人尿激肽原酶對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義腦血管?。–VD）嚴(yán)重威脅人類生命健康，是導(dǎo)致人類死亡的第三大原因，同時也是致殘率最高的疾病之一。2018年我國居民腦卒中患病率為1114.8/10萬人年，發(fā)病率為246.8/10萬人年，死亡率為149.49/10萬人年，共造成157萬人死亡，占總死亡人數(shù)的22.3%，意味著每5位死亡者中至少有1人死于腦卒中。在我國，約每12秒鐘就有1位中風(fēng)新發(fā)患者，每21秒鐘就有1人死于腦血管病，腦卒中患病率隨增齡而上升，在≥50歲人群最為顯著，平均發(fā)病年齡為66.4歲，男性為65.5歲，女性為67.6歲。其中，缺血性腦血管?。↖CVD）在全部腦血管病中占比超過70%，是由于腦部血液循環(huán)障礙，腦組織受損而發(fā)生的一系列癥狀，主要包括短暫性腦缺血發(fā)作和腦梗塞等。腦缺血發(fā)生后，急性梗死病灶由中心壞死區(qū)及周圍的缺血半暗帶組成。中心壞死區(qū)因完全性缺血，細(xì)胞死亡方式以壞死為主；而缺血半暗帶存在側(cè)支循環(huán)，細(xì)胞死亡方式則以凋亡為主。缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡數(shù)量在很大程度上決定了最終梗死灶的大小。因此，目前治療缺血性腦血管病的核心策略是盡早恢復(fù)梗塞區(qū)腦組織血流，促使缺血半暗帶神經(jīng)元存活，避免其發(fā)生凋亡。藥物能否抑制急性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元發(fā)生凋亡，成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是在生理和病理?xiàng)l件下的一種主動死亡方式，是受細(xì)胞內(nèi)基因和一些細(xì)胞外因子調(diào)控的生物學(xué)過程。在腦缺血再灌注損傷中，細(xì)胞凋亡扮演著關(guān)鍵角色。Bcl-2蛋白家族及Caspase蛋白家族在調(diào)控線粒體激活的細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中起重要的作用。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等。其中重要的抑制細(xì)胞凋亡蛋白是Bcl-2，在缺血后注定要存活的神經(jīng)元中表達(dá)。而重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白是Bax，Bcl-2與Bax的比值決定細(xì)胞受凋亡刺激后是死亡還是存活。凋亡細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑終點(diǎn)是Caspase-3的激活，因此，Caspase-3被認(rèn)為是凋亡的最重要的執(zhí)行蛋白，它大量表達(dá)可以直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。人尿激肽原酶是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的組成之一，通過作用于底物激肽原裂解出激肽和血管擴(kuò)張素，前者作用于相應(yīng)受體，發(fā)揮一系列生物作用。大量研究表明，激肽原酶在神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、糖尿病、癌癥、腎臟疾病等均具有良好的保護(hù)作用。在腦組織急性缺血缺氧時，人尿激肽原酶可發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)血管再生等作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究人尿激肽原酶對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響，有助于深入了解其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)和新的治療策略，對于改善患者預(yù)后、降低致殘率和死亡率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于人尿激肽原酶和腦缺血再灌注損傷的研究開展較早。早在20世紀(jì)90年代，就有研究關(guān)注到激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）在心血管系統(tǒng)中的作用，隨后逐漸拓展到對腦缺血的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血動物模型中，外源性給予激肽類似物能夠改善腦血流，減輕腦組織損傷。對于細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中的機(jī)制研究也較為深入，明確了線粒體途徑、死亡受體途徑等多種細(xì)胞凋亡信號通路在其中的關(guān)鍵作用，為后續(xù)研究人尿激肽原酶對細(xì)胞凋亡的影響奠定了理論基礎(chǔ)。國內(nèi)對人尿激肽原酶的研究始于21世紀(jì)初，隨著對缺血性腦血管病重視程度的提高，人尿激肽原酶作為一種潛在的治療藥物受到廣泛關(guān)注。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，人尿激肽原酶能夠改善急性缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損，提高患者的生活質(zhì)量。在基礎(chǔ)研究方面，國內(nèi)學(xué)者通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，深入探討人尿激肽原酶的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種作用。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然人尿激肽原酶對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已得到證實(shí)，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在細(xì)胞凋亡信號通路的調(diào)控方面，仍有許多未知環(huán)節(jié)需要進(jìn)一步探索。另一方面，現(xiàn)有的研究多集中在動物實(shí)驗(yàn)和短期臨床觀察，對于人尿激肽原酶長期應(yīng)用的安全性和有效性，以及其對患者遠(yuǎn)期預(yù)后的影響，還缺乏足夠的研究數(shù)據(jù)。基于以上研究現(xiàn)狀，本研究旨在通過建立急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，深入探討人尿激肽原酶對細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為臨床治療缺血性腦血管病提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目標(biāo)與方法本研究旨在通過建立急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，深入探究人尿激肽原酶對大鼠細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。具體而言，本研究將探討人尿激肽原酶是否能夠抑制急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的細(xì)胞凋亡，明確其對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響，從而揭示人尿激肽原酶在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究擬采用以下研究方法：首先，選用健康成年雄性SD大鼠，通過線栓法建立急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和人尿激肽原酶干預(yù)組，以確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可靠性。