人CEA基因疫苗的構建及其在舌癌細胞株中的表達與作用機制探究一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，近年來其發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。癌癥已成為全球范圍內導致死亡的主要原因之一，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。舌癌作為頭頸部常見的惡性腫瘤，在口腔癌中占據(jù)重要比例。其發(fā)病原因與多種因素相關，如長期吸煙、酗酒、嚼檳榔、口腔衛(wèi)生不良以及人乳頭瘤病毒（HPV）感染等。舌癌不僅會導致患者舌頭疼痛、吞咽困難、語言障礙等，嚴重影響口腔功能和生活質量，還具有較高的惡性程度和轉移傾向。若不及時治療，癌細胞可迅速擴散至頸部淋巴結及其他遠處器官，對患者的生命健康構成極大威脅。目前，針對舌癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術切除、化療和放療。手術切除是早期舌癌的主要治療手段，但對于中晚期舌癌，由于癌細胞的廣泛浸潤和轉移，手術往往難以徹底清除腫瘤組織，且術后易復發(fā)?；熗ㄟ^使用化學藥物殺死癌細胞，但這些藥物在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，引發(fā)一系列嚴重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，導致患者生活質量急劇下降，且長期化療還可能使癌細胞產生耐藥性，降低治療效果。放療則是利用放射線照射腫瘤部位，以破壞癌細胞的DNA結構，抑制其生長和分裂。然而，放療同樣會對周圍正常組織產生輻射損傷，引發(fā)口腔黏膜炎、口干癥、放射性齲齒等并發(fā)癥，影響患者的生活質量和后續(xù)康復。因此，開發(fā)一種安全、有效且副作用小的新型治療方法對于舌癌患者至關重要。基因疫苗療法作為一種新興的癌癥治療手段，為舌癌的治療帶來了新的希望。癌胚抗原（CEA）是一種常見的腫瘤標志物，在多種惡性腫瘤，如結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌以及舌癌等中均有較高表達，且其表達量與癌癥的嚴重程度密切相關。基于CEA基因的疫苗療法，通過誘導機體免疫系統(tǒng)識別并攻擊表達CEA的癌細胞，具有特異性強、副作用小、可激發(fā)機體長期免疫記憶等優(yōu)勢，有望成為舌癌治療的新突破點。本研究旨在構建人CEA基因疫苗，并探究其在舌癌細胞株中的表達情況，為舌癌的基因治療提供實驗依據(jù)和理論基礎。通過深入研究CEA基因疫苗對舌癌細胞的作用機制，有望為臨床治療舌癌開辟新的途徑，提高舌癌患者的生存率和生活質量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1人CEA基因疫苗的研究進展癌胚抗原（CEA）自被發(fā)現(xiàn)以來，便成為腫瘤研究領域的重點關注對象。早在20世紀60年代，科學家首次從結腸癌組織中分離出CEA，證實其在多種腫瘤組織中高表達。隨后，大量研究聚焦于CEA作為腫瘤標志物的臨床價值，發(fā)現(xiàn)其血清水平與腫瘤的分期、轉移及預后密切相關，可用于腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測和療效評估。隨著免疫學和分子生物學技術的飛速發(fā)展，基于CEA的基因疫苗研究逐漸興起。國外在CEA基因疫苗領域起步較早，取得了一系列重要成果。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的研究團隊率先開展了CEA基因疫苗的動物實驗，通過將編碼CEA的基因導入小鼠體內，成功誘導了機體的免疫應答，對表達CEA的腫瘤細胞產生了明顯的抑制作用。此后，多項臨床前研究進一步優(yōu)化了CEA基因疫苗的設計，包括選擇合適的基因載體、添加免疫佐劑等，以增強疫苗的免疫原性和抗腫瘤效果。例如，利用腺病毒載體構建的CEA基因疫苗，在動物模型中展現(xiàn)出高效的基因傳遞能力和免疫激活作用，可顯著抑制腫瘤生長并延長動物生存期。在臨床試驗方面，美國和歐洲的一些研究機構開展了多項針對CEA陽性腫瘤患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗。初步結果顯示，CEA基因疫苗具有良好的安全性和耐受性，部分患者體內檢測到了特異性的免疫反應，腫瘤病灶得到一定程度的控制。然而，目前仍面臨一些挑戰(zhàn)，如免疫逃逸現(xiàn)象導致部分患者對疫苗無應答，以及如何進一步提高疫苗的療效和持久性等問題，仍需深入研究。國內的CEA基因疫苗研究也在積極推進。眾多科研團隊致力于優(yōu)化疫苗構建策略，提高疫苗的質量和安全性。中山大學的研究人員通過對CEA基因進行修飾，構建了新型的CEA基因疫苗，并在動物實驗中驗證了其有效性和安全性，為后續(xù)的臨床研究奠定了基礎。此外，國內在免疫佐劑的研發(fā)和應用方面也取得了一定進展，通過篩選和優(yōu)化免疫佐劑，增強了CEA基因疫苗的免疫效果。在臨床研究方面，國內多家醫(yī)院參與了CEA基因疫苗的臨床試驗，與國外研究機構合作，共同探索CEA基因疫苗在腫瘤治療中的最佳應用方案。