備案號(hào)：31332—2011靈芝(赤芝)菌種本標(biāo)準(zhǔn)編制依據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省食用菌行業(yè)協(xié)會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣東省食用菌行業(yè)協(xié)會(huì)、廣東省微生物研究所、廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：楊小兵、吳清平、朱少瓊、胡惠萍、李森柱、廖世煌、張一帆、黃龍花、邵滿超、周潔瑩。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。靈芝(赤芝)菌種本標(biāo)準(zhǔn)適用于靈芝(赤芝)固體菌種。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志(GB/T191,ISO780:1997,MOD)GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑完整，無(wú)損，無(wú)色透明試管總?cè)莘e的五分之一至四分之一接種塊大小(接種量)菌種外觀菌絲體特征2表1(續(xù))菌種外觀均勻、平展、無(wú)角變、無(wú)高溫抑制線菌絲分泌物無(wú)濃密、豐滿、旺健，長(zhǎng)速正常、整齊，菌絲有較多鎖狀聯(lián)合。不得檢出在CPDA(綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基(見附錄A.1.2)上，在避光、適溫(25℃±1℃)條件下，供種單位所供母種需經(jīng)出菇試驗(yàn)確認(rèn)農(nóng)藝性狀和商品性狀等種性合格后，方可用于擴(kuò)大繁殖或出售。產(chǎn)量性狀在正常條件下，以采用附錄B中提供的栽培培養(yǎng)基為例，總生物學(xué)效率應(yīng)不低于10%。供試菌株基因組的ITS(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列與參照菌株的ITS序列(Genbank登錄號(hào)：GU213485)進(jìn)行比對(duì)，相似性應(yīng)達(dá)98%或以上。完整，無(wú)損接種量(每支母種接原種數(shù)，接種物大小)4瓶(袋)～6瓶(袋),≥(12mm×15mm)3表3(續(xù))均勻、平展、無(wú)角變、無(wú)高溫抑制線、均勻緊貼瓶(袋)壁、無(wú)干縮無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)在適宜培養(yǎng)基上、適宜培養(yǎng)容器里(以附錄A.2.1為配方、使用13cm×26量每袋200g干料為例),在避光、適溫(25℃±1℃)條件下，菌絲長(zhǎng)速為8.0mm/d±0.8mm/d,菌絲長(zhǎng)滿容器的時(shí)間為16d～22d。完整，無(wú)損接種量[每瓶(袋)原種接栽培種數(shù)]30瓶(袋)～50瓶(袋)菌種外觀菌絲體特征生長(zhǎng)齊整，色澤一致，無(wú)角變，無(wú)高溫抑制線緊貼瓶(袋)壁、無(wú)干縮無(wú)無(wú)無(wú)4在適宜培養(yǎng)基上、適宜培養(yǎng)容器里(以附錄A.2.3為配方、使量每袋400g干料為例),在避光、適溫(25℃±1℃)條件下，菌絲長(zhǎng)速為6.7mm/d±0.8mm/d,菌絲按表5逐項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目肉眼觀察母種、原種肉眼觀察、測(cè)量栽培種肉眼觀察培養(yǎng)基上表面距瓶(袋)口的肉眼觀察菌種外觀各項(xiàng)(雜菌菌落除外)肉眼觀察肉眼觀察，必要時(shí)用5×放大肉眼觀察用放大倍數(shù)不低于400倍的光學(xué)顯微鏡對(duì)培養(yǎng)物的水封片進(jìn)行觀察，每一檢樣應(yīng)觀察不少于50個(gè)視℃~38℃避光震蕩培養(yǎng)1d,觀察培養(yǎng)液是否混濁。培養(yǎng)液混濁，為有細(xì)菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無(wú)細(xì)取少量疑有霉菌污染的培養(yǎng)物或菌塊，按無(wú)菌操作接種于PDA培養(yǎng)基(見附錄A中A.1.1)中，25℃~28℃避光培養(yǎng)3d～4d,出現(xiàn)白色以外色澤的菌落或非靈芝菌絲形態(tài)菌落的，或出現(xiàn)異味者為霉菌污染5參考附錄A中A.1的配方，可任選其一，25℃±1℃避光培養(yǎng)，以劃線記錄法每隔24h在容器表面記錄菌絲前沿位置，換算出菌絲生長(zhǎng)速度。