其次，在再灌注后的不同時間點(diǎn)，運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，直觀地觀察蛋白表達(dá)的變化情況。再者，利用TUNEL法檢測各組大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量，準(zhǔn)確地評估細(xì)胞凋亡的程度。最后，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以明確人尿激肽原酶對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用提供有力的支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1急性局灶性腦缺血再灌注損傷概述腦缺血再灌注損傷是指腦組織在經(jīng)歷一段時間的缺血后，恢復(fù)血液供應(yīng)時，反而出現(xiàn)更嚴(yán)重的損傷。正常情況下，大腦依靠充足的血液供應(yīng)來維持其正常的生理功能，血液為大腦提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時帶走代謝廢物。當(dāng)腦缺血發(fā)生時，由于腦部血液循環(huán)障礙，腦組織無法獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)，導(dǎo)致能量代謝紊亂，細(xì)胞功能受損。若在一定時間內(nèi)恢復(fù)血流，本應(yīng)使受損的腦組織得到恢復(fù)，但實(shí)際上，恢復(fù)血流后，缺血腦組織會發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理變化，導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重，這便是腦缺血再灌注損傷。急性局灶性腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個方面。能量代謝障礙是其重要的起始環(huán)節(jié)。在缺血期間，由于氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足，細(xì)胞內(nèi)的線粒體無法正常進(jìn)行有氧呼吸，導(dǎo)致ATP生成急劇減少。ATP的缺乏使得細(xì)胞膜上的離子泵功能受損，如鈉鉀泵、鈣泵等，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)離子失衡，鈉離子和鈣離子大量內(nèi)流，鉀離子外流。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是導(dǎo)致后續(xù)損傷的關(guān)鍵因素之一，它可以激活一系列酶類，如蛋白酶、磷脂酶等，這些酶的異常激活會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器等受損。氧化應(yīng)激在急性局灶性腦缺血再灌注損傷中也起著關(guān)鍵作用。在缺血再灌注過程中，由于氧自由基的大量產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇。正常情況下，體內(nèi)的氧自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)，少量的氧自由基可以參與正常的生理代謝過程。但在缺血再灌注時，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞異常，使得氧分子接受單個電子后生成大量的超氧陰離子自由基。同時，缺血再灌注還會激活黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生更多的氧自由基。這些過量的氧自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，它們可以攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性和通透性改變，影響細(xì)胞的正常功能。此外，氧自由基還可以損傷蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶活性喪失以及DNA斷裂等，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。炎癥反應(yīng)也是急性局灶性腦缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。在缺血再灌注后，腦組織中的炎癥細(xì)胞被激活，如小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可以吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集到缺血部位，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)加劇。炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放會破壞血腦屏障的完整性，使血管通透性增加，引起腦水腫。同時，炎癥反應(yīng)還會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，進(jìn)一步加重腦組織的損傷。細(xì)胞凋亡與急性局灶性腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。在缺血半暗帶，由于存在一定程度的血流灌注，但仍不足以維持細(xì)胞的正常功能，細(xì)胞死亡方式以凋亡為主。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在腦缺血再灌注損傷中，多種因素可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號通路。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，在缺血再灌注損傷時，線粒體膜電位下降，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等執(zhí)行蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，死亡受體途徑也參與了腦缺血再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡過程。死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體等與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可激活Caspase-8，進(jìn)而激活Caspase-3等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在急性局灶性腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用，它不僅直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，還會影響缺血半暗帶的存活和修復(fù)，最終影響腦梗死灶的大小和神經(jīng)功能的恢復(fù)。2.2細(xì)胞凋亡相關(guān)理論細(xì)胞凋亡，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種在生理和病理?xiàng)l件下，由基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程，對維持多細(xì)胞生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、個體發(fā)育及組織器官穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡的過程有序且復(fù)雜，大致可分為凋亡誘導(dǎo)、凋亡執(zhí)行和凋亡清除三個階段。在凋亡誘導(dǎo)階段，細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性凋亡信號刺激，如氧化應(yīng)激、DNA損傷、生長因子缺乏、死亡受體激活等，這些信號激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，為細(xì)胞凋亡的啟動做準(zhǔn)備。在凋亡執(zhí)行階段，細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成凋亡小體；細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，DNA被核酸內(nèi)切酶降解為180-200bp整數(shù)倍的片段；線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活Caspase蛋白酶家族，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，切割細(xì)胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。凋亡清除階段，凋亡小體被周圍吞噬細(xì)胞識別并吞噬清除，防止細(xì)胞內(nèi)容物泄漏引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多條信號通路和眾多調(diào)控因子。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵內(nèi)源性通路，在腦缺血再灌注損傷中起重要作用。正常情況下，線粒體膜電位穩(wěn)定，維持細(xì)胞正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到缺血再灌注等損傷刺激時，線粒體膜電位下降，通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等效應(yīng)Caspases，切割細(xì)胞內(nèi)多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白家族是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等）?？沟蛲龅鞍淄ㄟ^抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放、阻止細(xì)胞色素C釋放等機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡；促凋亡蛋白則通過與抗凋亡蛋白相互作用、形成寡聚體插入線粒體膜，促進(jìn)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放和細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax是Bcl-2蛋白家族中研究較多的成員，Bcl-2主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，具有抗凋亡作用；Bax通常以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)，凋亡信號刺激下，Bax發(fā)生構(gòu)象改變，轉(zhuǎn)位到線粒體膜，與Bcl-2相互作用，Bcl-2與Bax的比值決定細(xì)胞受凋亡刺激后是存活還是死亡。比值高時，抗凋亡作用占優(yōu)勢，細(xì)胞存活；比值低時，促凋亡作用占優(yōu)勢，細(xì)胞傾向于凋亡。Caspase蛋白家族是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起核心作用，可分為起始Caspases（如Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10）和效應(yīng)Caspases（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）。起始Caspases在凋亡信號刺激下通過招募結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物被激活；效應(yīng)Caspases則被起始Caspases激活，激活后的效應(yīng)Caspases切割細(xì)胞內(nèi)多種重要蛋白質(zhì)底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，在腦缺血再灌注損傷后，其活性顯著升高，大量表達(dá)可直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，常作為評估細(xì)胞凋亡程度的重要指標(biāo)。2.3人尿激肽原酶相關(guān)理論人尿激肽原酶（HumanUrinaryKallidinogenase），又被稱為尤瑞克林，是從健康男性尿液中提取得到的一種糖蛋白，屬于激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的關(guān)鍵組成部分。其化學(xué)本質(zhì)為絲氨酸蛋白酶，由238個氨基酸殘基組成，分子量約為33kDa，包含一個催化結(jié)構(gòu)域和一個底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了人尿激肽原酶特異性裂解激肽原的能力，使其在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用。人尿激肽原酶的作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過激活激肽原轉(zhuǎn)化為激肽，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)人尿激肽原酶作用于激肽原時，可裂解其特定的肽鍵，釋放出具有生物活性的激肽，如緩激肽和胰激肽。這些激肽能夠與相應(yīng)的受體，即B1和B2受體結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)通路。與B2受體結(jié)合后，可激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活蛋白激酶C（PKC）；DAG則直接激活PKC，PKC進(jìn)一步磷酸化下游的多種蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。激肽與B2受體結(jié)合還可激活一氧化氮合酶（NOS），促進(jìn)一氧化氮（NO）的生成，NO作為一種重要的信號分子，具有強(qiáng)大的血管舒張作用，能夠擴(kuò)張血管，增加局部組織的血液灌注。同時，NO還可以抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附，減少血栓形成和炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，人尿激肽原酶展現(xiàn)出了顯著的應(yīng)用價值。大量研究表明，人尿激肽原酶對缺血性腦損傷具有良好的保護(hù)作用。在急性腦缺血缺氧的情況下，人尿激肽原酶可通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。一方面，它能夠增加缺血腦組織的血流灌注，改善腦組織的微循環(huán)。通過激活KKS，產(chǎn)生的激肽與B2受體結(jié)合，促使血管平滑肌舒張，增加側(cè)支循環(huán)的開放，使缺血半暗帶的血液供應(yīng)得到改善，為受損的神經(jīng)細(xì)胞提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而挽救瀕臨死亡的神經(jīng)細(xì)胞。另一方面，人尿激肽原酶具有抗氧化和抗炎作用。它可以降低缺血缺氧引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕神經(jīng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的損傷。同時，抑制炎癥因子的釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損害。此外，人尿激肽原酶還能促進(jìn)神經(jīng)血管再生，刺激血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，為神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生提供良好的微環(huán)境。在臨床實(shí)踐中，人尿激肽原酶已被用于治療急性缺血性腦卒中，多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，它能夠顯著改善患者的神經(jīng)功能缺損程度，提高患者的日常生活活動能力，降低死亡率和致殘率，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動物與材料選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重250-300g，購自[實(shí)驗(yàn)動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。大鼠在實(shí)驗(yàn)室動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。人尿激肽原酶（規(guī)格：[具體規(guī)格]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），使用時用生理鹽水稀釋至所需濃度。主要試劑包括兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體（均購自[抗體供應(yīng)商名稱]），即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]），蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]），多聚甲醛、檸檬酸緩沖液、PBS緩沖液等其他常規(guī)試劑，均為分析純，購自[試劑供應(yīng)商名稱]。主要儀器設(shè)備有電子天平（品牌：[天平品牌]，型號：[天平型號]），用于大鼠稱重；手術(shù)顯微鏡（品牌：[顯微鏡品牌]，型號：[顯微鏡型號]），用于手術(shù)操作時觀察血管；恒溫加熱板（品牌：[加熱板品牌]，型號：[加熱板型號]），維持大鼠體溫；高速冷凍離心機(jī)（品牌：[離心機(jī)品牌]，型號：[離心機(jī)型號]），用于組織勻漿的離心；石蠟切片機(jī)（品牌：[切片機(jī)品牌]，型號：[切片機(jī)型號]），制作組織切片；光學(xué)顯微鏡（品牌：[顯微鏡品牌]，型號：[顯微鏡型號]）及圖像分析系統(tǒng)（品牌：[圖像分析系統(tǒng)品牌]，型號：[圖像分析系統(tǒng)型號]），用于觀察切片和分析圖像。3.2實(shí)驗(yàn)動物分組與模型建立將60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為假手術(shù)組、模型組、人尿激肽原酶低劑量組（簡稱低劑量組）、人尿激肽原酶中劑量組（簡稱中劑量組）、人尿激肽原酶高劑量組（簡稱高劑量組）。采用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞再灌注（MCAO/R）模型。具體操作如下：大鼠稱重后，用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部去毛，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域。沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），在ECA起始部結(jié)扎，在ICA近心端放置一備用絲線，暫時不結(jié)扎。在手術(shù)顯微鏡下，用眼科剪在CCA上剪一小口，將預(yù)先準(zhǔn)備好的直徑為0.26mm的尼龍線（頭端加熱成光滑球形）經(jīng)CCA切口插入ICA，緩慢推進(jìn)，直至遇到輕微阻力，表明尼龍線已進(jìn)入大腦中動脈（MCA）起始部，插入深度約為（18±0.5）mm，此時阻斷MCA血流，造成腦缺血。結(jié)扎ICA上的備用絲線，固定尼龍線，逐層縫合頸部皮膚。缺血2h后，輕輕拔出尼龍線，恢復(fù)MCA血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠僅分離頸部血管，不插入尼龍線。術(shù)后密切觀察大鼠的蘇醒情況、神經(jīng)行為學(xué)變化及有無感染等并發(fā)癥。3.3實(shí)驗(yàn)處理與檢測指標(biāo)模型建立成功后，假手術(shù)組和模型組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠分別于再灌注即刻尾靜脈注射人尿激肽原酶，劑量依次為0.05PNA單位/kg、0.1PNA單位/kg、0.2PNA單位/kg，注射體積均為1ml/kg，注射時間控制在5min內(nèi)。在再灌注24h后，采用Longa5分制法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，以評估大鼠的神經(jīng)功能。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測各組大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量。取各組大鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片。切片脫蠟至水后，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先用蛋白酶K溶液孵育切片，以通透細(xì)胞膜，使TdT酶能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA斷裂處結(jié)合。然后加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，在37℃孵育1h，TdT酶催化dUTP連接到DNA斷裂的3'-OH末端。接著用生物素化的抗地高辛抗體孵育切片，與生物素標(biāo)記的dUTP結(jié)合。最后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，與抗地高辛抗體結(jié)合，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。隨機(jī)選取5個高倍視野（×400），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。運(yùn)用免疫組化法檢測各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后將切片放入檸檬酸緩沖液中，進(jìn)行抗原修復(fù)。修復(fù)后，用正常山羊血清封閉切片30min，以減少非特異性染色。接著分別加入兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體（稀釋度均為1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30min。再次用PBS沖洗后，加入SABC復(fù)合物，37℃孵育30min。最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色。采用圖像分析系統(tǒng)，測定陽性產(chǎn)物的平均光密度值，以反映蛋白的表達(dá)水平。通過Westernblot法進(jìn)一步檢測各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)。取各組大鼠腦組織，加入適量的蛋白裂解液，冰上勻漿，然后在4℃下以12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。接著分別加入兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體（稀釋度均為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光、顯影、定影。采用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，測定各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，以反映蛋白的相對表達(dá)水平。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本研究中的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1人尿激肽原酶對大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響在再灌注24h后，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，結(jié)果如表1所示。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能正常，評分為0分。模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，平均評分為（2.92±0.45）分。與模型組相比，人尿激肽原酶各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低（P＜0.05），其中高劑量組的評分最低，為（1.38±0.31）分，中劑量組次之，為（1.83±0.35）分，低劑量組為（2.25±0.38）分。這表明人尿激肽原酶能夠顯著改善急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，且呈劑量依賴性，劑量越高，改善作用越明顯。通過進(jìn)一步分析不同劑量組之間的差異，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中劑量組、低劑量組相比，神經(jīng)功能缺損評分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了人尿激肽原酶改善神經(jīng)功能的作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)。表1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（x±s，分）組別n神經(jīng)功能缺損評分假手術(shù)組120模型組122.92±0.45低劑量組122.25±0.38*中劑量組121.83±0.35*#高劑量組121.38±0.31*#△注：與模型組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。4.2人尿激肽原酶對大鼠腦梗死體積的影響采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法對各組大鼠腦組織進(jìn)行染色，以觀察腦梗死體積的變化。正常腦組織被TTC染成紅色，而梗死腦組織因缺乏琥珀酸脫氫酶，不能將TTC還原為紅色的甲臜，故呈現(xiàn)蒼白色。從染色結(jié)果（圖1）可以直觀地看出，假手術(shù)組大鼠腦組織未見明顯的梗死灶，顏色均勻呈紅色；模型組大鼠腦組織可見明顯的大片蒼白色梗死區(qū)域，主要位于大腦中動脈供血區(qū)；人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦梗死灶面積均小于模型組，且隨著人尿激肽原酶劑量的增加，梗死灶面積逐漸減小。圖1各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果（×4）注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組。對各組大鼠腦梗死體積進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表2所示。模型組大鼠腦梗死體積為（38.56±4.21）%，與人尿激肽原酶各劑量組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低劑量組腦梗死體積為（30.25±3.56）%，中劑量組為（24.18±3.12）%，高劑量組為（18.63±2.85）%。進(jìn)一步分析各劑量組之間的差異，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中劑量組、低劑量組相比，腦梗死體積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明人尿激肽原酶能夠顯著減小急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，且這種減小作用呈劑量依賴性，劑量越高，腦梗死體積減小越明顯。表2各組大鼠腦梗死體積比較（x±s，%）組別n腦梗死體積假手術(shù)組120模型組1238.56±4.21低劑量組1230.25±3.56*中劑量組1224.18±3.12*#高劑量組1218.63±2.85*#△注：與模型組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。4.3人尿激肽原酶對大鼠腦細(xì)胞凋亡的影響通過TUNEL染色法對各組大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。在光學(xué)顯微鏡下，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色。假手術(shù)組大鼠腦組織中僅可見少量散在的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分比為（3.25±0.68）%。模型組大鼠腦組織中可見大量凋亡細(xì)胞，主要分布于缺血半暗帶區(qū)域，凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，達(dá)到（25.63±3.12）%，與假手術(shù)組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。圖2各組大鼠腦組織TUNEL染色結(jié)果（×400）注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組。人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯少于模型組。低劑量組凋亡細(xì)胞百分比為（18.56±2.56）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組凋亡細(xì)胞百分比進(jìn)一步降低至（12.38±2.15）%，與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組凋亡細(xì)胞百分比最低，為（7.63±1.83）%，與中劑量組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明人尿激肽原酶能夠顯著抑制急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦細(xì)胞凋亡，且抑制作用呈劑量依賴性，隨著人尿激肽原酶劑量的增加，對細(xì)胞凋亡的抑制效果越明顯。4.4人尿激肽原酶對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響免疫組化檢測結(jié)果顯示，Bcl-2陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。假手術(shù)組大鼠腦組織中Bcl-2陽性表達(dá)較強(qiáng)，陽性細(xì)胞主要分布于大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)等部位。模型組大鼠腦組織中Bcl-2陽性表達(dá)明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與假手術(shù)組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦組織中Bcl-2陽性表達(dá)均較模型組增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量增多。其中，高劑量組Bcl-2陽性表達(dá)最強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量最多，與中劑量組、低劑量組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明人尿激肽原酶能夠上調(diào)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。Bax陽性產(chǎn)物同樣主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。假手術(shù)組大鼠腦組織中Bax陽性表達(dá)較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少。模型組大鼠腦組織中Bax陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與假手術(shù)組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦組織中Bax陽性表達(dá)均較模型組減弱，陽性細(xì)胞數(shù)量減少。高劑量組Bax陽性表達(dá)最弱，陽性細(xì)胞數(shù)量最少，與中劑量組、低劑量組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明人尿激肽原酶能夠下調(diào)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bax蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。Caspase-3陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。假手術(shù)組大鼠腦組織中Caspase-3陽性表達(dá)較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少。模型組大鼠腦組織中Caspase-3陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與假手術(shù)組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦組織中Caspase-3陽性表達(dá)均較模型組減弱，陽性細(xì)胞數(shù)量減少。高劑量組Caspase-3陽性表達(dá)最弱，陽性細(xì)胞數(shù)量最少，與中劑量組、低劑量組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明人尿激肽原酶能夠下調(diào)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。Westernblot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），Bax和Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與人尿激肽原酶各劑量組相比，模型組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。人尿激肽原酶各劑量組中，高劑量組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量最高，Bax和Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量最低，與中劑量組、低劑量組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組與低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了人尿激肽原酶能夠上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。人尿激肽原酶對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響可能通過以下機(jī)制實(shí)現(xiàn)：人尿激肽原酶激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，產(chǎn)生的激肽與B2受體結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。Akt被激活后，可磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性，同時促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax的比值，抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制Caspase-3的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡。人尿激肽原酶還可能通過抗氧化、抗炎等作用，減輕缺血再灌注損傷對細(xì)胞的損害，間接抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。五、結(jié)果討論5.1人尿激肽原酶對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積的影響本研究結(jié)果表明，人尿激肽原酶能夠顯著改善急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，且呈劑量依賴性。模型組大鼠在腦缺血再灌注24h后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能缺損評分較高；而人尿激肽原酶各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均顯著低于模型組，其中高劑量組的評分最低，中劑量組次之，低劑量組相對較高。這說明人尿激肽原酶能夠有效減輕腦缺血再灌注損傷對大鼠神經(jīng)功能的損害，提高大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)程度。從腦梗死體積的結(jié)果來看，人尿激肽原酶同樣表現(xiàn)出顯著的作用。模型組大鼠腦組織可見明顯的大片梗死區(qū)域，腦梗死體積較大；人尿激肽原酶各劑量組大鼠腦梗死灶面積均小于模型組，且隨著人尿激肽原酶劑量的增加，梗死灶面積逐漸減小。這表明人尿激肽原酶能夠顯著減小急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，減少腦組織的壞死范圍。人尿激肽原酶改善神經(jīng)功能和減小腦梗死體積的作用機(jī)制可能與以下幾個方面有關(guān)。人尿激肽原酶可以激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，產(chǎn)生的激肽與B2受體結(jié)合，促使血管平滑肌舒張，增加側(cè)支循環(huán)的開放，從而改善缺血腦組織的血流灌注，為受損的神經(jīng)細(xì)胞提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，挽救瀕臨死亡的神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而減小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。人尿激肽原酶具有抗氧化和抗炎作用。在腦缺血再灌注過程中，會產(chǎn)生大量的氧自由基和炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡。人尿激肽原酶可以降低細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制炎癥因子的釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損害，保護(hù)神經(jīng)功能。人尿激肽原酶還能促進(jìn)神經(jīng)血管再生。它可以刺激血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，為神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生提供良好的微環(huán)境，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。在臨床應(yīng)用方面，人尿激肽原酶的這些作用具有重要的前景。急性缺血性腦卒中是一種常見的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。目前，臨床上對于急性缺血性腦卒中的治療主要包括溶栓、抗血小板、抗凝等，但這些治療方法存在一定的局限性和風(fēng)險。人尿激肽原酶作為一種新型的治療藥物，能夠通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為急性缺血性腦卒中的治療提供了新的選擇。它可以在腦缺血早期應(yīng)用，改善腦組織的血流灌注，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，降低腦梗死體積，從而提高患者的神經(jīng)功能恢復(fù)程度，降低致殘率和死亡率。人尿激肽原酶還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，如與溶栓藥物聯(lián)合，可能會增強(qiáng)溶栓效果，減少溶栓后的并發(fā)癥；與抗血小板藥物聯(lián)合，可能會進(jìn)一步改善患者的預(yù)后。然而，人尿激肽原酶在臨床應(yīng)用中仍需進(jìn)一步研究和優(yōu)化，包括最佳的用藥劑量、用藥時間、用藥途徑等，以確保其安全性和有效性。5.2人尿激肽原酶對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡的影響本研究通過TUNEL染色法檢測發(fā)現(xiàn)，人尿激肽原酶能夠顯著抑制急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦細(xì)胞凋亡，且抑制作用呈劑量依賴性。這一結(jié)果與以往的相關(guān)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了人尿激肽原酶在抑制腦細(xì)胞凋亡方面的重要作用。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2蛋白家族及Caspase蛋白家族起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Bcl-2是重要的抑制細(xì)胞凋亡蛋白，在缺血后注定要存活的神經(jīng)元中表達(dá)；而Bax是重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，Bcl-2與Bax的比值決定細(xì)胞受凋亡刺激后是死亡還是存活。本研究中，免疫組化和Westernblot檢測結(jié)果均表明，人尿激肽原酶能夠上調(diào)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，從而提高Bcl-2與Bax的比值，抑制細(xì)胞凋亡。Caspase-3是凋亡的最重要的執(zhí)行蛋白，其大量表達(dá)可以直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，人尿激肽原酶能夠下調(diào)急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。人尿激肽原酶可能通過激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，產(chǎn)生的激肽與B2受體結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。Akt被激活后，可磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性，同時促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax的比值，抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制Caspase-3的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡。人尿激肽原酶還可能通過抗氧化、抗炎等作用，減輕缺血再灌注損傷對細(xì)胞的損害，間接抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。從不同劑量的人尿激肽原酶作用效果來看，高劑量組對細(xì)胞凋亡的抑制效果最為顯著，中劑量組次之，低劑量組相對較弱。這表明在一定范圍內(nèi)，人尿激肽原酶的劑量越高，對腦細(xì)胞凋亡的抑制作用越強(qiáng)。然而，過高劑量的人尿激肽原酶是否會帶來其他不良反應(yīng)，還需要進(jìn)一步的研究探討。在臨床應(yīng)用中，需要綜合考慮藥物的療效和安全性，確定最佳的用藥劑量。人尿激肽原酶對缺血半暗帶神經(jīng)元具有重要的保護(hù)作用。缺血半暗帶存在側(cè)支循環(huán)，細(xì)胞死亡方式以凋亡為主，其神經(jīng)元凋亡數(shù)量在很大程度上決定了最終梗死灶的大小。人尿激肽原酶通過抑制腦細(xì)胞凋亡，能夠減少缺血半暗帶神經(jīng)元的死亡，從而縮小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。這對于急性缺血性腦血管病的治療具有重要意義，為臨床治療提供了新的思路和方法。未來的研究可以進(jìn)一步探討人尿激肽原酶與其他神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)合使用的效果，以及其在不同時間窗內(nèi)應(yīng)用的最佳時機(jī)，以進(jìn)一步提高急性缺血性腦血管病的治療效果。5.3人尿激肽原酶對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響的機(jī)制探討人尿激肽原酶對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，主要通過調(diào)控Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族來實(shí)現(xiàn)。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白家族處于平衡狀態(tài)，Bcl-2等抗凋亡蛋白與Bax等促凋亡蛋白相互作用，維持著細(xì)胞的存活。然而，在急性局灶性腦缺血再灌注損傷時，這種平衡被打破。腦缺血再灌注損傷會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，這些自由基會攻擊線粒體膜，使線粒體膜電位下降，從而激活線粒體凋亡途徑。