微專題16CRISPR/Cas9基因編輯、融合基因與融合蛋白、單酶切導致的正、反接的電泳檢測和PCR檢測考情速覽熱點考情CRISPR/Cas9基因編輯2024·新課標卷，35；2023·海南卷，20；2021·海南卷，25單酶切導致的正、反接的電泳檢測和PCR檢測2024·黑吉遼卷，17、25；2024·全國甲卷，38；2024·河北卷，24；2024·湖南卷，15；2023·山東卷，25；2024·江西卷，12；2024·浙江6月選考，19、20；2022·福建卷，13融合基因與融合蛋白2023·浙江6月選考，19；2023·遼寧卷，8；2023·江蘇卷，22；2023·天津卷，17熱點1CRISPR/Cas9基因編輯(2021·海南卷，25)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理如圖所示?；卮鹣铝袉栴}。(1)過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時所需要的酶是________。(2)過程②中，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌細胞的方法是______________________。(3)過程③～⑤中，sgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是________。隨后，Cas9蛋白可切割____________序列。(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1200bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是________，基因敲除成功的判斷依據(jù)是___________________________________________________________________。(5)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒，隨后將其導入到大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡述CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)，將該蛋白酶基因插入到基因組DNA的編輯過程：_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。CRISPR/Cas9是細菌體內(nèi)的用來對抗侵略細菌的外源DNA或噬菌體的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的、短回文重復DNA序列。Cas9蛋白是一種RNA引導的DNA內(nèi)切核酸酶，當細菌受到噬菌體的侵染時，它的某段DNA序列被Cas內(nèi)切核酸酶剪切后整合到CRISPR的間隔序列區(qū)域，當相同種類的噬菌體再次侵染細菌時，轉(zhuǎn)錄的crRNA可以引導Cas9蛋白找到并切斷噬菌體(形成平末端)釋放到細菌體內(nèi)的DNA，從而阻止噬菌體在細菌體內(nèi)繁殖。其作用機制大體可以分為三個步驟：(1)Cas內(nèi)切核酸酶(Cas酶)切割噬菌體獲取新的間隔序列。(2)將其引入原間隔序列并轉(zhuǎn)錄出crRNA。(3)crRNA和Cas9蛋白形成復合物精準切割與新間隔序列相同的基因。具體過程如圖所示。命題要點提醒：(1)質(zhì)粒構建：在一個載體上包含目標DNA片段的特定區(qū)域和Cas9內(nèi)切核酸酶基因。(2)基因編輯用途：定點基因編輯，構建一個質(zhì)粒即可，基因(部分)切除，需要構建兩個質(zhì)粒，兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出的sgRNA分別與基因的兩側(cè)堿基配對。(3)脫靶問題：即對基因組非特異性切割。有效解決方法：適當增加sgRNA的長度，設計出特異性較強的sgRNA。1.(經(jīng)典高考)近年誕生的具有劃時代意義的CRISPR/Cas9基因編輯技術可簡單、準確地進行基因定點編輯。其原理是由一條單鏈向?qū)NA引導內(nèi)切核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向?qū)NA中20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割(如圖)。下列相關敘述錯誤的是()A.Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成B.向?qū)NA中的雙鏈區(qū)遵循堿基配對原則C.向?qū)NA可在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成D.若α鏈剪切點附近序列為……TCCACAATC……則相應的識別序列為……UCCACAAUC……2.(2024·山東濰坊統(tǒng)考)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對基因組進行定點編輯，其工作原理如圖1所示。該系統(tǒng)主要包含單鏈向?qū)NA(sgRNA)和Cas9酶兩個部分，能特異性識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導Cas9酶到相應位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。請回答下列問題。(1)圖1為CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖，該系統(tǒng)能精準識別相關基因的原理是sgRNA與目標DNA發(fā)生________，Cas9酶可催化________(化學鍵名稱)水解，剪切特定DNA片段。(2)LMNA基因編碼的核纖層蛋白與維持細胞核正常形態(tài)有關?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9技術對體外培養(yǎng)HepG2(人源肺癌細胞)細胞株進行基因編輯，獲得了LMNA基因敲除的穩(wěn)定細胞系。①體外培養(yǎng)HepG2時需要一定比例的O2和CO2，其中CO2的主要作用是____________________；培養(yǎng)基除滅菌外還需要通過________________來保證無菌無毒環(huán)境。②HepG2細胞中沒有編碼Cas9的基因，需將Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并與質(zhì)粒結(jié)合導入HepG2細胞，用圖2中的質(zhì)粒以及含Cas9－sgRNA拼接基因的DNA片段構建表達載體時，應選用________進行酶切。③將構建好的表達載體與用________處理的細菌置于適宜反應體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細菌涂布于含________的平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，24h后挑取菌落，提取質(zhì)粒作為模板，選擇圖3中引物組合________和________，通過PCR和電泳技術鑒定是否重組成功。④用鑒定成功的工程菌對HepG2細胞進行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)三天后收集HepG2細胞，提取基因組，對其________序列進行檢測，判斷Cas9－sgRNA拼接基因是否導入成功。若從細胞水平進行檢測，可以檢測HepG2細胞數(shù)目增長量或________。熱點2融合基因與融合蛋白(2023·江蘇卷，22)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有________，擴增程序中最主要的不同是________。(2)有關基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應在下列選項中選用________。A.ATGGTG——CAACCAB.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAGD.CTGCAG——CTCGTC(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構建過程相比，無需使用的酶主要有___________________________________________________________________。(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化(5)為了驗證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設計，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質(zhì)粒P1～P4的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。(6)對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預期的質(zhì)粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。1.融合基因與融合蛋白(1)融合基因：是指將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套啟動子和終止子內(nèi)部構成的嵌合基因。啟動子基因1基因2基因3終止子(2)融合蛋白：是指融合基因的表達產(chǎn)物。(3)啟動子及其類型啟動子是一段具有特殊序列結(jié)構的DNA片段，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。主要包括以下三種類型：①組成型啟動子：能夠調(diào)控基因表達，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達水平不存在明顯差異。這類啟動子一般來自管家基因，可連續(xù)不斷地啟動基因的表達。②組織特異性啟動子：其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。如構建乳腺生物反應器時所用的在乳腺中特異表達的基因的啟動子。③誘導型啟動子：即在某些特定的物理或化學信號刺激后，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。2.獲得融合基因的方法一——以重疊延伸PCR技術為例以融合基因M和基因N為例，步驟是：(1)設計4種引物：引物1和引物4為普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互補配對。(2)PCR擴增：利用引物1和引物2擴增基因M，2輪循環(huán)可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4擴增基因N，2輪循環(huán)可得到N′型DNA分子。(3)獲得融合基因M＋N：將M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一個PCR管里，變性、復性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。3.獲得融合基因的方法二——無縫克隆技術In－Fusion技術，即無縫克隆和組裝技術，是一種新型的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點進行一個或多個目標DNA片段的插入。具體原理是：在載體末端和目的基因兩端應具有15～25個同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過引物設計實現(xiàn)的，In－Fusion酶能夠識別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來。命題要點：(1)質(zhì)粒構建過程：①采用酶切或者PCR擴增方法將載體線性化；②使用設計好的引物進行目的DNA片段的PCR擴增；③反應體系內(nèi)形成重組質(zhì)粒。(2)與傳統(tǒng)酶切、酶連相比的優(yōu)勢：①位點選擇靈活，在載體任意位置進行基因克??；②快速簡便；③克隆效率高，陽性克隆高達90%以上；④可同時克隆兩個或多個DNA片段。1.(2023·浙江6月選考，19)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是()A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子2.(2023·天津卷，17)構建可利用纖維素產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株是解決能源危機的手段之一，為此設計表達載體，思路如下。(1)外源基因的選擇纖維素常見生物降解途徑如下。纖維素Ⅰeq\o(→,\s\up7(酶Ⅰ))寡糖eq\o(→,\s\up7(酶Ⅱ))纖維二糖eq\o(→,\s\up7(酶Ⅲ))葡萄糖釀酒酵母通常無法吸收纖維素、寡糖和纖維二糖，應向釀酒酵母轉(zhuǎn)入上圖中三種酶的基因，并使其表達產(chǎn)物在細胞________(填“內(nèi)”或“外”)發(fā)揮作用。(2)外源基因的插入方法同源重組是堿基序列基本相同的DNA區(qū)段通過配對、鏈斷裂和再連接而產(chǎn)生片段交換的過程。通過同源重組將外源基因插入染色體的特定位點可獲得遺傳穩(wěn)定的工程菌株，如甲圖所示。釀酒酵母基因組有多個AB短序列。為通過同源重組將外源基因插入AB之間，在設計表達載體時，可采用PCR技術在外源基因兩端分別引入A和B，獲得乙圖所示長片段。PCR時應選用的一對引物為________(從P1～P6中選)。(3)標記基因的選擇URA3是尿嘧啶合成關鍵酶基因，常被用作標記基因。另外，URA3編碼的蛋白可將外源5－氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，導致細胞死亡。①為得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1，需將酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型釀酒酵母基因組AB之間，并利用________的培養(yǎng)基篩選存活菌株。②在后續(xù)插入酶Ⅱ基因時，為繼續(xù)利用URA3作為篩選標記，需切除菌株1的URA3。為此設計表達載體時，還應向URA3兩端引入釀酒酵母基因組中不存在的同源區(qū)段C和C′，并以下圖方式________排列才能通過同源重組達到上述目的。此后，需要將菌株1在________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，存活菌株即為URA3被成功切除的菌株1′。(4)表達載體的構建綜上，將三種酶基因依次插入釀酒酵母基因組中，在構建表達載體時，A、B、C、C′、URA3和酶基因應采用下圖________的排布方式。熱點3單酶切導致的正、反接的電泳檢測和PCR檢測(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在醫(yī)藥等領域有重要的應用價值。利用L－谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如下圖方法將釀酒酵母S的L－谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產(chǎn)菌株E.coliA，構建了以L－谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是()A.圖中表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ－氨基丁酸時，L－谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質(zhì)粒1.利用單酶切法和雙酶切法構建基因表達載體2.單酶切法中正向連接與反向連接的檢測(1)利用PCR進行檢測方法：用特定的引物對正向連接和反向連接的重組質(zhì)粒進行PCR擴增，二者得到的擴增產(chǎn)物長度不同。如