記錄菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面所需天數(shù)(d)。參考附錄A中A.2的配方，可任選其一，25℃±1℃避光培養(yǎng)，以劃線記錄法每隔24h在容器表面記將被檢母種制成原種，再制成栽培種。參考附錄B規(guī)定的培養(yǎng)基配方，采用熟料袋栽栽培方法，制作三組(每組平均不少于50袋)合共不少于150袋菇包，菇包大小按NY/T528相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。三組在同一菇房?jī)?nèi)進(jìn)行栽培。接種后進(jìn)行符合靈芝生長(zhǎng)條件的常規(guī)管理。在首潮靈摘30個(gè)子實(shí)體測(cè)定生物學(xué)效率。根據(jù)表6所列項(xiàng)目，做好栽培記錄，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)將該母種的出間較對(duì)照菌株推遲5d以上(含5d)者，為不合格；產(chǎn)量顯著低于對(duì)照菌株者，為不合格；子實(shí)體外觀檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目母種長(zhǎng)滿所需時(shí)間(d)原種長(zhǎng)滿所需時(shí)間(d)菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基料面所需時(shí)間(d)總生物學(xué)效率(%)出第一潮菇所需時(shí)間(d)第一潮菇生物學(xué)效率(%)芝形平均單產(chǎn)(g/袋)芝蓋尺寸(mm)各級(jí)菌種都要留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)每個(gè)批號(hào)菌種3支(瓶、袋)～5支(瓶、袋),于避光、4℃~6℃下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存期母種為3個(gè)月，原種為2個(gè)月，栽培種為1個(gè)月。菌種量的10%、5%、1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支(瓶、袋);若一級(jí)抽樣超過(guò)100支(瓶、袋)66.2判定規(guī)則每支(瓶、袋)菌種應(yīng)貼(印)有清晰注明以下內(nèi)容的標(biāo)簽：a)產(chǎn)品名稱(如：靈芝母種);b)品種名稱(如：赤芝02);c)生產(chǎn)單位(如：××菌種廠);每箱(或其它包裝單位)菌種必須貼有清晰注明以下要素的包裝標(biāo)簽：7DB44/T868—2011外包裝可采用潔凈、干燥的塑料箱、編織袋或有足夠強(qiáng)度的紙箱，7.3.1不得與有毒品混裝、混運(yùn)。7.3.2氣溫達(dá)30℃或以上時(shí)，需用4℃~15℃冷藏車運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)間不得超過(guò)7d。7.3.3運(yùn)輸中必須有防震、防曬、防塵、防雨淋、防凍、防雜菌污染的措施。用于轉(zhuǎn)管保藏的母種，在4℃~6℃避光保藏不超過(guò)6個(gè)月；母種至使用時(shí)，在4℃~6℃避光保藏不超過(guò)90d;至銷售時(shí)，在4℃~6℃避光保藏不超過(guò)80d。原種應(yīng)盡快使用，在溫度不超過(guò)30℃、清潔、干燥、通風(fēng)(空氣相對(duì)濕度50%～70%)、避光的室內(nèi)存放不超過(guò)7d,在4℃~6℃下貯存時(shí)，貯存期不超過(guò)30d。栽培種應(yīng)盡快使用，在溫度不超過(guò)30℃、清潔、干燥、通風(fēng)(空氣相對(duì)濕度50%～70%)、避光的室內(nèi)存放不超過(guò)7d,在4℃~6℃下貯存時(shí)，貯存期不超過(guò)30d。8(資料性附錄)A.1.1PDA培養(yǎng)基(1000mL)馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL,pH自然。馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂0.5g,瓊脂20g,維生素B?20μg,水A.2.1顆粒培養(yǎng)基高粱80%、小米19%、輕質(zhì)碳酸鈣1%。高粱用水煮熟至掰開無(wú)白心，瀝去多余水分；小米使用前浸泡12小時(shí)，瀝去多余水分；高粱、小米和輕質(zhì)碳酸棉籽殼80%、麥麩19%、輕質(zhì)碳酸鈣1%。