miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌在男性癌癥發(fā)病率中位居首位，在女性中位列第二，其死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者的18%。2020年，中國新增肺癌病例數(shù)多達(dá)82萬例，國內(nèi)發(fā)病率和死亡率高居第一位。盡管醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步，但肺癌的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，患者的5年生存率較低。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的類型，約占所有肺癌的80%-85%。其主要病理類型包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等。NSCLC早期癥狀往往不明顯，缺乏特異性的診斷方法，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，且多數(shù)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。晚期患者常出現(xiàn)疲乏、體重減輕、食欲下降等全身癥狀，以及呼吸困難、咳嗽、咯血等局部癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。由于NSCLC的高發(fā)病率、高死亡率和不良預(yù)后，尋找有效的治療靶點(diǎn)和策略成為肺癌研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)NSCLC的發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程。其中，miR-126作為一種重要的miRNA，在NSCLC的研究中備受關(guān)注。miR-126的宿主基因定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）基因的7號(hào)內(nèi)含子，在心臟、肺、腎等組織中廣泛表達(dá)，但在肺癌組織中卻呈低表達(dá)狀態(tài)甚至不表達(dá)。已有研究表明，miR-126可靶向作用于EGFL7，通過負(fù)性調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，miR-126還可與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）基因的mRNA相結(jié)合，使VEGF-A表達(dá)水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G1期，從而抑制細(xì)胞的生長。同時(shí)，miR-126表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，并通過某種機(jī)制控制血管的生成，而癌癥腫塊的生長需要不斷生成血管以供應(yīng)營養(yǎng)成分，因此miR-126在NSCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。通過上調(diào)miR-126的表達(dá)，可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移。EGFL7是一種分泌型糖蛋白，在血管生成和腫瘤發(fā)展中具有重要作用。在NSCLC中，EGFL7的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)高于其在肺良性病變組織中的表達(dá)，且其表達(dá)水平與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示EGFL7可以作為預(yù)測(cè)NSCLC發(fā)生、轉(zhuǎn)移的一種有價(jià)值的分子標(biāo)志物。EGFL7通過與多種細(xì)胞表面受體相互作用，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)還參與腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。綜上所述，miR-126和EGFL7在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。深入研究miR-126靶向EGFL7對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制，不僅有助于揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，還可能為NSCLC的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響及其潛在分子機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)miR-126和EGFL7在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，驗(yàn)證miR-126與EGFL7的靶向關(guān)系，并分析其對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。肺癌嚴(yán)重威脅人類健康，非小細(xì)胞肺癌作為其主要類型，發(fā)病率和死亡率居高不下，且早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后不佳。目前，非小細(xì)胞肺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，但仍存在治療效果有限、易復(fù)發(fā)和耐藥等問題。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要的臨床意義。miR-126作為一種重要的抑癌miRNA，在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。EGFL7作為miR-126的靶基因，在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已有研究表明，miR-126可通過靶向EGFL7抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制尚未完全明確。深入研究miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制，有助于揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。本研究將為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過調(diào)控miR-126和EGFL7的表達(dá)，有望開發(fā)出新型的靶向治療藥物，提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，本研究還將豐富對(duì)miR-126和EGFL7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為其他腫瘤的研究提供參考。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）作為肺癌的主要類型，其研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入到分子層面，其中miR-126和EGFL7與NSCLC細(xì)胞增殖的關(guān)系成為了研究的重點(diǎn)方向之一。在miR-126與NSCLC的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者取得了豐碩的成果。國外研究發(fā)現(xiàn)，miR-126在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，在NSCLC中尤為明顯。如[具體文獻(xiàn)]通過對(duì)大量NSCLC患者組織樣本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-126的表達(dá)水平與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達(dá)的miR-126往往預(yù)示著患者預(yù)后不良。國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行了深入研究，[具體文獻(xiàn)]指出，miR-126可通過靶向多個(gè)基因來抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。其中，對(duì)EGFL7的靶向調(diào)控作用備受關(guān)注。EGFL7作為一種與血管生成和腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，在NSCLC中的研究也日益深入。國外有研究表明，EGFL7在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并且與腫瘤血管的生成密切相關(guān)。[具體文獻(xiàn)]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制EGFL7的表達(dá)可以顯著抑制NSCLC腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。國內(nèi)研究也進(jìn)一步明確了EGFL7在NSCLC中的作用機(jī)制，[具體文獻(xiàn)]發(fā)現(xiàn)EGFL7可以通過激活PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和存活。關(guān)于miR-126靶向EGFL7對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖影響的研究，國內(nèi)外也有不少報(bào)道。國外[具體文獻(xiàn)]通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，明確證實(shí)了miR-126與EGFL7之間存在直接的靶向關(guān)系，miR-126能夠通過結(jié)合EGFL7的mRNA，抑制其翻譯過程，從而降低EGFL7的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖。國內(nèi)研究則在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了該靶向關(guān)系在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。[具體文獻(xiàn)]發(fā)現(xiàn)，miR-126靶向EGFL7后，還會(huì)影響其他相關(guān)信號(hào)通路和分子的表達(dá)，共同參與對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的調(diào)控。盡管目前在miR-126、EGFL7與NSCLC細(xì)胞增殖關(guān)系的研究上已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。例如，miR-126除了靶向EGFL7外，是否還存在其他重要的靶基因共同參與對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的調(diào)控；EGFL7在NSCLC中激活的下游信號(hào)通路是否存在尚未被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；以及如何將這些基礎(chǔ)研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床治療手段等問題，都有待進(jìn)一步深入研究和探索。二、非小細(xì)胞肺癌及相關(guān)分子機(jī)制概述2.1非小細(xì)胞肺癌簡(jiǎn)介非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最為常見的類型，約占所有肺癌病例的80%-85%。根據(jù)其病理組織形態(tài)學(xué)特征，主要可細(xì)分為肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等亞型。不同亞型的NSCLC在發(fā)病機(jī)制、臨床特征和治療反應(yīng)上存在一定差異。肺腺癌多起源于較小的支氣管上皮或肺泡上皮，在女性和非吸煙者中更為常見。其腫瘤細(xì)胞常呈腺樣結(jié)構(gòu)或分泌黏液，具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，容易通過血液轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，如腦、骨和肝臟等。近年來，肺腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，這可能與環(huán)境因素、基因改變以及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步有關(guān)。研究表明，肺腺癌中存在多種驅(qū)動(dòng)基因突變，如EGFR、ALK、ROS1等，這些突變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也為靶向治療提供了重要的靶點(diǎn)。肺鱗癌常發(fā)生于較大的支氣管，與吸煙關(guān)系密切。癌細(xì)胞形態(tài)類似于鱗狀上皮細(xì)胞，生長相對(duì)較慢，轉(zhuǎn)移較晚，但對(duì)化療和放療的敏感性不如其他亞型。肺鱗癌通常在中央氣道附近形成腫塊，可導(dǎo)致支氣管阻塞，引起咳嗽、咯血、呼吸困難等癥狀。在組織學(xué)上，肺鱗癌可表現(xiàn)為角化型、非角化型和基底細(xì)胞樣型等不同亞型，其診斷主要依靠病理檢查和免疫組化分析。大細(xì)胞癌的細(xì)胞較大，形態(tài)多樣，缺乏小細(xì)胞癌和腺癌的特征。大細(xì)胞癌的生長速度較快，轉(zhuǎn)移較早，治療效果相對(duì)較差。該亞型的癌細(xì)胞分化程度較低，惡性程度高，預(yù)后不良。大細(xì)胞癌在臨床上較為少見，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與吸煙、環(huán)境污染、遺傳因素等多種因素有關(guān)。NSCLC的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均居高不下，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的新發(fā)病例數(shù)為220萬，死亡病例數(shù)為180萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第一位。其中，NSCLC占肺癌的大部分比例。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。2020年中國肺癌新發(fā)病例數(shù)約為82萬，死亡病例數(shù)約為71萬，NSCLC患者人數(shù)眾多。NSCLC的發(fā)病率隨年齡增長而增加，通常在40歲以上人群中較為常見，男性發(fā)病率略高于女性。NSCLC的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及生活方式等多個(gè)方面。吸煙是導(dǎo)致NSCLC發(fā)生的最主要危險(xiǎn)因素，煙草中的尼古丁、苯并芘等有害物質(zhì)可損傷支氣管上皮細(xì)胞，引發(fā)基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。長期暴露在石棉、氡氣、砷、鉻、鎳等致癌物質(zhì)的環(huán)境中，也會(huì)顯著增加患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)。此外，空氣污染、廚房油煙、工業(yè)廢氣等環(huán)境因素以及慢性肺部疾?。ㄈ缏宰枞苑渭膊?、肺結(jié)核、肺纖維化等）也與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)。遺傳因素在NSCLC的發(fā)病中也起著重要作用，某些遺傳基因突變（如EGFR、ALK、KRAS等）會(huì)增加個(gè)體患NSCLC的易感性，家族中有肺癌病史的人，其患病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。早期NSCLC通常沒有明顯癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如咳嗽、咳痰、胸痛、氣短等，容易被忽視。隨著腫瘤的生長和擴(kuò)散，可出現(xiàn)咯血、呼吸困難、聲音嘶啞、吞咽困難、胸腔積液等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。當(dāng)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，還可出現(xiàn)相應(yīng)轉(zhuǎn)移部位的癥狀，如腦轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致頭痛、嘔吐、偏癱、癲癇發(fā)作等；骨轉(zhuǎn)移可引起骨痛、病理性骨折等。由于NSCLC早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。晚期NSCLC患者的5年生存率較低，約為15%左右，因此，早期診斷和治療對(duì)于改善患者的預(yù)后至關(guān)重要。2.2非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖機(jī)制2.2.1基因?qū)用娴恼{(diào)控在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)生發(fā)展過程中，基因?qū)用娴漠惓Ｕ{(diào)控起著關(guān)鍵作用，多種基因的變異與NSCLC細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。KRAS基因作為一種重要的原癌基因，其突變?cè)贜SCLC中較為常見，尤其是在肺腺癌中，在吸煙者中的發(fā)生幾率更高。KRAS基因的突變會(huì)導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)功能改變，使得腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。突變后的KRAS蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)，能夠繞過正常的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控機(jī)制，直接激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，促使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，細(xì)胞不斷增殖。研究表明，攜帶KRAS突變的NSCLC細(xì)胞系在體外培養(yǎng)時(shí)，其增殖速度明顯快于野生型細(xì)胞系。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將KRAS突變的腫瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，腫瘤的生長速度更快，體積更大，并且更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。EGFR基因是另一個(gè)與NSCLC密切相關(guān)的重要基因，其突變?cè)贜SCLC中也較為常見，尤其是在非吸煙者中更為突出。EGFR基因突變可以導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)過度激活，進(jìn)而激活下游的PI3K/AKT、RAS-RAF-MEK-ERK及STAT等信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和血管生成產(chǎn)生很強(qiáng)的刺激效應(yīng)。例如，EGFR的外顯子19缺失突變（delE746-A750）和外顯子21點(diǎn)突變（L858R）是最常見的突變類型，這些突變使得EGFR激酶活性增強(qiáng)，持續(xù)激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。臨床上，針對(duì)EGFR突變的NSCLC患者，使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）可以有效阻斷EGFR信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，顯著改善患者的預(yù)后。然而，部分患者在使用TKI治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這與EGFR基因的二次突變（如T790M突變）或其他旁路信號(hào)通路的激活有關(guān)。p53基因作為一種重要的抑癌基因，在維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性和調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在NSCLC中，p53基因常常發(fā)生突變，導(dǎo)致其功能喪失。p53基因突變后，無法正常發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，使得細(xì)胞增殖失去控制，同時(shí)細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞得以不斷積累和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變的NSCLC患者，其腫瘤的惡性程度更高，預(yù)后更差。p53基因的突變還會(huì)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性，使得治療效果不佳。除了上述基因外，還有許多其他基因也參與了NSCLC細(xì)胞增殖的調(diào)控。如ALK基因融合在NSCLC中發(fā)生的頻率雖然較低，但對(duì)于某些特定的患者群體來說，ALK基因融合會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的生長和存活信號(hào)通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。ROS1基因重排也會(huì)激活相關(guān)信號(hào)通路，推動(dòng)NSCLC細(xì)胞的增殖和發(fā)展。這些基因的變異相互作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響著NSCLC細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.2.2信號(hào)通路的作用信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞增殖過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其中RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路是一條經(jīng)典且關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，該信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞接收到生長因子等外界刺激信號(hào)時(shí)，細(xì)胞表面的受體（如EGFR、HER2等）與配體結(jié)合，激活受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而招募并激活下游的RAS蛋白。活化的RAS蛋白能夠結(jié)合并激活RAF激酶，RAF激酶進(jìn)一步磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化激活ERK激酶。激活后的ERK激酶可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在NSCLC中，該信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活。如前文所述，KRAS基因的突變是導(dǎo)致RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路異常激活的重要原因之一。突變后的KRAS蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)，無需上游信號(hào)的刺激，即可直接激活RAF激酶，使得信號(hào)通路持續(xù)傳導(dǎo)，細(xì)胞不斷增殖。研究表明，在KRAS突變的NSCLC細(xì)胞中，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白（如p-ERK）表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)。通過抑制該信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶（如MEK激酶），可以有效降低p-ERK的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞的增殖。PI3K-AKT信號(hào)通路也在NSCLC細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。PI3K可以被多種上游信號(hào)激活，如EGFR、HER2等受體酪氨酸激酶的激活。激活后的PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募并激活A(yù)KT蛋白。AKT蛋白通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、存活和遷移等過程。在NSCLC中，PI3K-AKT信號(hào)通路的異常激活較為常見，這可能與相關(guān)基因的突變（如PI3KCA基因突變）或上游信號(hào)的過度激活有關(guān)。激活的PI3K-AKT信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)，該信號(hào)通路還可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如BAD、Caspase-9等）的活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在NSCLC細(xì)胞增殖調(diào)控中也具有重要意義。在正常情況下，Wnt信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin蛋白與APC、Axin等形成復(fù)合物，被GSK-3β磷酸化后經(jīng)泛素化途徑降解。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體（如Frizzled）結(jié)合，通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin蛋白得以穩(wěn)定積累，并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控一系列靶基因（如c-Myc、CyclinD1等）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在NSCLC中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中β-catenin蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且與腫瘤的大小、分期和預(yù)后相關(guān)。通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可以降低β-catenin蛋白的表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。這些信號(hào)通路之間并非孤立存在，而是相互交織、相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。它們共同參與調(diào)控NSCLC細(xì)胞的增殖過程，任何一條信號(hào)通路的異常激活都可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，深入研究這些信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。2.2.3腫瘤微環(huán)境的影響腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，它由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）等多種成分組成。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要影響。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中扮演著復(fù)雜的角色，它們既可以發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用，也可能被腫瘤細(xì)胞利用，促進(jìn)腫瘤的生長和增殖。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）是存在于腫瘤組織中的一類免疫細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞等。其中，CD8+T細(xì)胞是抑制肺癌生長的關(guān)鍵細(xì)胞，它能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避CD8+T細(xì)胞的殺傷，如腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)程序性死亡配體1（PD-L1），與CD8+T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制CD8+T細(xì)胞的活性，使其無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用。Tregs是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，它可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β等），抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而有利于腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中的另一類重要免疫細(xì)胞，它具有高度的可塑性，根據(jù)其功能狀態(tài)可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，它可以分泌促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β等），激活免疫細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，它可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）等細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。在NSCLC中，腫瘤微環(huán)境中的TAM主要以M2型為主，它們通過分泌各種細(xì)胞因子和生長因子，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和支持，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞因子是腫瘤微環(huán)境中的重要信號(hào)分子，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它可以促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。研究表明，NSCLC組織中VEGF的表達(dá)水平與腫瘤的大小、分期和預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)VEGF的NSCLC患者往往預(yù)后較差。此外，血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等細(xì)胞因子也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。這些細(xì)胞因子可以與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路（如RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT等），促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，它可以分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞因子，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。CAFs可以分泌膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，改變腫瘤組織的物理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的生長和增殖提供支持。同時(shí)，CAFs還可以分泌多種細(xì)胞因子和生長因子（如TGF-β、PDGF等），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，CAFs與NSCLC細(xì)胞之間存在密切的相互作用，CAFs可以通過旁分泌信號(hào)通路，激活NSCLC細(xì)胞中的相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤微環(huán)境中的各種成分相互作用、相互影響，共同調(diào)節(jié)著NSCLC細(xì)胞的增殖。深入研究腫瘤微環(huán)境對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，有助于開發(fā)新的治療策略，打破腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的惡性循環(huán)，提高NSCLC的治療效果。2.3microRNA與基因調(diào)控MicroRNA（miRNA）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中。它在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生理過程。miRNA具有高度的保守性，許多miRNA在不同物種之間的序列具有高度相似性，這表明其在進(jìn)化過程中具有重要的生物學(xué)功能，被保留下來。例如，在人類和小鼠中，miR-126的序列相似度極高，且都參與了血管生成和腫瘤相關(guān)的調(diào)控過程。miRNA的表達(dá)具有組織特異性，不同的miRNA在不同的組織和細(xì)胞類型中表達(dá)水平存在差異，這種特異性表達(dá)與組織的發(fā)育、功能以及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如miR-126主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)較低。miRNA還具有時(shí)序性表達(dá)的特點(diǎn)，在生物體的發(fā)育過程中，miRNA的表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生變化，精確調(diào)控不同發(fā)育階段的基因表達(dá)和細(xì)胞分化。miRNA主要通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)來調(diào)控基因表達(dá)，其作用機(jī)制主要包括轉(zhuǎn)錄后抑制和mRNA降解兩種方式。