高職院校微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊前言微生物學(xué)是高職院校生物類、食品類、環(huán)境類、醫(yī)學(xué)類等專業(yè)的核心基礎(chǔ)課程，實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐操作技能、嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)態(tài)度、行業(yè)應(yīng)用能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本手冊依據(jù)高職教育"技能導(dǎo)向、知行合一"的培養(yǎng)目標(biāo)，結(jié)合行業(yè)崗位需求（如食品微生物檢測、環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)微生物應(yīng)用等），選取基礎(chǔ)操作、典型應(yīng)用兩類實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，注重規(guī)范性、實(shí)用性與可操作性，旨在幫助學(xué)生掌握微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心技能，為后續(xù)專業(yè)學(xué)習(xí)及職業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。一、實(shí)驗(yàn)安全規(guī)范微生物實(shí)驗(yàn)涉及致病菌、有毒試劑、易燃物品（如酒精燈），需嚴(yán)格遵守以下安全規(guī)范，防范實(shí)驗(yàn)事故發(fā)生。（一）個(gè)人防護(hù)1.實(shí)驗(yàn)前需穿實(shí)驗(yàn)服（避免污染衣物），戴一次性手套（防止直接接觸微生物或試劑）；長發(fā)需扎起，禁止穿拖鞋、短褲進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。2.實(shí)驗(yàn)過程中禁止用手觸摸面部、眼睛或口鼻；禁止飲食、吸煙。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需用肥皂或消毒液徹底洗手，脫下的實(shí)驗(yàn)服需單獨(dú)存放，避免污染日常衣物。（二）無菌操作安全1.酒精燈使用：點(diǎn)燃酒精燈時(shí)需用火柴（禁止用打火機(jī)直接點(diǎn)燃）；熄滅時(shí)需用燈帽蓋滅（禁止用嘴吹）；酒精燈旁禁止放置易燃物品（如酒精棉、紙巾）。2.接種工具滅菌：接種環(huán)、接種針需在酒精燈火焰上徹底灼燒（從尖端到柄部，來回灼燒2-3次），冷卻后再使用（避免燙死微生物）；使用后需再次灼燒滅菌。3.培養(yǎng)基處理：未滅菌的培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌（121℃，20分鐘）后再使用；污染的培養(yǎng)基需滅菌后再丟棄（防止致病菌擴(kuò)散）。（三）應(yīng)急處理1.皮膚劃傷：若被接種針、玻璃器皿劃傷，需立即用生理鹽水沖洗傷口，擠出少量血液，然后用碘伏或75%乙醇消毒，必要時(shí)就醫(yī)（若傷口接觸過致病菌，需注射破傷風(fēng)抗毒素）。2.試劑濺灑：若酒精、染液等濺到皮膚，需立即用大量清水沖洗；若濺入眼睛，需用生理鹽水沖洗15分鐘以上，然后就醫(yī)。3.火災(zāi)：若酒精燈傾倒引發(fā)火災(zāi)，需立即用濕抹布或滅火器（干粉滅火器）撲滅，禁止用水澆滅（酒精浮于水面會擴(kuò)大火勢）。二、基本操作技能基本操作是微生物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，需反復(fù)練習(xí)，達(dá)到熟練、規(guī)范的要求。（一）無菌操作技術(shù)目的：防止雜菌污染實(shí)驗(yàn)樣品或培養(yǎng)基，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。操作步驟：1.準(zhǔn)備工作：將實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基、接種工具（接種環(huán)、吸管）、樣品等放置在酒精燈火焰旁（直徑10-15cm的無菌區(qū)）。2.接種環(huán)滅菌：用酒精燈火焰灼燒接種環(huán)至發(fā)紅，冷卻30秒（可接觸培養(yǎng)基試溫，無蒸汽冒出即為冷卻）。3.打開培養(yǎng)基：用手握住培養(yǎng)基試管的棉塞（或瓶蓋），輕輕旋轉(zhuǎn)取出，將棉塞或瓶蓋放在酒精燈火焰旁（避免污染）；試管口需對著火焰（防止空氣中的雜菌進(jìn)入）。4.接種：用接種環(huán)挑取少量微生物樣品（如菌液、菌落），迅速接入新的培養(yǎng)基中（動作要快，避免試管口長時(shí)間暴露在空氣中）；接種完成后，立即塞回棉塞（或瓶蓋），并再次灼燒接種環(huán)。（二）顯微鏡使用（油鏡觀察）目的：觀察微生物的形態(tài)（如細(xì)菌、酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)），是微生物鑒定的重要手段。操作步驟：1.涂片制備：取少量微生物樣品（如菌液、菌落），用生理鹽水稀釋后，均勻涂在載玻片上（涂片要薄，避免重疊）；自然干燥后，用酒精燈火焰固定（載玻片快速通過火焰3次，防止樣品脫落）。2.染色：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇染色方法（如革蘭氏染色、芽孢染色），染色后用清水沖洗，自然干燥。