三者混合拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量達(dá)60%～65%,pH闊葉木雜木屑78%、麩皮20%、輕質(zhì)碳酸鈣2%。三者混合拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量達(dá)60%～65%,9(資料性附錄)靈芝栽培常用培養(yǎng)基B.1闊葉木雜木屑培養(yǎng)基闊葉木雜木屑78%、麩皮20%、輕質(zhì)碳酸鈣2%。三者混合拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量達(dá)60%～65%,(資料性附錄)靈芝菌種ITS序列分析法待測(cè)菌種CYM液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨2g,酵母膏2g,葡萄糖20g,硫酸鎂(MgSO?·7H?O)0.5g,磷酸氫二鉀(K?HPO?)1g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)1g,純水1000mL,pH自然。培養(yǎng)基分裝至三個(gè)500mL角瓶后滅菌，冷卻，接種，置于25℃130r/min搖床培養(yǎng)至菌絲生長(zhǎng)平臺(tái)期。菌絲真空抽濾，無(wú)菌水洗滌，低溫干燥，-CTAB(CetylTrimethylAmma)2倍CTAB提取液在65℃在水浴鍋中預(yù)熱。烯基吡咯烷酮(PVP)防氧化，將菌絲體充分研磨成c)樣品轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，管內(nèi)先加入600μL2倍CTAB提取液在65℃水浴鍋中預(yù)熱(用少量提取液洗下研缽上殘留的粉末樣品，輕輕混勻，在65℃中水浴30min～60min,其間每隔d)冷卻2min后，加入等體積(約600μL)的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),充分搖動(dòng)混勻。e)以約11000×g,離心10min,取上清液移入另一新1.5ml離心管，重復(fù)步驟d)操作，用氯仿/異戊醇(24:1)再抽提離心一次。同時(shí)將2/3體積的異丙醇(或2倍體積的無(wú)水乙醇)預(yù)冷。f)兩次抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇(或2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇),再加入約1/10體積的乙酸鈉(約30μL～50μL),緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，沉淀DNA。g)以約18000×g,離心15min,棄上清液。70%酒精(400μL)漂洗沉淀2次(快速翻轉(zhuǎn)振蕩幾分鐘),以約7000×g,離心5min,棄上清液，沉淀用紙巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低溫烘干(電風(fēng)筒吹干)。h)加1倍TE緩沖液(Tris10mmol/L+EDTA1mmol/L)溶解(約50μL)。-20℃保存?zhèn)溆?。采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物對(duì)ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:反應(yīng)體系：PCRTaqmix(2×)25μL,DNA模板5μg,通用引物(10μM)各4μL,以無(wú)菌雙蒸反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃1min→55℃1min→72℃1min,30C.2.4序列測(cè)定DB44/T868—2011擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，以PCR引物為測(cè)序引物，分別從正反鏈雙向測(cè)序，該操作由生物公司雙向序列拼接后在GenBank上進(jìn)行比對(duì)(Blast),若發(fā)現(xiàn)序列與GenBank上已知序列方向相反，則列相似性達(dá)98%以上時(shí)，則可判定待測(cè)菌與GenBank上該已知菌是同一個(gè)種。取赤芝(Gl-YW)為靈芝的參照種，其ITS序列登錄號(hào)為GU213485,其堿基序列如下：TCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGAGTAATGTGAATTGCAGA