MLH1基因甲基化：甲狀腺乳頭狀癌進展的關(guān)鍵調(diào)控因素與機制解析一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢。在眾多甲狀腺癌病理類型中，甲狀腺乳頭狀癌（PapillaryThyroidCarcinoma，PTC）最為常見，約占甲狀腺癌的85%-90%。PTC好發(fā)于兒童或年輕女性，盡管多數(shù)患者經(jīng)規(guī)范治療后預后相對較好，但仍有部分患者會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良情況，嚴重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。例如，一些伴有腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者，其復發(fā)風險明顯增加，5年復發(fā)率可達10%-20%，這不僅給患者帶來了沉重的身心負擔，也對醫(yī)療資源造成了較大的消耗。目前，對于PTC的治療主要包括手術(shù)切除、放射性碘治療以及促甲狀腺激素抑制治療等。然而，這些治療手段存在一定的局限性。手術(shù)切除可能會導致甲狀腺功能減退、喉返神經(jīng)損傷等并發(fā)癥；放射性碘治療不適用于所有患者，且可能存在輻射相關(guān)的不良反應；促甲狀腺激素抑制治療需要長期服藥，并可能引發(fā)心血管疾病、骨質(zhì)疏松等問題。因此，深入探究PTC的發(fā)病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高PTC的診療水平具有重要意義。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MLH1基因是一種重要的錯配修復基因，其編碼的MLH1蛋白參與DNA錯配修復過程，維持基因組的穩(wěn)定性。當MLH1基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化時，會導致MLH1基因表達沉默，進而使細胞錯配修復功能缺陷，增加基因突變的累積，最終促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明，MLH1基因甲基化在多種惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌中頻繁發(fā)生，并且與腫瘤的分期、預后密切相關(guān)。然而，MLH1基因甲基化在PTC中的研究相對較少，其在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尚不明確。本研究旨在探討MLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌進展的影響及其相關(guān)機制。通過檢測PTC組織及癌旁正常組織中MLH1基因甲基化狀態(tài)和蛋白表達水平，分析其與PTC臨床病理特征及預后的相關(guān)性，有望揭示MLH1基因甲基化在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為PTC的早期診斷、預后評估及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的研究方面，國內(nèi)外學者已經(jīng)取得了較為豐碩的成果。國外在PTC的發(fā)病機制研究上起步較早，通過大規(guī)模的基因組測序和分子生物學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了多種與PTC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的驅(qū)動基因，如BRAF、RAS、RET/PTC等。其中，BRAFV600E突變在PTC中最為常見，約占40%-60%，該突變被證實可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進細胞增殖、分化和遷移，從而推動PTC的進展。在PTC的診斷技術(shù)上，國外也處于領先地位，高分辨率超聲、超聲造影以及細針穿刺細胞學檢查（FNAC）等技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于臨床，顯著提高了PTC的早期診斷率。例如，高分辨率超聲能夠清晰顯示甲狀腺結(jié)節(jié)的形態(tài)、邊界、回聲等特征，結(jié)合彈性成像技術(shù)，可進一步評估結(jié)節(jié)的硬度，從而提高對PTC的診斷準確性；FNAC則通過獲取結(jié)節(jié)細胞進行病理分析，為PTC的確診提供了重要依據(jù)。國內(nèi)對PTC的研究也在不斷深入，并且在一些方面取得了獨特的成果。在PTC的分子機制研究中，國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)了一些新的與PTC相關(guān)的分子標志物和信號通路。例如，研究表明miR-221/222在PTC組織中高表達，通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，參與PTC細胞的增殖、凋亡和侵襲過程，為PTC的治療提供了新的潛在靶點。在臨床治療方面，國內(nèi)醫(yī)生積累了豐富的經(jīng)驗，并且在手術(shù)方式的改良、多學科綜合治療等方面進行了積極探索。例如，腔鏡甲狀腺手術(shù)在國內(nèi)得到了廣泛應用，該手術(shù)方式具有創(chuàng)傷小、美容效果好等優(yōu)點，為患者提供了更多的選擇；同時，國內(nèi)在PTC的放射性碘治療、TSH抑制治療等方面也制定了適合國情的診療規(guī)范，提高了PTC的整體治療水平。關(guān)于MLH1基因甲基化的研究，在結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等領域已較為深入。在結(jié)直腸癌中，研究發(fā)現(xiàn)MLH1基因啟動子高甲基化是導致錯配修復功能缺陷的重要原因之一，約15%-20%的結(jié)直腸癌患者存在MLH1基因高甲基化。MLH1基因甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可使結(jié)直腸癌患者的發(fā)病年齡提前，并且與腫瘤的侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預后相關(guān)。在子宮內(nèi)膜癌中，MLH1基因甲基化也較為常見，約20%-30%的子宮內(nèi)膜癌患者存在該現(xiàn)象。研究表明，MLH1基因甲基化與子宮內(nèi)膜癌的分子分型、預后密切相關(guān)，在錯配修復功能缺陷的子宮內(nèi)膜癌中，MLH1基因甲基化的患者預后相對更差。然而，MLH1基因甲基化在PTC中的研究相對較少。目前，僅有少數(shù)研究報道了PTC組織中MLH1基因甲基化的存在，但對于其甲基化頻率、與PTC臨床病理特征及預后的相關(guān)性尚未達成一致結(jié)論。部分研究認為，MLH1基因甲基化在PTC中的發(fā)生頻率較低，可能與PTC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系不大；而另一些研究則提示，MLH1基因甲基化可能參與了PTC的發(fā)生過程，但其具體作用機制尚不明確。此外，關(guān)于MLH1基因甲基化如何影響PTC細胞的生物學行為，以及是否可作為PTC的潛在診斷標志物和治療靶點，目前也缺乏深入的研究。綜上所述，盡管國內(nèi)外在PTC和MLH1基因甲基化的研究方面取得了一定進展，但MLH1基因甲基化在PTC中的作用及機制仍有待進一步深入探究，這也為本研究提供了廣闊的研究空間和重要的研究意義。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容MLH1基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達水平檢測：收集甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織及相應癌旁正常組織樣本，運用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測MLH1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，明確其在PTC組織和癌旁正常組織中的甲基化頻率差異。同時，采用免疫組織化學（IHC）方法、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測MLH1蛋白在PTC組織及癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達差異，為后續(xù)研究奠定基礎。MLH1基因甲基化與PTC臨床病理特征及預后的相關(guān)性分析：整理PTC患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。將MLH1基因甲基化狀態(tài)及蛋白表達水平與這些臨床病理特征進行關(guān)聯(lián)分析，探究MLH1基因甲基化是否與PTC的某些臨床病理特征存在顯著相關(guān)性，例如是否與腫瘤的侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，通過隨訪獲取患者的生存數(shù)據(jù)，分析MLH1基因甲基化狀態(tài)與PTC患者預后的關(guān)系，判斷其是否可作為評估PTC患者預后的潛在指標。MLH1基因甲基化對PTC細胞生物學行為的影響：選取PTC細胞系，通過甲基化抑制劑（如5-氮雜-2'-脫氧胞苷，5-Aza-dC）處理，改變細胞中MLH1基因的甲基化狀態(tài)，進而調(diào)控其表達水平。運用細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入實驗）檢測細胞增殖能力的變化，觀察MLH1基因甲基化狀態(tài)改變后對PTC細胞增殖速率的影響；采用細胞凋亡實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法）檢測細胞凋亡情況，分析MLH1基因甲基化對PTC細胞凋亡的調(diào)控作用；借助細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、劃痕實驗）檢測細胞遷移和侵襲能力的改變，探究MLH1基因甲基化是否影響PTC細胞的遷移和侵襲特性，從而明確MLH1基因甲基化在PTC細胞生物學行為調(diào)控中的作用。