在這一過程中，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，它會從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，與線粒體膜上的Bcl-2蛋白相互作用，形成異源二聚體。Bax的這種轉(zhuǎn)位和相互作用會導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，使細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等執(zhí)行蛋白酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。人尿激肽原酶能夠通過激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，產(chǎn)生的激肽與B2受體結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。激活后的Akt可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Bax等的活性。Akt可以使Bad蛋白的絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，磷酸化后的Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合的能力，抑制其促凋亡作用。Akt還可以直接磷酸化Bax，抑制Bax的線粒體轉(zhuǎn)位，從而減少線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制細(xì)胞色素C的釋放。Akt還能促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Akt可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促進(jìn)Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加Bcl-2蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白表達(dá)的增加可以與Bax形成更多的異源二聚體，降低Bax的促凋亡活性，同時還可以直接抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。在Caspase蛋白家族方面，由于細(xì)胞色素C的釋放減少，凋亡小體的形成受到抑制，Caspase-9的激活也相應(yīng)減少。Caspase-9的激活減少使得下游Caspase-3的激活也受到抑制。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，其活性降低后，無法有效地切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、核纖層蛋白等，從而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。人尿激肽原酶還可能通過抗氧化、抗炎等作用，間接抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。在腦缺血再灌注損傷過程中，會產(chǎn)生大量的氧自由基和炎癥因子，這些物質(zhì)會損傷細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。人尿激肽原酶可以降低細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制炎癥因子的釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)對細(xì)胞的損害，間接抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用。5.4研究結(jié)果的局限性與展望本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。本研究采用的是大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型，雖然該模型能夠較好地模擬人類急性缺血性腦血管病的病理生理過程，但動物模型與人類疾病之間仍存在差異，不能完全反映人尿激肽原酶在人體中的作用機(jī)制和療效。未來的研究可以進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證人尿激肽原酶在人類急性缺血性腦血管病中的治療效果和安全性。在人尿激肽原酶的劑量選擇上，本研究僅設(shè)置了三個劑量組，雖然觀察到了劑量依賴性的作用效果，但對于最佳劑量的確定還不夠精確。后續(xù)研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大劑量范圍，設(shè)置更多的劑量組，進(jìn)行更深入的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究，以確定人尿激肽原酶的最佳治療劑量。本研究雖然探討了人尿激肽原酶對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制，但細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多條信號通路和眾多調(diào)控因子。未來的研究可以進(jìn)一步深入探究人尿激肽原酶對其他相關(guān)信號通路和調(diào)控因子的影響，以全面揭示其抗凋亡作用的分子機(jī)制。展望未來，人尿激肽原酶作為一種具有潛在應(yīng)用價值的神經(jīng)保護(hù)藥物，在急性缺血性腦血管病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。進(jìn)一步的研究可以從以下幾個方面展開：結(jié)合基因編輯技術(shù)，深入研究人尿激肽原酶作用的關(guān)鍵基因和靶點(diǎn)，通過基因調(diào)控增強(qiáng)其神經(jīng)保護(hù)作用；探索人尿激肽原酶與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與干細(xì)胞治療、基因治療等相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果；研發(fā)新型的藥物遞送系統(tǒng)，提高人尿激肽原酶的生物利用度和靶向性，減少藥物的不良反應(yīng)。相信隨著研究的不斷深入，人尿激肽原酶將為急性缺血性腦血管病的治療帶來新的突破，為患者的康復(fù)帶來更多的希望。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過建立急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，深入探討了人尿激肽原酶對細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，得出以下主要結(jié)論：人尿激肽原酶能夠顯著改善急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。在再灌注24h后，人尿激肽原酶各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均顯著低于模型組，且呈劑量依賴性，高劑量組的改善效果最為明顯。這表明人尿激肽原酶可以有效減輕腦缺血再灌注對大鼠神經(jīng)功能的損害，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。人尿激肽原酶能夠顯著改善急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。在再灌注24h后，人尿激肽原酶各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均顯著