3.油鏡觀察：（1）將載玻片放在顯微鏡載物臺上，用低倍鏡找到目標(biāo)區(qū)域（視野明亮，物像清晰）。（2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，換用油鏡（鏡頭需貼近載玻片）；滴1滴香柏油（增強(qiáng)光線折射）在載玻片上，緩慢調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋（避免壓碎載玻片），找到物像后，用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)至清晰。（3）觀察完畢，用擦鏡紙蘸少量二甲苯（或鏡頭清洗液）擦拭油鏡鏡頭（禁止用普通紙巾或紗布擦拭），然后將顯微鏡歸位（低倍鏡對準(zhǔn)通光孔，鏡筒下降至最低處）。（三）微生物計(jì)數(shù)技術(shù)1.平板計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)）原理：將樣品稀釋后，接種到固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU），計(jì)算每克（或每毫升）樣品中的活菌數(shù)。操作步驟：（1）樣品稀釋：取10g（或10mL）樣品，加入90mL生理鹽水（無菌），搖勻制成1:10稀釋液；再從1:10稀釋液中取10mL，加入90mL生理鹽水，制成1:100稀釋液，依此類推（根據(jù)樣品污染程度選擇稀釋倍數(shù)，通常選____個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)）。（2）接種：用無菌吸管取0.1mL稀釋液，均勻涂布在平板表面（涂布棒需用酒精灼燒滅菌，冷卻后使用）；每個(gè)稀釋倍數(shù)做3個(gè)重復(fù)平板。（3）培養(yǎng)：將平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。（4）計(jì)數(shù)：選擇菌落數(shù)在____之間的平板，計(jì)算平均值；結(jié)果用CFU/g（或mL）表示（公式：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷樣品量）。注意事項(xiàng)：稀釋時(shí)需充分搖勻（避免樣品分布不均）；接種時(shí)需無菌操作（防止雜菌污染）；培養(yǎng)溫度和時(shí)間需嚴(yán)格控制（避免菌落過大或過?。?。2.血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（總菌計(jì)數(shù)）原理：血球計(jì)數(shù)板是一種特制的載玻片，有25×16或16×25的網(wǎng)格，每個(gè)網(wǎng)格體積固定（0.1mm3），通過計(jì)數(shù)網(wǎng)格內(nèi)的微生物數(shù)量，計(jì)算總菌數(shù)。操作步驟：（1）樣品稀釋：將樣品稀釋至合適濃度（每網(wǎng)格內(nèi)有5-10個(gè)微生物為宜）。（2）加樣：取少量稀釋液，滴在血球計(jì)數(shù)板的蓋玻片邊緣，讓液體自然滲入網(wǎng)格（避免氣泡產(chǎn)生）；靜置2-3分鐘，待微生物沉降后觀察。（3）計(jì)數(shù)：用低倍鏡找到網(wǎng)格區(qū)域，計(jì)數(shù)5個(gè)中方格（如25×16網(wǎng)格中的4個(gè)角和中間的1個(gè)中方格）中的微生物數(shù)量；計(jì)算總菌數(shù)（公式：5個(gè)中方格的總菌數(shù)×稀釋倍數(shù)×10?）。注意事項(xiàng)：計(jì)數(shù)時(shí)需遵循“計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右”的原則（避免重復(fù)計(jì)數(shù)）；樣品需新鮮（避免微生物死亡或沉淀）。二、具體實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目本部分選取行業(yè)常用、針對性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，涵蓋食品、環(huán)境、工業(yè)微生物領(lǐng)域，注重技能訓(xùn)練與職業(yè)應(yīng)用結(jié)合。實(shí)驗(yàn)一：革蘭氏染色（微生物形態(tài)鑒定基礎(chǔ)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆崭锾m氏染色法的操作步驟；學(xué)會區(qū)分革蘭氏陽性菌（G?）與革蘭氏陰性菌（G?）。實(shí)驗(yàn)原理：革蘭氏染色的關(guān)鍵在于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異：G?菌細(xì)胞壁厚、肽聚糖含量高，經(jīng)結(jié)晶紫染色后，用碘液媒染形成穩(wěn)定的“結(jié)晶紫-碘”復(fù)合物，不易被乙醇脫色，最終呈紫色；G?菌細(xì)胞壁薄、肽聚糖含量低，且有外膜（脂多糖），乙醇脫色時(shí)外膜被破壞，復(fù)合物易被洗脫，最終被番紅復(fù)染呈紅色。實(shí)驗(yàn)材料：菌種：金黃色葡萄球菌（G?）、大腸桿菌（G?）；試劑：結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅染液、生理鹽水；器材：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、擦鏡紙。操作步驟：1.涂片固定：取少量生理鹽水滴在載玻片中央，用接種環(huán)挑取少量金黃色葡萄球菌（或大腸桿菌），與生理鹽水混合均勻，制成薄涂片；自然干燥后，用酒精燈火焰固定（快速通過火焰3次）。2.結(jié)晶紫染色：用結(jié)晶紫染液覆蓋涂片，染色1分鐘；用清水緩慢沖洗（避免沖掉樣品）。3.碘液媒染：用碘液覆蓋涂片，媒染1分鐘；用清水沖洗。4.乙醇脫色：用95%乙醇緩慢沖洗涂片（約30秒），直至流出的液體無紫色為止；用清水沖洗。5.番紅復(fù)染：用番紅染液覆蓋涂片，復(fù)染1分鐘；用清水沖洗，自然干燥。6.油鏡觀察：將涂片放在顯微鏡載物臺上，用油鏡觀察（G?菌呈紫色，G?菌呈紅色）。結(jié)果記錄與分析：菌種染色結(jié)果（顏色）革蘭氏陽性/陰性金黃色葡萄球菌紫色G?大腸桿菌紅色G?注意事項(xiàng)：脫色時(shí)間是關(guān)鍵：脫色過長會導(dǎo)致G?菌脫色，誤判為G?菌；脫色過短會導(dǎo)致G?菌未脫色，誤判為G?菌。涂片要?。和科^厚會導(dǎo)致染色不均勻，難以觀察。實(shí)驗(yàn)二：食品中細(xì)菌總數(shù)測定（食品衛(wèi)生檢測）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆掌桨逵?jì)數(shù)法測定食品中細(xì)菌總數(shù)的方法；了解食品衛(wèi)生質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌總數(shù)是指食品中每克（或每毫升）樣品中所含的活菌數(shù)量，是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)（如GB4789.____《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)細(xì)菌總數(shù)測定》）。通過將樣品稀釋后接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算細(xì)菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料：樣品：面包、牛奶或肉制品（任選一種）；試劑：生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；器材：無菌均質(zhì)器、無菌吸管、無菌平板、恒溫培養(yǎng)箱、天平。操作步驟：1.樣品處理：取25g樣品（如面包），放入無菌均質(zhì)袋中，加入225mL生理鹽水，用均質(zhì)器均質(zhì)1-2分鐘（制成1:10稀釋液）；若為液體樣品（如牛奶），直接取25mL加入225mL生理鹽水（制成1:10稀釋液）。2.樣品稀釋：從1:10稀釋液中取10mL，加入90mL生理鹽水（制成1:100稀釋液）；依此類推，制備1:1000、1:____等稀釋液（根據(jù)樣品污染程度選擇）。3.接種：用無菌吸管取0.1mL稀釋液（如1:100、1:1000、1:____），分別涂布在3個(gè)營養(yǎng)瓊脂平板上（每個(gè)稀釋倍數(shù)做3個(gè)重復(fù)）。4.培養(yǎng)：將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。5.計(jì)數(shù)：選擇菌落數(shù)在____之間的平板，計(jì)數(shù)每個(gè)平板的菌落數(shù)；計(jì)算平均值（若有2個(gè)稀釋倍數(shù)的平板菌落數(shù)在____之間，取兩者的平均值）。結(jié)果計(jì)算：細(xì)菌總數(shù)（CFU/g或mL）=（平板平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）÷樣品量（g或mL）示例：若1:100稀釋液的3個(gè)平板菌落數(shù)分別為80、85、90，平均值為85，則細(xì)菌總數(shù)=85×100÷25=340CFU/g（樣品量為25g）。注意事項(xiàng)：樣品處理需無菌操作（避免雜菌污染）；稀釋液需充分搖勻（避免樣品分布不均）；培養(yǎng)時(shí)間需嚴(yán)格控制（48小時(shí)，避免菌落過大或過?。?。實(shí)驗(yàn)三：水中大腸菌群測定（環(huán)境監(jiān)測）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆账写竽c菌群的測定方法；了解水體污染狀況（大腸菌群是水體受糞便污染的指示菌）。實(shí)驗(yàn)原理：大腸菌群能在37℃下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，通過乳糖發(fā)酵試驗(yàn)（初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵）和伊紅美藍(lán)瓊脂平板分離，鑒定水中是否含有大腸菌群。實(shí)驗(yàn)材料：樣品：自來水或河水；試劑：乳糖發(fā)酵管（含倒置小導(dǎo)管）、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、生理鹽水；器材：無菌吸管、無菌平板、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡。操作步驟：1.初發(fā)酵試驗(yàn)：取10mL樣品（或稀釋液），接入10mL乳糖發(fā)酵管（大管）；取1mL樣品，接入1mL乳糖發(fā)酵管（小管）；每個(gè)稀釋倍數(shù)做3個(gè)重復(fù)。將發(fā)酵管放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2.結(jié)果觀察：若發(fā)酵管中有氣泡產(chǎn)生（產(chǎn)氣），且培養(yǎng)基變黃（產(chǎn)酸），則為初發(fā)酵陽性（需進(jìn)一步分離鑒定）；若無氣泡或顏色不變，則為陰性。3.平板分離：取初發(fā)酵陽性的發(fā)酵管，用接種環(huán)挑取少量培養(yǎng)液，劃線接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上（劃線要均勻，避免菌落重疊）；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。4.菌落觀察：伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的大腸菌群菌落呈紫黑色，有金屬光澤（因伊紅和美藍(lán)與乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)合形成復(fù)合物）；挑取典型菌落，涂片做革蘭氏染色（大腸菌群為G?桿菌）。5.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：取典型菌落，接入乳糖發(fā)酵管中；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。若產(chǎn)氣產(chǎn)酸，則為復(fù)發(fā)酵陽性（確認(rèn)含有大腸菌群）。結(jié)果判斷：根據(jù)初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵的陽性管數(shù)，查《MPN（最大可能數(shù)）表》，計(jì)算每100mL樣品中的大腸菌群數(shù)（如GB5750.____《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》）。注意事項(xiàng)：乳糖發(fā)酵管需新鮮（避免培養(yǎng)基失效）；平板分離時(shí)需無菌操作（避免雜菌污染）；復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)是確認(rèn)大腸菌群的關(guān)鍵（避免假陽性）。實(shí)驗(yàn)四：酵母菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)（工業(yè)微生物應(yīng)用）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆战湍妇呐囵B(yǎng)方法；學(xué)會用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌數(shù)量（工業(yè)生產(chǎn)中用于監(jiān)測發(fā)酵過程中的菌體生長情況）。實(shí)驗(yàn)原理：酵母菌是單細(xì)胞真菌，能在麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖；通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法可快速測定酵母菌的總菌數(shù)（包括活菌和死菌）。實(shí)驗(yàn)材料：菌種：釀酒酵母菌；試劑：麥芽汁培養(yǎng)基、生理鹽水；器材：血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、無菌吸管、恒溫?fù)u床。操作步驟：1.酵母菌培養(yǎng)：將釀酒酵母菌接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫?fù)u床（150rpm）培養(yǎng)24小時(shí)（酵母菌在有氧條件下生長迅速）。2.樣品稀釋：取1mL培養(yǎng)液，加入9mL生理鹽水（制成1:10稀釋液）；依此類推，制備1:100稀釋液（根據(jù)酵母菌濃度選擇）。3.血球計(jì)數(shù)板加樣：取少量稀釋液，滴在血球計(jì)數(shù)板的蓋玻片邊緣，讓液體自然滲入網(wǎng)格（避免氣泡）；靜置2分鐘。4.計(jì)數(shù)：用低倍鏡找到網(wǎng)格區(qū)域，計(jì)數(shù)5個(gè)中方格（如25×16網(wǎng)格中的4個(gè)角和中間的1個(gè)中方格）中的酵母菌數(shù)量；計(jì)算總菌數(shù)（公式：5個(gè)中方格的總菌數(shù)×稀釋倍數(shù)×10?）。示例：若5個(gè)中方格的總菌數(shù)為120，稀釋倍數(shù)為100，則總菌數(shù)=120×100×10?=1.2×10?CFU/mL。注意事項(xiàng)：酵母菌培養(yǎng)需有氧條件（搖床培養(yǎng)可增加溶氧量）；血球計(jì)數(shù)板需清潔（避免雜質(zhì)影響計(jì)數(shù)）；計(jì)數(shù)時(shí)需避免重復(fù)計(jì)數(shù)（遵循“計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右”的原則）。三、附錄（一）常用試劑與培養(yǎng)基配方1.革蘭氏染色液：結(jié)晶紫染液：結(jié)晶紫1g，95%乙醇20mL，1%草酸銨水溶液80mL（混合溶解）；碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水100mL（先將碘化鉀溶解在少量蒸餾水中，再加入碘，攪拌至溶解）；番紅染液：番紅0.5g，95%乙醇10mL，蒸餾水90mL（混合溶解）。2.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌培養(yǎng)）：配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.4；配制方法：將各成分溶解于蒸餾水，調(diào)pH至7.2-7.4，分裝后高壓滅菌（1