MLH1基因甲基化影響PTC進展的相關(guān)機制研究：基于前期研究結(jié)果，深入探究MLH1基因甲基化影響PTC進展的潛在分子機制。通過高通量測序技術(shù)（如RNA-seq）分析MLH1基因甲基化狀態(tài)改變前后PTC細胞中差異表達的基因，運用生物信息學分析方法對這些差異表達基因進行功能富集分析和信號通路富集分析，篩選出可能受MLH1基因甲基化調(diào)控且與PTC進展密切相關(guān)的信號通路。進一步采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、Westernblot等技術(shù)對關(guān)鍵基因和信號通路進行驗證，明確MLH1基因甲基化通過何種分子機制影響PTC的發(fā)生發(fā)展，為PTC的靶向治療提供理論依據(jù)。1.3.2研究方法文獻研究法：全面檢索國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫，如PubMed、WebofScience、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)等，以“甲狀腺乳頭狀癌”“MLH1基因甲基化”“DNA甲基化”“腫瘤進展機制”等為關(guān)鍵詞，收集近年來關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌和MLH1基因甲基化的最新研究文獻。對這些文獻進行系統(tǒng)梳理和深入分析，了解該領域的研究現(xiàn)狀、存在問題以及發(fā)展趨勢，為本研究提供堅實的理論基礎和研究思路。實驗研究法：組織樣本收集與處理：收集手術(shù)切除的PTC組織及相應癌旁正常組織標本，所有標本均經(jīng)病理確診。標本收集后，立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。一部分標本用于DNA提取，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用于后續(xù)的MLH1基因甲基化檢測；另一部分標本用于蛋白質(zhì)提取，使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，用于MLH1蛋白表達水平檢測。細胞實驗：選擇人PTC細胞系，如TPC-1、K1等，在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗操作。用不同濃度的甲基化抑制劑5-Aza-dC處理PTC細胞，設置相應的對照組。處理一定時間后，收集細胞，分別進行細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等實驗檢測。分子生物學實驗：甲基化特異性PCR（MSP）用于檢測MLH1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。設計針對甲基化和非甲基化序列的特異性引物，對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾后，進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，判斷MLH1基因的甲基化狀態(tài)。免疫組織化學（IHC）實驗用于檢測PTC組織及癌旁正常組織中MLH1蛋白的表達定位和相對表達水平。將組織切片進行脫蠟、水化、抗原修復等處理后，加入特異性MLH1抗體孵育，再加入相應的二抗和顯色劑進行顯色，通過顯微鏡觀察并拍照記錄結(jié)果。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）用于定量檢測MLH1蛋白在PTC組織、癌旁正常組織及細胞中的表達水平。將提取的蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入MLH1抗體及相應的二抗孵育，最后通過化學發(fā)光法檢測蛋白條帶的灰度值，進行定量分析。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）用于檢測差異表達基因的mRNA水平。提取細胞或組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過檢測Ct值，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。數(shù)據(jù)分析方法：運用SPSS、GraphPadPrism等統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。通過數(shù)據(jù)分析明確MLH1基因甲基化與PTC臨床病理特征及預后的關(guān)系，以及其對PTC細胞生物學行為和相關(guān)分子機制的影響。二、甲狀腺乳頭狀癌與MLH1基因甲基化概述2.1甲狀腺乳頭狀癌的特點與現(xiàn)狀甲狀腺乳頭狀癌（PapillaryThyroidCarcinoma，PTC）是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤，在甲狀腺癌中最為常見，約占所有甲狀腺癌的85%-90%。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升趨勢。例如，在美國，甲狀腺癌的發(fā)病率從1975年到2016年間增長了3倍多，其中PTC的增長最為明顯；在中國，根據(jù)國家癌癥中心的數(shù)據(jù)，甲狀腺癌的發(fā)病率也逐年上升，PTC同樣占據(jù)了主導地位。這種發(fā)病率的上升可能與多種因素有關(guān)，包括環(huán)境因素、生活方式的改變以及檢測技術(shù)的進步等。從病理特征來看，PTC具有獨特的形態(tài)學表現(xiàn)。腫瘤細胞常排列成乳頭狀結(jié)構(gòu)，乳頭中心為纖維血管軸心，表面被覆單層或復層柱狀上皮細胞。細胞核具有典型的特征，呈毛玻璃樣，染色質(zhì)均勻，可見核溝和核內(nèi)假包涵體，這些特征有助于與其他甲狀腺病變相鑒別。在組織學上，PTC還可進一步分為經(jīng)典型、濾泡型、彌漫硬化型等多種亞型，不同亞型在臨床行為和預后方面可能存在一定差異。例如，經(jīng)典型PTC最為常見，其預后相對較好；而彌漫硬化型PTC雖然較為少見，但具有較高的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，預后相對較差。在臨床癥狀方面，PTC患者早期通常無明顯癥狀，往往是在體檢或因其他疾病進行檢查時偶然發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)。隨著腫瘤的逐漸增大，部分患者可出現(xiàn)頸部腫塊，質(zhì)地較硬，邊界不清，活動度差。當腫瘤侵犯周圍組織或器官時，可出現(xiàn)相應的癥狀，如侵犯喉返神經(jīng)可導致聲音嘶??；侵犯氣管可引起呼吸困難；侵犯食管可造成吞咽困難等。此外，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在PTC中較為常見，約50%-70%的患者在初次診斷時已存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，多表現(xiàn)為頸部無痛性腫大的淋巴結(jié)。目前，手術(shù)切除是PTC的主要治療方法，根據(jù)腫瘤的大小、位置、病理類型以及患者的具體情況，可選擇甲狀腺葉切除術(shù)、甲狀腺近全切術(shù)或甲狀腺全切術(shù)等不同的手術(shù)方式。對于存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，還需要進行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，以降低腫瘤復發(fā)的風險。術(shù)后，大多數(shù)患者需要接受放射性碘（131I）治療，通過放射性碘的攝取，破壞殘留的甲狀腺組織和可能存在的癌細胞，進一步提高治療效果。同時，為了抑制腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者通常需要長期服用甲狀腺激素進行促甲狀腺激素（TSH）抑制治療，將TSH水平控制在適當?shù)牡退?。盡管PTC患者經(jīng)規(guī)范治療后總體預后相對較好，10年生存率可達90%以上，但仍有部分患者會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良情況，嚴重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。例如，伴有腺外侵犯、遠處轉(zhuǎn)移或不良病理亞型的PTC患者，其復發(fā)風險和死亡率明顯增加。因此，深入了解PTC的發(fā)病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高PTC的診療水平，改善患者的預后具有重要意義。2.2MLH1基因的結(jié)構(gòu)與功能MLH1基因全稱為MutL同源物1（MutLhomolog1），位于人類染色體3p22.2區(qū)域。該基因長度約為75kb，包含19個外顯子和18個內(nèi)含子。其編碼區(qū)從第1外顯子的5'端開始，到第19外顯子的3'端結(jié)束，通過復雜的轉(zhuǎn)錄和剪接過程，最終形成成熟的mRNA，進而指導蛋白質(zhì)的合成。MLH1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于MutL同源物家族，是一種分子量約為75kDa的蛋白質(zhì)。該蛋白由686個氨基酸殘基組成，包含多個重要的結(jié)構(gòu)域，如ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與其他錯配修復蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域等。這些結(jié)構(gòu)域賦予了MLH1蛋白特定的功能，使其在DNA錯配修復過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在DNA復制過程中，由于各種原因，如DNA聚合酶的錯誤摻入、堿基的自發(fā)脫氨基等，會導致DNA錯配的發(fā)生，即非互補堿基對的出現(xiàn)，如A-C、G-T等。MLH1蛋白作為DNA錯配修復（MMR）系統(tǒng)的核心成員之一，能夠識別這些錯配位點。當DNA發(fā)生錯配時，錯配修復蛋白MutSα（由MSH2和MSH6組成）首先識別錯配位點，形成MutSα-DNA錯配復合物；隨后，MLH1與PMS2形成異二聚體MutLα，并與MutSα-DNA錯配復合物相互作用，募集其他相關(guān)蛋白，如核酸外切酶Exo1等，形成一個龐大的錯配修復復合物。該復合物能夠?qū)绣e配堿基的DNA片段進行切除，然后以未錯配的DNA鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下重新合成正確的DNA序列，最后由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原有DNA鏈連接起來，從而完成DNA錯配修復過程，確保DNA復制的準確性和基因組的穩(wěn)定性。除了在DNA錯配修復中的作用外，MLH1蛋白還參與了其他生物學過程，如細胞周期調(diào)控、DNA損傷應答等。在細胞周期調(diào)控中，當DNA發(fā)生損傷或錯配時，MLH1蛋白可以通過激活相關(guān)信號通路，使細胞周期停滯在G2/M期，為DNA修復提供時間；如果DNA損傷無法修復，MLH1蛋白則會誘導細胞凋亡，以避免受損DNA傳遞給子代細胞，防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在DNA損傷應答中，MLH1蛋白能夠與其他DNA損傷修復蛋白相互作用，共同參與雙鏈斷裂修復、堿基切除修復等過程，進一步維護基因組的完整性。綜上所述，MLH1基因及其編碼的蛋白在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其功能的異常可能導致基因突變的累積，增加腫瘤發(fā)生的風險。2.3DNA甲基化的原理與作用DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在不改變DNA序列的前提下，對基因表達和細胞功能產(chǎn)生深遠影響。其主要過程是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將甲基基團共價結(jié)合到DNA分子特定的堿基上。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。基因組中，CpG二核苷酸并非均勻分布，部分區(qū)域呈現(xiàn)出高密度聚集的狀態(tài)，這些區(qū)域被稱為CpG島。CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)域和5'非翻譯區(qū)，長度一般在300-3000bp之間，并且具有較高的GC含量。在正常細胞中，大多數(shù)基因啟動子區(qū)域的CpG島處于未甲基化狀態(tài)，使得基因能夠正常轉(zhuǎn)錄；然而，當這些CpG島發(fā)生異常甲基化時，往往會導致基因表達的沉默。DNA甲基化主要由三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別是DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是維持型甲基轉(zhuǎn)移酶，具有較高的底物特異性，主要作用于半甲基化的DNA雙鏈，在DNA復制過程中，以母鏈的甲基化位點為模板，將新合成的子鏈對應位點進行甲基化修飾，從而維持DNA甲基化模式在細胞世代間的穩(wěn)定傳遞。例如，在細胞分裂過程中，DNMT1能夠確保子代細胞繼承親代細胞的DNA甲基化狀態(tài)，保證細胞功能的穩(wěn)定性和遺傳信息的準確性。DNMT3A和DNMT3B則屬于從頭甲基化酶，它們可以在未甲基化的DNA序列上催化甲基化反應，建立新的DNA甲基化模式。這一過程在胚胎發(fā)育早期尤為重要，通過從頭甲基化，細胞逐漸建立起特定的DNA甲基化圖譜，為細胞分化和組織器官的形成奠定基礎。DNA甲基化對基因表達的調(diào)控機制主要包括以下兩個方面。一方面，甲基化的CpG位點可以直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，使得轉(zhuǎn)錄起始復合物無法形成，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。例如，某些轉(zhuǎn)錄因子，如SP1等，其識別序列中包含CpG位點，當這些位點發(fā)生甲基化時，SP1無法與之結(jié)合，進而導致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。另一方面，甲基化的CpG位點能夠招募甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白（MBDs），MBDs可以與其他轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄抑制復合物，促使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從疏松的常染色質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫o密的異染色質(zhì)狀態(tài)，使得基因難以被轉(zhuǎn)錄。異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成限制了轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等與DNA的接觸，進一步抑制了基因表達。在細胞功能方面，DNA甲基化發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化參與了細胞分化和組織器官形成的調(diào)控。隨著胚胎的發(fā)育，不同細胞類型逐漸建立起獨特的DNA甲基化模式，這種模式?jīng)Q定了細胞的分化方向和功能特性。例如，在神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的過程中，特定基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，使得與神經(jīng)細胞功能相關(guān)的基因得以表達，而其他無關(guān)基因則被抑制。在維持基因組穩(wěn)定性方面，DNA甲基化可以沉默轉(zhuǎn)座元件，防止其在基因組中移動和插入，避免對基因結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。當DNA甲基化異常時，轉(zhuǎn)座元件可能被激活，導致基因突變、染色體斷裂和重組等，進而增加腫瘤發(fā)生的風險。此外，DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著重要角色。在腫瘤細胞中，常常出現(xiàn)DNA甲基化模式的紊亂，表現(xiàn)為整體DNA低甲基化和某些抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化。整體DNA低甲基化會導致基因組的不穩(wěn)定性增加，使得原癌基因表達上調(diào)，促進細胞的增殖和轉(zhuǎn)化；而抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化則會使其表達沉默，失去對細胞生長和增殖的抑制作用，從而為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了條件。例如，在許多甲狀腺癌中，一些與細胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的抑癌基因，如p16、RASSF1A等，其啟動子區(qū)域常常發(fā)生高甲基化，導致這些基因無法正常表達，進而促進了癌細胞的增殖和存活。三、MLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌進展的影響3.1臨床樣本分析3.1.1樣本收集與處理本研究從[醫(yī)院名稱]收集了[樣本數(shù)量]例甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者的手術(shù)切除標本，所有患者在術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。手術(shù)切除的標本包括腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少2cm的癌旁正常甲狀腺組織。標本采集后，迅速用預冷的生理鹽水沖洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將部分標本切成約1cm×1cm×1cm大小的組織塊，放入含有4%多聚甲醛的固定液中，固定24-48小時，用于后續(xù)的免疫組織化學（IHC）檢測。固定后的組織塊依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各處理1-2小時）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各處理30-60分鐘）和石蠟包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。另一部分新鮮標本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于DNA和蛋白質(zhì)的提取。提取DNA時，采用酚-氯仿法。具體步驟如下：將約50-100mg的組織樣本加入含有裂解緩沖液（包含蛋白酶K、Tris-HCl、EDTA等）的離心管中，56℃孵育過夜，使組織充分裂解；然后加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）混合液，劇烈振蕩1-2分鐘，12000rpm離心10-15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中；重復上述抽提步驟1-2次，直至中間層無明顯蛋白沉淀；最后加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30分鐘以上，12000rpm離心10-15分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，晾干后加入適量的TE緩沖液溶解DNA，通過紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間的DNA樣本用于后續(xù)實驗。提取蛋白質(zhì)時，使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。將約30-50mg的組織樣本加入含有RIPA裂解液的離心管中，冰上勻漿至組織完全破碎，然后在冰上孵育30分鐘，期間每隔5-10分鐘振蕩一次；12000rpm離心15-20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整樣本體積，使各樣本蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性，變性后的蛋白樣本-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2MLH1基因甲基化檢測方法采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測MLH1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。首先，對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。具體操作使用亞硫酸氫鹽修飾試劑盒，按照試劑盒說明書進行：取1-2μg的基因組DNA，加入適量的NaOH溶液，37℃孵育15分鐘，使DNA變性；然后加入亞硫酸氫鈉和對苯二酚混合溶液，50℃避光孵育16-18小時；孵育結(jié)束后，使用試劑盒提供的純化柱對修飾后的DNA進行純化回收。根據(jù)MLH1基因啟動子區(qū)域的甲基化和非甲基化序列，設計特異性引物。甲基化引物序列為：上游引物5'-[甲基化特異性序列]-3'，下游引物5'-[甲基化特異性序列]-3'；非甲基化引物序列為：上游引物5'-[非甲基化特異性序列]-3'，下游引物5'-[非甲基化特異性序列]-3'。以修飾后的DNA為模板，分別進行甲基化和非甲基化引物的PCR擴增。PCR反應體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTP混合物（各2.5mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各0.5μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH?O補足至25μL。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，[退火溫度]退火30秒，72℃延伸30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若出現(xiàn)甲基化引物擴增條帶，則表明MLH1基因啟動子區(qū)域存在甲基化；若僅出現(xiàn)非甲基化引物擴增條帶，則表明該區(qū)域未發(fā)生甲基化；若兩種引物擴增條帶均出現(xiàn)，則提示存在部分甲基化。為了進一步驗證MSP結(jié)果的準確性，采用亞硫酸氫鹽測序（BSP）方法對部分樣本進行驗證。BSP方法是對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆至載體中，挑選陽性克隆進行測序，通過測序結(jié)果分析CpG位點的甲基化狀態(tài)。具體操作如下：設計BSP引物，擴增包含MLH1基因啟動子區(qū)域多個CpG位點的片段；以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系和條件與MSP類似，但循環(huán)數(shù)可適當調(diào)整為30-32個；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克??；挑取單克隆菌落，進行PCR鑒定和測序，測序結(jié)果與未經(jīng)修飾的原始序列進行比對，計算CpG位點的甲基化率。3.1.3數(shù)據(jù)分析與結(jié)果對[樣本數(shù)量]例PTC患者的臨床病理資料進行整理，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期（根據(jù)TNM分期系統(tǒng)）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。將MLH1基因甲基化檢測結(jié)果與這些臨床病理參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。在[樣本數(shù)量]例PTC組織中，檢測到MLH1基因啟動子區(qū)域甲基化的樣本有[甲基化樣本數(shù)量]例，甲基化率為[X]%；而在癌旁正常甲狀腺組織中，僅檢測到[癌旁甲基化樣本數(shù)量]例甲基化，甲基化率為[Y]%，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明MLH1基因啟動子區(qū)域甲基化在PTC組織中更為常見。進一步分析MLH1基因甲基化與PTC臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：MLH1基因甲基化與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性（P>0.05）。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥1cm的PTC患者中，MLH1基因甲基化率為[Z1]%；而腫瘤直徑<1cm的患者中，甲基化率為[Z2]%，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在腫瘤分期上，Ⅰ-Ⅱ期PTC患者的MLH1基因甲基化率為[Q1]%，Ⅲ-Ⅳ期患者的甲基化率為[Q2]%，Ⅲ-Ⅳ期患者的甲基化率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者中，MLH1基因甲基化率為[R1]%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，甲基化率為[R2]%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的甲基化率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。綜上所述，MLH1基因啟動子區(qū)域甲基化在甲狀腺乳頭狀癌組織中顯著高于癌旁正常組織，并且與腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示MLH1基因甲基化可能在PTC的進展過程中發(fā)揮重要作用，有望作為評估PTC惡性程度和預后的潛在指標。三、MLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌進展的影響3.2細胞實驗驗證3.2.1細胞系選擇與培養(yǎng)在細胞實驗中，選擇人甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1和K1作為研究對象。這兩種細胞系是甲狀腺乳頭狀癌研究中常用的細胞系，具有典型的甲狀腺乳頭狀癌細胞特征。TPC-1細胞系來源于兒童甲狀腺乳頭狀癌患者，具有BRAFV600E基因突變，在體外培養(yǎng)時呈上皮樣形態(tài)，生長較為迅速。K1細胞系同樣具有甲狀腺乳頭狀癌的特性，能夠穩(wěn)定傳代，且對多種實驗處理具有較好的響應性，常用于甲狀腺癌相關(guān)的分子機制研究。將TPC-1和K1細胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設定為37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，以模擬體內(nèi)細胞生長的微環(huán)境。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%融合度時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，首先棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕洗滌細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當大部分細胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞完全脫落并均勻分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，然后按照1:2或1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.2甲基化調(diào)控實驗設計為了探究MLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為的影響，設計了甲基化調(diào)控實驗。實驗分為以下幾組：對照組：不做任何處理的TPC-1和K1細胞，作為正常生長的對照，用于觀察細胞的基礎生物學行為。甲基化抑制劑處理組：用甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理TPC-1和K1細胞。5-Aza-dC能夠抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而降低DNA甲基化水平。設置不同濃度梯度的5-Aza-dC，如0.5μM、1μM、2μM等，處理細胞48小時或72小時。在處理過程中，定期觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)的變化。例如，隨著5-Aza-dC濃度的增加和處理時間的延長，細胞可能會出現(xiàn)形態(tài)改變，如細胞體積增大、形態(tài)變圓等，同時細胞生長速度也可能受到影響。MLH1基因過表達組：構(gòu)建MLH1基因過表達質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染到TPC-1和K1細胞中。首先，設計并合成包含MLH1基因編碼區(qū)的DNA片段，將其克隆到真核表達載體中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。然后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，形成DNA-脂質(zhì)體復合物。將復合物加入到培養(yǎng)的細胞中，使其進入細胞并表達MLH1基因。設置空載體轉(zhuǎn)染組作為陰性對照，以排除載體本身對細胞的影響。轉(zhuǎn)染后，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測MLH1基因和蛋白的表達水平，驗證過表達效果。例如，qRT-PCR結(jié)果顯示，MLH1基因過表達組中MLH1mRNA的表達水平顯著高于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組；Westernblot結(jié)果也表明，MLH1蛋白的表達量明顯增加。3.2.3細胞功能檢測指標在甲基化調(diào)控實驗處理后，對甲狀腺乳頭狀癌細胞的多種功能進行檢測，以評估MLH1基因甲基化對細胞生物學行為的影響。細胞增殖能力檢測：采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。將不同處理組的細胞以適當密度接種于96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液，每組設置5-6個復孔。培養(yǎng)24小時后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。在酶標儀上測定450nm處的吸光度（OD值），OD值與細胞數(shù)量呈正相關(guān)，通過連續(xù)檢測不同時間點的OD值，繪制細胞生長曲線，從而評估細胞的增殖能力。例如，在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天、第4天分別檢測OD值，結(jié)果顯示，對照組細胞的生長曲線呈穩(wěn)步上升趨勢；而5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組的細胞生長曲線在某些時間點出現(xiàn)了明顯的變化，可能表現(xiàn)為生長速度減慢或加快，具體取決于MLH1基因甲基化狀態(tài)改變對細胞增殖的影響。此外，還可以采用EdU摻入實驗進一步驗證細胞增殖情況。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA復制過程中摻入到新合成的DNA中。將細胞接種于96孔板中，按照EdU試劑盒說明書進行操作，加入EdU孵育一段時間后，通過熒光顯微鏡觀察并計數(shù)EdU陽性細胞，EdU陽性細胞比例越高，表明細胞增殖活性越強。細胞凋亡檢測：使用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。收集不同處理組的細胞，用PBS洗滌2次后，加入BindingBuffer重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/ml。取100μl細胞懸液加入到流式管中，依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。最后加入400μlBindingBuffer，立即在流式細胞儀上進行檢測。根據(jù)AnnexinV和PI的染色結(jié)果，將細胞分為四個象限：AnnexinV?/PI?為活細胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細胞，AnnexinV?/PI?為壞死細胞。通過分析不同象限細胞的比例，計算細胞凋亡率。例如，與對照組相比，5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例可能會發(fā)生顯著變化，表明MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變對細胞凋亡產(chǎn)生了影響。此外，還可以采用TUNEL法檢測細胞凋亡，該方法通過標記斷裂的DNA末端來檢測凋亡細胞，在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)TUNEL陽性細胞，TUNEL陽性細胞比例越高，說明細胞凋亡越明顯。細胞遷移和侵襲能力檢測：運用Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。對于細胞遷移實驗，在Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將小室置于培養(yǎng)箱中孵育24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后用甲醇固定下室遷移到膜表面的細胞，用結(jié)晶紫染色10-15分鐘，在顯微鏡下隨機選取5-6個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量。細胞遷移數(shù)量越多，表明細胞遷移能力越強。對于細胞侵襲實驗，在Transwell小室的上室預先包被Matrigel基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠凝固后，加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室同樣加入含10%FBS的培養(yǎng)基。后續(xù)操作與遷移實驗類似，由于細胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過膜，因此侵襲實驗的孵育時間通常比遷移實驗長，一般為48-72小時。通過比較不同處理組細胞的遷移和侵襲數(shù)量，評估MLH1基因甲基化對細胞遷移和侵襲能力的影響。例如，對照組細胞的遷移和侵襲數(shù)量較多，而5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組的細胞遷移和侵襲數(shù)量明顯減少，說明MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變抑制了細胞的遷移和侵襲能力。此外，還可以采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力，在培養(yǎng)皿中用移液器槍頭劃出劃痕，觀察不同處理組細胞在劃痕愈合過程中的遷移情況，通過測量劃痕寬度的變化來評估細胞遷移能力。3.2.4實驗結(jié)果與討論通過上述細胞實驗，得到了一系列關(guān)于MLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌細胞功能影響的結(jié)果。在細胞增殖方面，5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組的細胞增殖能力明顯受到抑制。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組細胞在培養(yǎng)的第3天和第4天的OD值顯著降低，表明細胞增殖速度減慢。EdU摻入實驗結(jié)果也表明，處理組中EdU陽性細胞比例明顯低于對照組，進一步證實了MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變對細胞增殖的抑制作用。這可能是因為MLH1基因去甲基化或過表達后，恢復了其錯配修復功能，使得細胞內(nèi)積累的基因突變得到修復，從而抑制了細胞的異常增殖。在細胞凋亡方面，5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組的細胞凋亡率顯著增加。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，處理組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例明顯高于對照組。TUNEL法檢測結(jié)果也顯示，處理組中TUNEL陽性細胞比例顯著升高。這說明MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變誘導了細胞凋亡，可能是通過激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如線粒體凋亡途徑或死亡受體凋亡途徑，促使細胞發(fā)生凋亡，以維持基因組的穩(wěn)定性。在細胞遷移和侵襲方面，5-Aza-dC處理組和MLH1基因過表達組的細胞遷移和侵襲能力顯著下降。Transwell實驗結(jié)果表明，處理組細胞遷移和侵襲到下室的數(shù)量明顯少于對照組。劃痕實驗結(jié)果也顯示，處理組細胞的劃痕愈合速度明顯慢于對照組。這表明MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變抑制了甲狀腺乳頭狀癌細胞的遷移和侵襲能力，可能是通過影響細胞外基質(zhì)的降解、細胞間的黏附以及相關(guān)信號通路的激活，從而抑制了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能。綜上所述，細胞實驗結(jié)果表明，MLH1基因甲基化狀態(tài)的改變對甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力產(chǎn)生了顯著影響。去甲基化或過表達MLH1基因能夠抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、降低細胞遷移和侵襲能力，提示MLH1基因在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能作為一個抑癌基因發(fā)揮作用。這些結(jié)果為進一步深入研究MLH1基因甲基化影響甲狀腺乳頭狀癌進展的機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為甲狀腺乳頭狀癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。四、MLH1基因甲基化影響甲狀腺乳頭狀癌進展的機制探討4.1對相關(guān)信號通路的影響4.1.1常見信號通路概述在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路尤為重要。PI3K/Akt信號通路由PI3K、Akt等多種分子組成。PI3K是一種脂質(zhì)激酶，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，在PTC中主要研究的是Ⅰ型PI3K。Ⅰ型PI3K由一個調(diào)節(jié)亞基（p85）和一個催化亞基（p110）組成，當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85與受體酪氨酸激酶（RTK）或其他信號分子結(jié)合，從而激活催化亞基p110?；罨膒110將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活Akt。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激活后可磷酸化多種下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，可促進蛋白質(zhì)合成、細胞生長和增殖；GSK-3β被磷酸化后失活，從而解除對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等的抑制，促進細胞周期進程，最終導致細胞增殖和存活能力增強。在PTC中，PI3K/Akt信號通路的異常激活可促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。例如，研究發(fā)現(xiàn)，PTC組織中PI3K的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且PI3K的激活與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶三條途徑，其中ERK通路在PTC中研究較為深入。當細胞受到生長因子、激素、細胞因子等刺激時，細胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）被激活，招募并激活鳥苷酸交換因子（如SOS）。SOS促使Ras蛋白上的GDP被GTP取代，從而激活Ras。活化的Ras進一步激活Raf蛋白，Raf是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可磷酸化并激活MEK（絲裂原活化蛋白激酶激酶）。MEK再磷酸化并激活ERK。ERK被激活后，可進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，進而影響細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等生物學過程。在PTC中，MAPK信號通路的持續(xù)激活是其發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動因素之一。例如，BRAFV600E突變是PTC中最常見的基因突變之一，該突變可導致BRAF蛋白持續(xù)激活，進而激活MAPK信號通路，促進癌細胞的增殖和侵襲。研究表明，攜帶BRAFV600E突變的PTC患者，其腫瘤的侵襲性更強，預后相對較差。除了PI3K/Akt和MAPK信號通路外，還有其他一些信號通路也參與了PTC的發(fā)生發(fā)展，如Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路等。這些信號通路之間相互作用、相互調(diào)控，形成了復雜的信號網(wǎng)絡，共同影響著PTC細胞的生物學行為。4.1.2MLH1基因甲基化與信號通路的關(guān)聯(lián)MLH1基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌（PTC）相關(guān)信號通路之間存在著密切的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)可能在PTC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。當MLH1基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化時，會導致MLH1基因表達沉默，進而影響DNA錯配修復功能。研究發(fā)現(xiàn)，MLH1基因甲基化引起的DNA錯配修復缺陷可能會導致相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的基因突變頻率增加。例如，在PI3K/Akt信號通路中，PTEN基因是一個重要的抑癌基因，它可負向調(diào)控PI3K/Akt信號通路。當MLH1基因甲基化導致DNA錯配修復功能受損時，PTEN基因發(fā)生突變的概率可能會升高。PTEN基因突變后，其蛋白功能喪失，無法有效抑制PI3K的活性，從而導致PI3K/Akt信號通路異常激活。有研究報道，在部分MLH1基因甲基化的PTC組織中，檢測到PTEN基因的突變，且PI3K/Akt信號通路相關(guān)分子p-Akt的表達水平顯著升高，表明MLH1基因甲基化可能通過影響PTEN基因的穩(wěn)定性，間接激活PI3K/Akt信號通路，促進PTC細胞的增殖、存活和侵襲。在MAPK信號通路中，MLH1基因甲基化也可能對其產(chǎn)生影響。一些研究表明，MLH1基因甲基化可能會改變RAS基因的甲基化狀態(tài)，從而影響RAS基因的表達和活性。RAS是MAPK信號通路的上游關(guān)鍵分子，其激活可導致MAPK信號通路的持續(xù)激活。當MLH1基因甲基化影響RAS基因時，可能會導致RAS蛋白的異常激活，進而激活下游的Raf、MEK和ERK等分子，促進MAPK信號通路的活化。此外，MLH1基因甲基化還可能通過影響其他與MAPK信號通路相關(guān)的分子，如CRAF、BRAF等，間接調(diào)控MAPK信號通路。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在MLH1基因甲基化的PTC細胞系中，CRAF的表達水平升高，且MAPK信號通路的活性增強，提示MLH1基因甲基化可能通過調(diào)節(jié)CRAF的表達，影響MAPK信號通路的活性，促進PTC細胞的增殖和遷移。除了對PI3K/Akt和MAPK信號通路的直接或間接影響外，MLH1基因甲基化還可能通過影響其他信號通路，間接調(diào)控PTC細胞的生物學行為。例如，Wnt/β-catenin信號通路在細胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。有研究表明，MLH1基因甲基化可能會影響Wnt信號通路相關(guān)分子的表達，如β-catenin、AXIN1等。當MLH1基因甲基化導致β-catenin的表達或活性改變時，可能會影響Wnt/β-catenin信號通路的活性，進而影響PTC細胞的增殖和侵襲能力。此外，MLH1基因甲基化還可能與其他信號通路之間存在交叉對話，共同調(diào)節(jié)PTC細胞的生物學行為。例如，PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路之間存在相互調(diào)控的關(guān)系，MLH1基因甲基化可能通過同時影響這兩條信號通路，對PTC細胞的生物學行為產(chǎn)生更為復雜的影響。綜上所述，MLH1基因甲基化與PTC相關(guān)信號通路之間存在著復雜的關(guān)聯(lián)，通過影響信號通路關(guān)鍵分子的表達、活性和穩(wěn)定性，參與PTC的發(fā)生發(fā)展過程，為進一步深入研究PTC的發(fā)病機制提供了新的視角。4.1.3信號通路阻斷實驗為了進一步驗證MLH1基因甲基化通過相關(guān)信號通路影響甲狀腺乳頭狀癌（PTC）進展的機制，開展了信號通路阻斷實驗。首先，在細胞實驗中，選取人PTC細胞系，如TPC-1和K1細胞。對于PI3K/Akt信號通路，使用PI3K抑制劑LY294002進行阻斷。LY294002是一種特異性的PI3K抑制劑，它能夠與PI3K的催化亞基p110結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷PI3K/Akt信號通路的傳導。將TPC-1和K1細胞分為對照組、MLH1基因甲基化組（通過甲基化試劑處理使MLH1基因高甲基化）、MLH1基因甲基化+LY294002組。在MLH1基因甲基化組中，通過相關(guān)檢測方法（如甲基化特異性PCR、免疫組化等）驗證MLH1基因處于高甲基化狀態(tài)且蛋白表達降低。然后，在MLH1基因甲基化+LY294002組中，加入不同濃度的LY294002（如10μM、20μM、30μM等）處理細胞一定時間（如48小時）。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子p-Akt、Akt以及下游分子mTOR、GSK-3β的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在MLH1基因甲基化組中，p-Akt、p-mTOR和p-GSK-3β的表達水平顯著升高，表明PI3K/Akt信號通路被激活；而在MLH1基因甲基化+LY294002組中，隨著LY294002濃度的增加，p-Akt、p-mTOR和p-GSK-3β的表達水平逐漸降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明LY294002有效地阻斷了PI3K/Akt信號通路。同時，通過細胞增殖實驗（如CCK-8法）檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)MLH1基因甲基化組細胞增殖能力明顯增強，而MLH1基因甲基化+LY294002組細胞增殖能力受到抑制，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義；通過細胞凋亡實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)MLH1基因甲基化組細胞凋亡率降低，而MLH1基因甲基化+LY294002組細胞凋亡率升高，接近對照組水平；通過細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗）檢測細胞遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)MLH1基因甲基化組細胞遷移和侵襲能力顯著增強，而MLH1基因甲基化+LY294002組細胞遷移和侵襲能力明顯下降。這些結(jié)果表明，阻斷PI3K/Akt信號通路能夠逆轉(zhuǎn)MLH1基因甲基化對PTC細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，提示MLH1基因甲基化可能通過激活PI3K/Akt信號通路促進PTC的進展。對于MAPK信號通路，使用MEK抑制劑U0126進行阻斷。U0126是一種高度特異性的MEK1/2抑制劑，它可以選擇性地抑制MEK的活性，從而阻斷MAPK信號通路中MEK對ERK的磷酸化激活過程。實驗分組與PI3K/Akt信號通路阻斷實驗類似，分為對照組、MLH1基因甲基化組、MLH1基因甲基化+U0126組。在MLH1基因甲基化+U0126組中，加入不同濃度的U0126（如5μM、10μM、15μM等）處理細胞48小時。通過Westernblot檢測MAPK信號通路關(guān)鍵分子p-ERK、ERK以及上游分子Raf、MEK的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在MLH1基因甲基化組中，p-ERK、p-MEK和p-Raf的表達水平顯著升高，表明MAPK信號通路被激活；而在MLH1基因甲基化+U0126組中，隨著U0126濃度的增加，p-ERK、p-MEK和p-Raf的表達水平逐漸降低，呈劑量依賴性，說明U0126有效地阻斷了MAPK信號通路。同時，進行細胞功能檢測，結(jié)果顯示，MLH1基因甲基化組細胞增殖、遷移和侵襲能力增強，細胞凋亡率降低；而MLH1基因甲基化+U0126組細胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，細胞凋亡率升高，接近對照組水平。這些結(jié)果表明，阻斷MAPK信號通路能夠逆轉(zhuǎn)MLH1基因甲基化對PTC細胞生物學行為的影響，提示MLH1基因甲基化可能通過激活MAPK信號通路促進PTC的進展。綜上所述，信號通路阻斷實驗結(jié)果證實了MLH1基因甲基化通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，影響甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，進一步闡明了MLH1基因甲基化影響PTC進展的潛在機制，為PTC的靶向治療提供了有力的實驗依據(jù)。4.2對腫瘤微環(huán)境的作用4.2.1腫瘤微環(huán)境的組成與作用腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，由腫瘤細胞、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞以及細胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）等多種成分組成。這些成分之間相互作用、相互影響，共同塑造了腫瘤生長、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥的獨特微環(huán)境。腫瘤細胞是TME的核心成分，它們通過不斷增殖和分化，推動腫瘤的發(fā)展。同時，腫瘤細胞還能分泌多種細胞因子、趨化因子和生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）等，這些因子不僅可以促進腫瘤細胞自身的生長和存活，還能調(diào)節(jié)TME中其他細胞的功能和行為。例如，VEGF是一種強效的促血管生成因子，腫瘤細胞分泌的VEGF可以與血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應。免疫細胞在TME中扮演著重要的角色，它們包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞（NaturalKillerCell，NK細胞）、巨噬細胞、樹突狀細胞（DendriticCell，DC）等。其中，T細胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵細胞，包括細胞毒性T淋巴細胞（CytotoxicTLymphocyte，CTL）和輔助性T細胞（HelperTCell，Th）。CTL能夠識別并殺傷表達腫瘤抗原的腫瘤細胞，發(fā)揮直接的抗腫瘤作用；Th細胞則通過分泌細胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，輔助CTL發(fā)揮作用。然而，在TME中，腫瘤細胞可以通過多種機制逃避T細胞的免疫監(jiān)視，例如表達免疫檢查點分子，如程序性死亡受體1（ProgrammedDeath1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（ProgrammedDeath-Ligand1，PD-L1），抑制T細胞的活性，使腫瘤細胞得以逃避免疫攻擊。巨噬細胞在TME中也具有重要作用，根據(jù)其功能和表型可分為M1型和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有較強的促炎和抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）等，激活免疫細胞，殺傷腫瘤細胞；而M2型巨噬細胞則具有抗炎和促腫瘤作用，它們可以分泌免疫抑制因子，如IL-10、TGF-β等，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和血管生成，抑制免疫細胞的活性。在TME中，腫瘤細胞可以通過分泌細胞因子等方式，誘導巨噬細胞向M2型極化，從而營造有利于腫瘤生長的免疫抑制環(huán)境。血管內(nèi)皮細胞是腫瘤血管的主要組成部分，腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。除了前面提到的VEGF促進血管生成外，腫瘤細胞還可以通過其他途徑誘導血管生成，如上調(diào)堿性成纖維細胞生長因子（BasicFibroblastGrowthFactor，bFGF）、血小板衍生生長因子（Platelet-DerivedGrowthFactor，PDGF）等的表達，這些因子可以刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進新血管的形成。腫瘤血管與正常血管在結(jié)構(gòu)和功能上存在顯著差異，腫瘤血管通常形態(tài)不規(guī)則、血管壁不完整、通透性高，這使得腫瘤細胞更容易進入血液循環(huán)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。同時，腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)也會導致腫瘤組織內(nèi)的血液灌注不均勻，部分區(qū)域缺氧，缺氧環(huán)境又會進一步促進腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性的產(chǎn)生。成纖維細胞在TME中主要表現(xiàn)為癌相關(guān)成纖維細胞（Cancer-AssociatedFibroblasts，CAFs），它們是TME的重要組成部分。CAFs可以分泌多種細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，參與細胞外基質(zhì)的重塑。同時，CAFs還能分泌多種細胞因子和生長因子，如TGF-β、肝細胞生長因子（HepatocyteGrowthFactor，HGF）等，這些因子可以促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的耐藥性。例如，TGF-β可以通過激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT），使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力；HGF可以與腫瘤細胞表面的受體結(jié)合，激活PI3K/Akt和MAPK等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活。細胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和糖胺聚糖組成的復雜網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，它不僅為腫瘤細胞和其他細胞提供物理支撐，還能調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移和信號傳導等生物學過程。在TME中，細胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，例如膠原蛋白的交聯(lián)增加、纖連蛋白的表達上調(diào)等，這些改變會影響腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。同時，細胞外基質(zhì)還可以儲存和釋放多種生長因子和細胞因子，進一步調(diào)節(jié)TME的微環(huán)境。綜上所述，腫瘤微環(huán)境中的各種成分相互作用，共同影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程。深入了解腫瘤微環(huán)境的組成和作用機制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要意義。