氣化樣品，GC要求待測物在300℃以下能穩(wěn)定存在。通過衍生化技術（如硅烷化）可擴展至部分半揮發(fā)性物質的分析，如脂肪酸甲酯化后測定植物油脂組成。與質譜的深度結合GC-MS聯用系統(tǒng)是天然產物揮發(fā)性成分研究的黃金標準，通過NIST譜庫比對可快速鑒定精油中數十種單萜、倍半萜成分，并提供各組分相對含量數據。薄層色譜（TLC）快速篩查與低成本優(yōu)勢數字化定量分析制備型分離功能TLC采用玻璃板或鋁箔負載硅膠等吸附劑，通過毛細作用展開樣品，20分鐘內即可完成多個樣品的同步分離。碘蒸氣顯色或熒光淬滅法可實現大多數天然產物的可視化檢測。通過加大薄層厚度（0.5-2mm）和點樣量，制備型TLC可從毫克級混合物中分離單一組分，為后續(xù)核磁共振等結構鑒定提供純品。此法在皂苷類成分的初級純化中應用廣泛。結合薄層掃描儀，TLC可實現斑點信號的數字化處理，通過標準曲線法計算含量。新型高效薄層板（HPTLC）的分辨率接近HPLC，已成功應用于中藥材指紋圖譜構建。04波譜與質譜分析Chapter紫外光譜通過測定有機分子中價電子（如π電子、n電子）對紫外光的吸收，反映分子內共軛體系或發(fā)色團的結構特征。典型應用包括判斷共軛雙鍵、芳香環(huán)的存在及取代基位置，如苯環(huán)在200-280nm處的特征吸收帶（E帶、B帶）。紫外光譜（UV）電子躍遷與吸收特性基于吸光度與濃度成正比的關系，紫外光譜常用于定量測定天然產物中特定成分（如黃酮類、多酚類化合物）的含量，結合標準曲線可快速評估樣品純度或濃度。定量分析與朗伯-比爾定律溶劑極性對吸收峰位置和強度有顯著影響（如極性溶劑導致π→π*躍遷紅移），需在解析時注明測試條件。此外，紫外光譜常與其他光譜聯用，輔助推斷未知物骨架結構。溶劑效應與譜圖解析紅外光譜（IR）官能團指紋區(qū)識別紅外光譜通過分子振動能級躍遷（如伸縮振動、彎曲振動）提供4000-400cm?1范圍內的吸收峰，其中1500-400cm?1為指紋區(qū)，可特異性鑒別官能團（如羥基3400cm?1、羰基1700cm?1）。樣品制備技術與局限性常用KBr壓片法或液膜法處理樣品，但需注意水峰干擾（如O-H伸縮振動在3400cm?1附近）。紅外光譜對對稱非極性鍵（如C≡C）不敏感，需結合其他技術補充分析。定量與定性結合應用除定性鑒定外，可通過特征峰強度比值實現半定量分析（如測定聚合物中官能團轉化率），在天然產物結構修飾與反應監(jiān)測中具有重要價值。電離方式與碎片解析電子轟擊電離（EI）產生分子離子峰及特征碎片峰，適用于低分子量化合物；軟電離技術（如ESI、MALDI）則保留分子離子信息，適合分析大分子（如蛋白質、多糖）。碎片模式可推斷結構（如McLafferty重排判斷酮類化合物）。高分辨率與同位素峰高分辨質譜（HRMS）通過精確質量數確定元素組成（如C?H??O?vs.C??H??），結合同位素峰強度比（如氯、溴的M+2峰）輔助分子式推定。聯用技術與復雜體系分析GC-MS、LC-MS聯用技術將分離與檢測結合，適用于天然產物提取物中多組分同時鑒定（如揮發(fā)油成分分析），通過數據庫匹配（如NIST庫）大幅提升鑒定效率。質譜（MS）鑒定技術05現代聯用技術ChapterLC-MS聯用分析高效分離與高靈敏度檢測液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）結合了液相色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度檢測能力，適用于復雜基質中痕量化合物的定性與定量分析，尤其在天然產物中生物堿、黃酮類化合物的研究中表現突出。