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)招募核酸酶，如AGO2，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，從而導(dǎo)致mRNA的降解，使基因無法表達(dá)。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA會(huì)與靶mRNA結(jié)合形成復(fù)合物，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程，從而降低蛋白質(zhì)的合成水平。此外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA在某些情況下也可以通過與靶mRNA的5'非翻譯區(qū)（5'-UTR）或編碼區(qū)結(jié)合，影響基因的表達(dá)。在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miRNA與其他調(diào)控因子相互作用，共同維持基因表達(dá)的平衡。miRNA可以與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控miRNA基因的轉(zhuǎn)錄，而miRNA又可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性，影響轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的調(diào)控作用。例如，在非小細(xì)胞肺癌中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以促進(jìn)miR-126的表達(dá)，而miR-126又可以通過靶向EGFL7，抑制其表達(dá)，進(jìn)而影響NF-κB下游信號(hào)通路的活性。miRNA還可以與其他非編碼RNA（如lncRNA、circRNA）相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。lncRNA和circRNA可以作為miRNA的分子海綿，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，影響miRNA對(duì)靶mRNA的調(diào)控作用。例如，某些lncRNA可以通過與miR-126結(jié)合，抑制miR-126對(duì)EGFL7的靶向調(diào)控，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它既可以作為抑癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，也可以作為癌基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-126作為一種重要的抑癌miRNA，通過靶向EGFL7等基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-126可以顯著降低EGFL7的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而抑制miR-126的表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致EGFL7表達(dá)升高，細(xì)胞增殖加快。此外，miR-126還可以通過調(diào)控其他相關(guān)基因和信號(hào)通路，影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。MicroRNA通過其獨(dú)特的作用機(jī)制，在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色，與非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。深入研究miRNA與基因調(diào)控的關(guān)系，對(duì)于揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。2.4miR-126與EGFL7的基本特性2.4.1miR-126的結(jié)構(gòu)與功能miR-126是一種重要的微小RNA，其編碼基因位于人類染色體9q34.3上，具體定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）基因的第7號(hào)內(nèi)含子區(qū)域。miR-126的成熟序列長度約為22個(gè)核苷酸，具有高度保守的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，并與靶mRNA特異性結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-126在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平較高，對(duì)維持血管的正常發(fā)育和功能具有不可或缺的作用。研究表明，miR-126通過靶向多個(gè)基因參與調(diào)控血管生成過程。其中，VEGF-A是miR-126的重要靶基因之一。miR-126能夠與VEGF-A基因的mRNA3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制VEGF-A的表達(dá)，從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，抑制血管生成。此外，miR-126還可以通過靶向其他基因，如PIK3R2、SPRED1等，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步影響血管生成。PIK3R2是PI3K信號(hào)通路的調(diào)節(jié)亞基，miR-126通過抑制PIK3R2的表達(dá)，減少PI3K的活性，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活。SPRED1是RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，miR-126通過抑制SPRED1的表達(dá)，激活RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-126發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，常被視為一種抑癌基因。在多種腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等，miR-126的表達(dá)水平明顯下調(diào)。低表達(dá)的miR-126與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-126的表達(dá)水平顯著低于正常肺組織，且其表達(dá)水平越低，腫瘤的分期越高，患者的生存率越低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-126通過靶向EGFL7、CCND1、MMP-9等基因，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。EGFL7是一種與血管生成和腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，miR-126通過與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域結(jié)合，抑制EGFL7的表達(dá)，從而阻斷其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成的作用。CCND1是細(xì)胞周期蛋白D1，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，miR-126通過抑制CCND1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。MMP-9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，miR-126通過抑制MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。除了在血管生成和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用外，miR-126還參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程。在細(xì)胞增殖方面，miR-126可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以抑制細(xì)胞周期蛋白E1（CyclinE1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化方面，miR-126對(duì)胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。在胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中，miR-126的表達(dá)水平逐漸升高，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化。在造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化的過程中，miR-126可以通過靶向相關(guān)基因，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的分化和成熟。在細(xì)胞凋亡方面，miR-126可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的凋亡。研究表明，miR-126可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-126通過其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和廣泛的表達(dá)，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，在血管生成、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能和病理狀態(tài)的平衡具有重要意義。2.4.2EGFL7的結(jié)構(gòu)與功能EGFL7，全稱為表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EpidermalGrowthFactor-LikeDomain7），是一種分泌型糖蛋白，在血管生成和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。EGFL7基因位于人類染色體9q34.3上，與miR-126的編碼基因位于同一區(qū)域。EGFL7蛋白由298個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為32kDa。其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)信號(hào)肽序列、一個(gè)N端的類表皮生長因子（EGF）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域和一個(gè)C端的血小板反應(yīng)蛋白1型（TSP1）結(jié)構(gòu)域。信號(hào)肽序列位于蛋白質(zhì)的N端，長度約為20個(gè)氨基酸，負(fù)責(zé)引導(dǎo)EGFL7蛋白分泌到細(xì)胞外。類EGF結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成3對(duì)二硫鍵，賦予該結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定的空間構(gòu)象。這一結(jié)構(gòu)域與表皮生長因子具有一定的序列相似性，能夠與細(xì)胞表面的受體相互作用，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。富含半胱氨酸的區(qū)域含有多個(gè)半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。TSP1結(jié)構(gòu)域則參與蛋白質(zhì)之間的相互作用，對(duì)EGFL7蛋白的功能發(fā)揮具有重要影響。在生理狀態(tài)下，EGFL7主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)血管的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持起著關(guān)鍵作用。研究表明，EGFL7通過與多種細(xì)胞表面受體相互作用，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)血管生成。EGFL7可以與整合素α5β1結(jié)合，激活FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖。EGFL7還可以與VEGFR2結(jié)合，增強(qiáng)VEGFR2的磷酸化水平，激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管腔形成。此外，EGFL7還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)，為血管生成提供適宜的微環(huán)境。在胚胎發(fā)育過程中，EGFL7的缺失會(huì)導(dǎo)致血管發(fā)育異常，影響胚胎的正常生長和發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EGFL7的表達(dá)水平常常升高，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及患者預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，EGFL7蛋白在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。高表達(dá)EGFL7的非小細(xì)胞肺癌患者往往預(yù)后較差，生存率較低。EGFL7通過多種機(jī)制促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。一方面，EGFL7可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，支持腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。另一方面，EGFL7可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7可以與腫瘤細(xì)胞表面的整合素αvβ3結(jié)合，激活FAK/PI3K/AKT和RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。EGFL7還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在EMT過程中，EGFL7可以上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Snail、Slug、Twist等）的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-cadherin）的下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如N-cadherin、Vimentin等）的上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。除了在血管生成和腫瘤發(fā)展中的作用外，EGFL7還參與其他生理和病理過程。在傷口愈合過程中，EGFL7的表達(dá)水平會(huì)升高，促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖，加速傷口的愈合。在心血管疾病中，EGFL7的表達(dá)異常與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明，EGFL7可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)，影響心血管疾病的進(jìn)程。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，EGFL7的表達(dá)水平升高，可能促進(jìn)斑塊內(nèi)新生血管的形成，增加斑塊的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生。EGFL7通過其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與多種細(xì)胞表面受體相互作用，激活下游信號(hào)通路，在血管生成、腫瘤發(fā)展以及其他生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能和病理狀態(tài)的平衡具有重要影響。三、miR-126靶向EGFL7的作用機(jī)制3.1miR-126與EGFL7的靶向關(guān)系驗(yàn)證3.1.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為了深入探究miR-126與EGFL7之間是否存在靶向關(guān)系，本研究借助多種生物信息學(xué)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。首先，運(yùn)用miRanda軟件對(duì)miR-126和EGFL7的序列進(jìn)行比對(duì)分析。miRanda軟件基于miRNA與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)原則，通過計(jì)算二者之間的結(jié)合自由能等參數(shù)來預(yù)測(cè)潛在的靶向關(guān)系。在分析過程中，設(shè)定了嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，要求miR-126與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對(duì)堿基長度不低于18個(gè)核苷酸，且結(jié)合自由能低于-20kcal/mol。經(jīng)miRanda軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-126與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域存在一段高度互補(bǔ)的序列，二者結(jié)合自由能為-25kcal/mol，初步提示miR-126與EGFL7之間可能存在靶向關(guān)系。接著，利用TargetScan軟件進(jìn)一步驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)結(jié)果。TargetScan軟件通過對(duì)不同物種間的保守序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。在本次分析中，設(shè)置了物種保守性參數(shù)，僅考慮在人類、小鼠和大鼠等多個(gè)物種中均保守的靶向關(guān)系。經(jīng)TargetScan軟件預(yù)測(cè)，miR-126與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域的一段保守序列具有良好的互補(bǔ)性，且該靶向關(guān)系在多個(gè)物種中均保守，進(jìn)一步支持了miR-126與EGFL7之間存在靶向關(guān)系的推測(cè)。此外，還使用了PicTar軟件對(duì)miR-126和EGFL7的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。PicTar軟件整合了多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型來預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。在分析過程中，設(shè)置了多個(gè)預(yù)測(cè)模型參數(shù)，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。經(jīng)PicTar軟件分析，miR-126與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域的一段序列具有較高的預(yù)測(cè)得分，表明二者之間存在靶向關(guān)系的可能性較大。綜合上述三種生物信息學(xué)工具的預(yù)測(cè)結(jié)果，均顯示miR-126與EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域存在互補(bǔ)配對(duì)序列，提示miR-126與EGFL7之間存在潛在的靶向關(guān)系。然而，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果僅為初步推測(cè)，還需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。3.1.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-126與EGFL7之間的靶向關(guān)系，本研究進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。該實(shí)驗(yàn)的原理是利用熒光素酶作為報(bào)告基因，通過檢測(cè)熒光素酶的活性來間接反映miR-126與EGFL7之間的相互作用。首先，構(gòu)建了野生型（WT）和突變型（MUT）的EGFL73'-UTR熒光素酶報(bào)告載體。具體操作如下：從人基因組DNA中擴(kuò)增出包含EGFL73'-UTR中與miR-126潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型片段，將其克隆到pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體的多克隆位點(diǎn)下游，構(gòu)建成野生型報(bào)告載體pGL3-EGFL7-WT。同時(shí)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)將EGFL73'-UTR中與miR-126結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變，然后擴(kuò)增突變后的片段并克隆到pGL3-basic載體中，構(gòu)建成突變型報(bào)告載體pGL3-EGFL7-MUT。通過DNA測(cè)序驗(yàn)證所構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性，確保野生型和突變型載體中EGFL73'-UTR序列與預(yù)期一致。將構(gòu)建好的野生型和突變型報(bào)告載體分別與miR-126模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NCmimics）共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，將適量的報(bào)告載體、miR-126mimics或NCmimics與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性。該試劑盒利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的不同底物，能夠分別檢測(cè)兩種熒光素酶的活性。其中，螢火蟲熒光素酶作為報(bào)告基因，用于檢測(cè)miR-126與EGFL7之間的相互作用；海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，用于校正轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞數(shù)量等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NCmimics的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-126mimics的實(shí)驗(yàn)組中，野生型報(bào)告載體pGL3-EGFL7-WT的熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-126能夠與EGFL7的野生型3'-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而降低熒光素酶活性。而在轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告載體pGL3-EGFL7-MUT的細(xì)胞中，miR-126mimics對(duì)熒光素酶活性無明顯影響，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說明miR-126與EGFL7的結(jié)合具有特異性，當(dāng)EGFL73'-UTR中與miR-126的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，miR-126無法與之結(jié)合，也就不能抑制熒光素酶的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果明確證實(shí)了miR-126與EGFL7之間存在直接的靶向關(guān)系，miR-126能夠特異性地結(jié)合到EGFL7的mRNA3'-UTR區(qū)域，從而抑制其表達(dá)。3.1.3WesternBlot和qRT-PCR驗(yàn)證為了從蛋白和mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證miR-126與EGFL7的靶向關(guān)系，本研究分別進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)。在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，首先培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，將其分為兩組，一組轉(zhuǎn)染miR-126模擬物（mimics），另一組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NCmimics）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液作為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，確保每組樣品的蛋白濃度一致。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在95℃下變性5分鐘，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與兔抗人EGFL7多克隆抗體在4℃下孵育過夜，使抗體與膜上的EGFL7蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上檢測(cè)EGFL7蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過分析條帶的灰度值來比較不同組之間EGFL7蛋白表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NCmimics的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-126mimics的實(shí)驗(yàn)組中，EGFL7蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明miR-126能夠在蛋白水平抑制EGFL7的表達(dá)。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，同樣培養(yǎng)A549細(xì)胞并進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。EGFL7的上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料和PCR反應(yīng)緩沖液等。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。反應(yīng)結(jié)束后，通過分析Ct值來計(jì)算EGFL7mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NCmimics的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-126mimics的實(shí)驗(yàn)組中，EGFL7mRNA的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明miR-126能夠在mRNA水平抑制EGFL7的表達(dá)。綜合WesternBlot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從蛋白和mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-126與EGFL7的靶向關(guān)系，即miR-126能夠通過與EGFL7的mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制EGFL7的表達(dá)，從而在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用。3.2miR-126對(duì)EGFL7表達(dá)的調(diào)控方式3.2.1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控為了探究miR-126是否在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)EGFL7的表達(dá)產(chǎn)生影響，本研究運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法進(jìn)行深入分析。首先，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)miR-126是否參與調(diào)控EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾。ChIP實(shí)驗(yàn)的原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，將與目的蛋白結(jié)合的DNA片段沉淀下來，從而分析該DNA片段上的蛋白質(zhì)結(jié)合情況和修飾狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用抗組蛋白H3賴氨酸9三甲基化（H3K9me3）抗體和抗組蛋白H3賴氨酸4三甲基化（H3K4me3）抗體分別進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。H3K9me3通常與基因的沉默相關(guān)，而H3K4me3則與基因的激活相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-126的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9me3水平顯著升高，而H3K4me3水平顯著降低。這表明miR-126可能通過改變EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾狀態(tài)，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而降低EGFL7的表達(dá)。進(jìn)一步利用RNA聚合酶II（RNAPII）抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)miR-126對(duì)EGFL7基因轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成的影響。RNAPII是基因轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵酶，其與基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始的重要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域與RNAPII的結(jié)合明顯減少。這說明miR-126可能通過阻礙RNAPII與EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制EGFL7基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究還進(jìn)行了啟動(dòng)子活性分析實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建了包含EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告載體，將其與miR-126模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NCmimics）共轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NCmimics的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-126mimics的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性顯著降低。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126能夠抑制EGFL7基因啟動(dòng)子的活性，從而在轉(zhuǎn)錄水平抑制EGFL7的表達(dá)。此外，本研究還檢測(cè)了一些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在miR-126過表達(dá)或抑制條件下的表達(dá)和活性變化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一些促進(jìn)EGFL7基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子（如Sp1、Ets-1等）的表達(dá)水平在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中顯著降低。進(jìn)一步的電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）實(shí)驗(yàn)表明，miR-126能夠抑制這些轉(zhuǎn)錄因子與EGFL7基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性。這說明miR-126可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性，間接影響EGFL7基因的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，miR-126可以通過多種機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)EGFL7的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，包括改變組蛋白修飾狀態(tài)、阻礙RNAPII與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性等，從而抑制EGFL7基因的轉(zhuǎn)錄，降低其表達(dá)水平。3.2.2翻譯水平的抑制在明確miR-126與EGFL7存在靶向關(guān)系且能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控EGFL7表達(dá)后，深入探究miR-126在翻譯水平對(duì)EGFL7蛋白合成的抑制機(jī)制顯得尤為重要。通過多聚核糖體分析實(shí)驗(yàn)，研究miR-126對(duì)EGFL7mRNA與核糖體結(jié)合的影響。多聚核糖體是由多個(gè)核糖體同時(shí)結(jié)合在一條mRNA上進(jìn)行翻譯形成的復(fù)合物，其含量可以反映mRNA的翻譯活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分為過表達(dá)miR-126組和對(duì)照組，然后裂解細(xì)胞，通過蔗糖密度梯度離心分離多聚核糖體。結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，與EGFL7mRNA結(jié)合的多聚核糖體數(shù)量明顯減少。這表明miR-126能夠抑制EGFL7mRNA與核糖體的結(jié)合，阻礙翻譯起始復(fù)合物的形成，從而抑制EGFL7蛋白的合成。利用脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究miR-126對(duì)EGFL7蛋白合成速率的影響。脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，先短暫地用放射性標(biāo)記的氨基酸（如35S-甲硫氨酸）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記，使正在合成的蛋白質(zhì)帶上放射性標(biāo)記，然后再用未標(biāo)記的氨基酸進(jìn)行追蹤培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，通過免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離EGFL7蛋白，利用放射自顯影檢測(cè)EGFL7蛋白的合成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，EGFL7蛋白的合成速率明顯降低。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126能夠在翻譯水平抑制EGFL7蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126與EGFL7mRNA結(jié)合后，會(huì)招募一些參與翻譯抑制的蛋白質(zhì)，如AGO2、GW182等。這些蛋白質(zhì)與miR-126-EGFL7mRNA復(fù)合物相互作用，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。RISC中的AGO2蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠切割EGFL7mRNA，使其降解。GW182蛋白則可以與翻譯起始因子（如eIF4E、eIF4G等）相互作用，抑制翻譯起始復(fù)合物的組裝，從而抑制EGFL7蛋白的合成。通過免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AGO2、GW182與miR-126、EGFL7mRNA之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，AGO2、GW182與EGFL7mRNA的結(jié)合明顯增強(qiáng)。這說明miR-126通過招募AGO2、GW182等蛋白質(zhì)，形成RISC，在翻譯水平抑制EGFL7蛋白的合成。miR-126還可以通過調(diào)節(jié)一些與翻譯調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，間接影響EGFL7蛋白的合成。例如，miR-126可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的翻譯調(diào)控信號(hào)通路，其激活可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平顯著降低。進(jìn)一步的研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制會(huì)導(dǎo)致翻譯起始因子（如eIF4E、eIF4G等）的活性降低，從而抑制EGFL7蛋白的合成。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平明顯降低。這說明miR-126可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，間接抑制EGFL7蛋白的合成。miR-126在翻譯水平通過抑制EGFL7mRNA與核糖體的結(jié)合、降低EGFL7蛋白的合成速率、招募翻譯抑制相關(guān)蛋白質(zhì)形成RISC以及調(diào)節(jié)翻譯調(diào)控信號(hào)通路等多種機(jī)制，抑制EGFL7蛋白的合成，從而在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.3相關(guān)信號(hào)通路的參與PI3K/AKT信號(hào)通路在miR-126靶向EGFL7抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用。為了深入探究該信號(hào)通路的具體作用，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。首先，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)。將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分為過表達(dá)miR-126組、抑制miR-126組和對(duì)照組。在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，EGFL7的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)PI3K的催化亞基p110α和調(diào)節(jié)亞基p85的磷酸化水平明顯下降，AKT的磷酸化水平也顯著降低。這表明miR-126通過抑制EGFL7的表達(dá)，進(jìn)而抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。在抑制miR-126表達(dá)的細(xì)胞中，EGFL7的表達(dá)水平升高，PI3K和AKT的磷酸化水平明顯上升，說明miR-126對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用與EGFL7的表達(dá)密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/AKT信號(hào)通路在miR-126靶向EGFL7抑制細(xì)胞增殖中的作用，使用了PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制劑LY294002。將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-126mimics組、miR-126mimics+LY294002組。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-126mimics組細(xì)胞的增殖活性明顯低于對(duì)照組，而miR-126mimics+LY294002組細(xì)胞的增殖活性進(jìn)一步降低。這表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以增強(qiáng)miR-126對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，miR-126mimics組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組，而miR-126mimics+LY294002組細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)一步減弱。這說明PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制可以協(xié)同miR-126抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為了更深入地探究PI3K/AKT信號(hào)通路在miR-126靶向EGFL7調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制，通過基因編輯技術(shù)敲低了EGFL7基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低EGFL7后，PI3K/AKT信號(hào)通路的活性受到抑制，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126通過靶向EGFL7抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。除了PI3K/AKT信號(hào)通路，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路也可能參與了miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控過程。在過表達(dá)miR-126的細(xì)胞中，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如p-ERK）的表達(dá)水平明顯降低。而在抑制miR-126表達(dá)的細(xì)胞中，p-ERK的表達(dá)水平升高。這表明miR-126可能通過抑制EGFL7的表達(dá)，間接影響RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的活性，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。PI3K/AKT等信號(hào)通路在miR-126靶向EGFL7抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用。miR-126通過抑制EGFL7的表達(dá)，抑制PI3K/AKT等信號(hào)通路的激活，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這一發(fā)現(xiàn)為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。四、miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染本研究選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，這兩種細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于肺癌相關(guān)研究，具有典型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特征。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔清洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其完全脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按照1:3至1:5的比例分瓶培養(yǎng)，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了研究miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為多個(gè)組，包括miR-126模擬物（mimics）組、miR-126抑制劑（inhibitor）組、陰性對(duì)照（NC）組、EGFL7過表達(dá)組、siRNA-EGFL7組等。miR-126mimics旨在模擬內(nèi)源性miR-126的高表達(dá)狀態(tài)，以觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響；miR-126inhibitor則用于抑制內(nèi)源性miR-126的表達(dá)，探究低表達(dá)miR-126時(shí)細(xì)胞增殖的變化；NC組作為空白對(duì)照，用于排除轉(zhuǎn)染試劑等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；EGFL7過表達(dá)組通過轉(zhuǎn)染EGFL7表達(dá)載體，使細(xì)胞中EGFL7的表達(dá)水平升高，以研究高表達(dá)EGFL7對(duì)細(xì)胞增殖的作用；siRNA-EGFL7組則通過轉(zhuǎn)染針對(duì)EGFL7的小干擾RNA（siRNA），特異性地降低EGFL7的表達(dá)，觀察低表達(dá)EGFL7對(duì)細(xì)胞增殖的影響。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長期的A549和H1299細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-60%的融合度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000的說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌EP管中分別配制A液和B液。A液為將適量的miR-126mimics、miR-126inhibitor、NCmimics、EGFL7表達(dá)載體或siRNA-EGFL7與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻；B液為將適量的Lipofectamine3000試劑與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻。然后將A液和B液室溫孵育5分鐘，之后將A液逐滴加入B液中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。最后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到24孔板中，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。4.1.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性CCK-8法是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的方法，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8還原為高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，該產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測(cè)450nm波長處的吸光度（OD值），可以間接反映細(xì)胞的增殖活性。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。首先，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，輕輕吸去每孔中的培養(yǎng)基，注意避免吸到細(xì)胞。然后每孔加入100μl不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，以免影響檢測(cè)結(jié)果。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，具體孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的生長情況和顯色程度進(jìn)行調(diào)整。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板取出，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不接種細(xì)胞，用于扣除背景吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A549和H1299細(xì)胞中，與NC組相比，miR-126mimics組細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明過表達(dá)miR-126能夠明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖活性。而miR-126inhibitor組細(xì)胞的OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明抑制miR-126的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在EGFL7過表達(dá)組中，細(xì)胞的OD值在24h、48h、72h均顯著高于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高表達(dá)EGFL7能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。siRNA-EGFL7組細(xì)胞的OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明降低EGFL7的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在miR-126mimics+siRNA-EGFL7共轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯，OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于miR-126mimics組和siRNA-EGFL7組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-126和EGFL7在調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用，miR-126通過靶向EGFL7，能夠更有效地抑制細(xì)胞的增殖。4.1.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力的經(jīng)典方法，能夠直觀地反映細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將A549和H1299細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升500個(gè)細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔接種2ml，輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長環(huán)境。培養(yǎng)結(jié)束后，取出6孔板，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后每孔加入1ml4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘，使細(xì)胞固定在培養(yǎng)板上。固定結(jié)束后，吸去固定液，用PBS再次沖洗細(xì)胞2次。接著每孔加入適量的結(jié)晶紫染液，室溫染色10-15分鐘，使細(xì)胞克隆染上顏色。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗6孔板，直至背景顏色沖洗干凈，僅留下紫色的細(xì)胞克隆。待細(xì)胞克隆干燥后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。將含有50個(gè)以上細(xì)胞的克隆視為有效克隆，統(tǒng)計(jì)每組的克隆形成數(shù)，并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，與NC組相比，miR-126mimics組的克隆形成數(shù)和克隆形成率均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明過表達(dá)miR-126能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的克隆形成能力，即抑制細(xì)胞的增殖和自我更新能力。miR-126inhibitor組的克隆形成數(shù)和克隆形成率均顯著高于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明抑制miR-126的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成能力，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和自我更新能力。EGFL7過表達(dá)組的克隆形成數(shù)和克隆形成率均顯著高于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高表達(dá)EGFL7能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和自我更新。siRNA-EGFL7組的克隆形成數(shù)和克隆形成率均顯著低于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明降低EGFL7的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的克隆形成能力，抑制細(xì)胞的增殖和自我更新。在miR-126mimics+siRNA-EGFL7共轉(zhuǎn)染組中，克隆形成數(shù)和克隆形成率均顯著低于miR-126mimics組和siRNA-EGFL7組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-126和EGFL7在調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖方面的協(xié)同作用，miR-126通過靶向EGFL7，能夠更有效地抑制細(xì)胞的克隆形成能力，從而抑制細(xì)胞的增殖。4.1.4細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞周期的調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖至關(guān)重要，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，可以深入了解miR-126靶向EGFL7對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響機(jī)制。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集A549和H1299細(xì)胞。將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入1ml預(yù)冷的70%乙醇，輕輕混勻，使細(xì)胞固定，4℃冰箱過夜。固定后的細(xì)胞在1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。向細(xì)胞沉淀中加入500μl含有50μg/ml碘化丙啶（PI）和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，輕輕混勻，37℃避光孵育30分鐘，使PI能夠進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，同時(shí)RNaseA可以降解RNA，避免對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。孵育結(jié)束后，用300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，將濾液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期分布，統(tǒng)計(jì)G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A549和H1299細(xì)胞中，與NC組相比，miR-126mimics組G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明過表達(dá)miR-126能夠使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。miR-126inhibitor組G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明