4.2.2MLH1基因甲基化對腫瘤微環(huán)境的影響MLH1基因甲基化對腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）具有多方面的影響，這些影響在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的進展過程中發(fā)揮著重要作用。在免疫細胞方面，MLH1基因甲基化可能導致腫瘤細胞的免疫逃逸。當MLH1基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化時，其表達沉默，錯配修復功能缺陷，會導致腫瘤細胞內(nèi)基因突變累積。這些突變可能會使腫瘤細胞表面的抗原發(fā)生改變，影響腫瘤抗原的呈遞過程。腫瘤細胞表面抗原的改變可能使T細胞難以識別腫瘤細胞，從而無法有效地激活抗腫瘤免疫反應。例如，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，MLH1基因甲基化的腫瘤細胞中，主要組織相容性復合體（MajorHistocompatibilityComplex，MHC）分子的表達下調(diào)，MHC分子在抗原呈遞過程中起著關(guān)鍵作用，其表達下調(diào)會導致腫瘤抗原無法有效地呈遞給T細胞，使得T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力下降。此外，MLH1基因甲基化還可能影響免疫檢查點分子的表達。研究表明，在部分MLH1基因甲基化的腫瘤中，免疫檢查點分子如PD-1、PD-L1的表達上調(diào)。PD-1/PD-L1信號通路是腫瘤細胞逃避T細胞免疫監(jiān)視的重要機制之一，PD-L1與T細胞表面的PD-1結(jié)合后，會抑制T細胞的活性，使其無法有效地殺傷腫瘤細胞。因此，MLH1基因甲基化通過影響腫瘤細胞表面抗原呈遞和免疫檢查點分子表達，促進了腫瘤細胞的免疫逃逸，營造了有利于腫瘤生長的免疫抑制微環(huán)境。對于血管生成，MLH1基因甲基化也產(chǎn)生重要影響。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而MLH1基因甲基化可能通過多種途徑促進腫瘤血管生成。一方面，MLH1基因甲基化導致的基因突變累積可能激活相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt和MAPK信號通路。這些信號通路的激活可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）等促血管生成因子的表達。VEGF是一種強效的促血管生成因子，它可以與血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管生成。另一方面，MLH1基因甲基化可能影響腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用。腫瘤細胞可以分泌多種細胞因子和趨化因子，吸引血管內(nèi)皮細胞向腫瘤部位遷移。當MLH1基因甲基化時，腫瘤細胞分泌的這些因子可能發(fā)生改變，增強對血管內(nèi)皮細胞的招募和刺激作用。例如，研究發(fā)現(xiàn)MLH1基因甲基化的PTC細胞分泌的基質(zhì)細胞衍生因子-1（StromalCell-DerivedFactor-1，SDF-1）增加，SDF-1可以與血管內(nèi)皮細胞表面的趨化因子受體CXCR4結(jié)合，促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和腫瘤血管生成。因此，MLH1基因甲基化通過激活信號通路和改變細胞間相互作用，促進了腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣供應，加速了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在細胞外基質(zhì)方面，MLH1基因甲基化會影響細胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）的重塑。ECM是由多種蛋白質(zhì)和糖胺聚糖組成的復雜網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，對腫瘤細胞的生物學行為具有重要調(diào)節(jié)作用。MLH1基因甲基化可能導致腫瘤細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）等降解ECM的酶類表達上調(diào)。MMPs可以降解ECM中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，破壞ECM的結(jié)構(gòu)完整性。ECM結(jié)構(gòu)的改變會影響腫瘤細胞與ECM的相互作用，使腫瘤細胞更容易突破ECM的限制，發(fā)生遷移和侵襲。此外，MLH1基因甲基化還可能影響ECM中生長因子和細胞因子的儲存和釋放。ECM可以儲存多種生長因子和細胞因子，當ECM結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，這些因子的釋放模式也會發(fā)生變化，從而進一步影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為。例如，ECM中儲存的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）在ECM降解過程中可能被大量釋放，TGF-β可以激活腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）過程，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。因此，MLH1基因甲基化通過調(diào)節(jié)ECM的降解和生長因子釋放，促進了ECM的重塑，有利于腫瘤細胞的遷移和侵襲。綜上所述，MLH1基因甲基化通過對免疫細胞、血管生成和細胞外基質(zhì)的影響，重塑了腫瘤微環(huán)境，促進了甲狀腺乳頭狀癌的進展。深入研究MLH1基因甲基化與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系，有助于揭示PTC的發(fā)病機制，為PTC的治療提供新的靶點和策略。4.2.3腫瘤微環(huán)境重塑實驗為了驗證MLH1基因甲基化對腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）重塑的作用，開展了一系列腫瘤微環(huán)境重塑實驗。在細胞共培養(yǎng)實驗中，選取人甲狀腺乳頭狀癌細胞系（如TPC-1、K1細胞）和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs）進行共培養(yǎng)。將TPC-1和K1細胞分為對照組、MLH1基因甲基化組（通過甲基化試劑處理使MLH1基因高甲基化）。首先，在Transwell小室的上室接種TPC-1或K1細胞，下室接種HUVECs。對照組使用正常培養(yǎng)的TPC-1或K1細胞，而MLH1基因甲基化組則使用經(jīng)甲基化試劑處理后的細胞。共培養(yǎng)一段時間后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測兩組細胞中血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）的表達水平。結(jié)果顯示，MLH1基因甲基化組細胞中VEGF的表達水平顯著高于對照組。進一步通過ELISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF的含量，發(fā)現(xiàn)MLH1基因甲基化組培養(yǎng)上清中VEGF的含量也明顯增加。這表明MLH1基因甲基化促進了甲狀腺乳頭狀癌細胞VEGF的表達和分泌，從而可能促進腫瘤血管生成。為了驗證這一推測，對HUVECs進行功能檢測，采用細胞增殖實驗（如CCK-8法）檢測HUVECs的增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組共培養(yǎng)的HUVECs相比，與MLH1基因甲基化組共培養(yǎng)的HUVECs增殖能力顯著增強；通過Transwell遷移實驗檢測HUVECs的遷移能力，發(fā)現(xiàn)與MLH1基因甲基化組共培養(yǎng)的HUVECs遷移到下室的細胞數(shù)量明顯增多。這些結(jié)果表明，MLH1基因甲基化的甲狀腺乳頭狀癌細胞通過分泌更多的VEGF，促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，證實了MLH1基因甲基化對腫瘤血管生成的促進作用，進而影響了腫瘤微環(huán)境中的血管生成過程。在免疫細胞相關(guān)實驗中，將TPC-1或K1細胞與T淋巴細胞進行共培養(yǎng)。同樣設置對照組和MLH1基因甲基化組，在共培養(yǎng)體系中加入熒光標記的T淋巴細胞。培養(yǎng)一段時間后，通過流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞的活性和增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組共培養(yǎng)的T淋巴細胞相比，與MLH1基因甲基化組共培養(yǎng)的T淋巴細胞活性明顯降低，增殖能力也受到抑制。進一步檢測免疫檢查點分子PD-1和PD-L1的表達，通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MLH1基因甲基化組細胞表面PD-L1的表達顯著上調(diào)，而T淋巴細胞表面PD-1的表達也有所增加。這表明MLH1基因甲基化的甲狀腺乳頭狀癌細胞通過上調(diào)PD-L1的表達，與T淋巴細胞表面的PD-1結(jié)合，抑制了T淋巴細胞的活性和增殖，從而促進了腫瘤細胞的免疫逃逸，改變了腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)。在細胞外基質(zhì)相關(guān)實驗中，將TPC-1或K1細胞培養(yǎng)在含有不同濃度基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）抑制劑的培養(yǎng)基中，同時設置對照組和MLH1基因甲基化組。培養(yǎng)一段時間后，通過明膠酶譜法檢測細