廣泛的應用領域多種離子化技術適配LC-MS技術在藥物代謝研究、環(huán)境污染物監(jiān)測、食品添加劑檢測以及臨床診斷標志物篩查等領域均有廣泛應用，其高分辨質譜（HRMS）模式可提供精確分子量信息以輔助結構鑒定。根據樣品性質可選擇電噴霧離子化（ESI）、大氣壓化學離子化（APCI）等不同離子源，兼容極性、非極性及熱不穩(wěn)定化合物的分析需求，擴展了方法開發(fā)的靈活性。123GC-MS聯用分析揮發(fā)性成分的精準分析氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）特別適用于天然產物中揮發(fā)性有機物（如萜烯類、芳香族化合物）的分離與鑒定，通過電子轟擊離子源（EI）產生的特征碎片譜庫匹配可實現快速化合物識別。環(huán)境與法醫(yī)學應用該技術廣泛用于環(huán)境樣本（如大氣VOCs）、食品風味物質分析及法醫(yī)毒理學中的毒品檢測，其高重現性和低檢測限（可達ppt級）滿足嚴格的質量控制要求。質譜成像技術的整合GC-MS與質譜成像（IMS）結合可可視化樣品表面化學成分的空間分布，例如植物組織內次級代謝產物的原位分析，為天然產物的生物合成途徑研究提供空間維度數據支持。二維色譜（GC×GC或LC×LC）通過正交分離機制（如極性-非極性柱組合）大幅提高峰容量，解決天然產物提取物中同分異構體或共洗脫組分的分離難題，典型應用包括精油復雜成分的全譜分析。多維色譜技術分離效率的顯著提升中心切割式二維系統(tǒng)通過閥切換或調制器實現餾分轉移，確保第一維流出物無損導入第二維色譜柱，結合飛行時間質譜（TOF-MS）檢測可同步獲取保留時間與質譜三維數據矩陣。接口技術的創(chuàng)新現代多維色譜配備智能峰識別算法和數據庫自動匹配功能，顯著減少人工數據處理時間，在中藥復方多組分定量分析和代謝組學研究中展現出高效、高通量的技術優(yōu)勢。系統(tǒng)自動化與智能化06結構鑒定與活性評價Chapter核磁共振基于原子核自旋能級的塞曼分裂現象，通過射頻輻射激發(fā)核自旋躍遷，獲取分子內原子間相互作用的精細信息。其高分辨率可解析復雜天然產物的立體構型、氫鍵網絡及動態(tài)構象變化，尤其適用于非晶態(tài)或液態(tài)樣品分析。核磁共振（NMR）結構解析基本原理與技術特點1H-NMR提供氫原子化學位移及耦合常數，13C-NMR揭示碳骨架信息；二維譜（如HSQC、HMBC）則通過空間關聯明確原子連接關系，解決結構中的季碳定位、糖苷鍵構型等難題。一維與二維譜圖應用對于大分子（如多糖、蛋白質），信號重疊嚴重需結合DEPT、NOESY等技術；低豐度核（如15N）需同位素標記或超低溫探頭增強靈敏度。局限性及解決方案生物活性篩選模型采用高內涵篩選（HCS）技術，建立腫瘤細胞凋亡、炎癥因子分泌等靶向模型，通過熒光標記或酶聯免疫法量化天然產物的抑制/激活效應，實現高通量初篩。體外細胞模型構建酶活性抑制評價體內動物模型驗證針對特定靶酶（如COX-2、ACE）設計比色法或熒光底物法，測定IC50值并分析構效關系，需設置陽性對照及空白組排除假陽性干擾。通過小鼠急性毒性試驗（LD50測定）及藥效學模型（如角叉菜膠致炎、移植瘤模型），結合組織病理學評估，明確化合物的體內活性窗口及潛在毒副作用。定量分析方法驗證依據ICH