1.2.2舌癌治療的研究現(xiàn)狀舌癌作為口腔頜面外科常見的惡性腫瘤，其治療方法的研究一直是口腔醫(yī)學領域的熱點。傳統(tǒng)的治療手段包括手術切除、化療和放療，在臨床應用中取得了一定的療效，但也存在諸多局限性。手術切除是舌癌治療的主要方法之一，早期舌癌患者通過根治性手術切除，可獲得較好的治療效果。然而，對于中晚期舌癌患者，由于腫瘤的廣泛浸潤和轉移，手術往往難以徹底清除腫瘤組織，且術后容易復發(fā)，患者的生存率較低?；熢谏喟┲委熤谐Ｗ鳛檩o助手段，用于術前新輔助化療、術后輔助化療或晚期姑息化療?；熕幬锶珥樸K、5-氟尿嘧啶等，可通過抑制癌細胞的DNA合成和細胞分裂，達到殺傷癌細胞的目的。但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，引發(fā)嚴重的不良反應，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導致患者生活質量下降，且長期化療易使癌細胞產生耐藥性，降低治療效果。放療則利用放射線的電離輻射作用，破壞癌細胞的DNA結構，抑制其生長和分裂。對于無法手術切除的舌癌患者，放療可作為主要治療手段；對于術后殘留或復發(fā)的患者，放療也可起到一定的局部控制作用。然而，放療同樣會對周圍正常組織產生輻射損傷，導致口腔黏膜炎、口干癥、放射性齲齒等并發(fā)癥，影響患者的生活質量和口腔功能恢復。近年來，隨著醫(yī)學技術的不斷進步，一些新興的治療方法逐漸應用于舌癌治療領域。免疫治療通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強機體對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，為舌癌治療帶來了新的希望。免疫檢查點抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，已在多種惡性腫瘤的治療中取得顯著療效，部分研究也顯示其在舌癌治療中具有一定的應用前景。然而，免疫治療在舌癌中的總體有效率仍有待提高，且存在個體差異，如何篩選出對免疫治療敏感的患者，以及如何聯(lián)合其他治療方法提高療效，是當前研究的重點方向。靶向治療則針對腫瘤細胞表面的特定分子靶點，設計相應的靶向藥物，精準地作用于癌細胞，抑制其生長和轉移。例如，針對人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性的舌癌患者，曲妥珠單抗等靶向藥物可取得較好的治療效果。但靶向治療同樣面臨靶點檢測技術不完善、藥物耐藥性等問題，限制了其廣泛應用。1.2.3研究現(xiàn)狀分析綜合國內外人CEA基因疫苗和舌癌治療的研究現(xiàn)狀，目前仍存在以下不足之處：在CEA基因疫苗研究方面，雖然在動物實驗和早期臨床試驗中取得了一定成果，但距離臨床廣泛應用仍有差距。疫苗的免疫原性有待進一步提高，以克服免疫逃逸現(xiàn)象，使更多患者能夠產生有效的免疫應答。同時，疫苗的制備工藝和質量控制標準尚需進一步優(yōu)化和完善，以確保疫苗的安全性和穩(wěn)定性。在舌癌治療領域，傳統(tǒng)治療方法的局限性明顯，新興治療方法雖有一定前景，但尚未能完全取代傳統(tǒng)治療，且各種治療方法之間的聯(lián)合應用策略仍需深入探索，以提高治療效果和患者的生存率。本研究旨在構建人CEA基因疫苗，并探究其在舌癌細胞株中的表達情況，以期為舌癌的基因治療提供新的實驗依據(jù)和理論基礎。通過深入研究CEA基因疫苗對舌癌細胞的作用機制，有望開發(fā)出一種安全、有效的舌癌治療新方法，彌補現(xiàn)有治療手段的不足，提高舌癌患者的生活質量和生存率，具有重要的研究意義和臨床應用價值。1.3研究目的與內容1.3.1研究目的本研究旨在構建人CEA基因疫苗，并深入探究其在舌癌細胞株中的表達情況及作用機制，為舌癌的基因治療提供實驗依據(jù)和理論基礎，具體目的如下：成功構建人CEA基因疫苗：運用分子生物學技術，從人腫瘤組織中提取RNA，通過反轉錄得到cDNA，再利用PCR技術擴增CEA基因的編碼區(qū)域。將擴增后的CEA基因片段克隆至合適的載體中，如pVAX1載體，構建人CEA基因疫苗，并對其進行鑒定，確保疫苗構建的準確性和完整性。明確CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的表達情況：將構建好的CEA基因疫苗轉染至舌癌細胞株中，通過蛋白質印跡法（Westernblot）、免疫熒光染色等技術，檢測CEA蛋白在舌癌細胞中的表達水平，分析其表達特點和規(guī)律。探究CEA基因疫苗對舌癌細胞生物學行為的影響：觀察CEA基因疫苗轉染后，舌癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的變化。采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，明確CEA基因疫苗對舌癌細胞的作用效果。揭示CEA基因疫苗發(fā)揮作用的分子機制：通過基因芯片、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質免疫印跡等技術，檢測與舌癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關的信號通路分子的表達變化，深入探討CEA基因疫苗抑制舌癌細胞生長和轉移的分子機制。1.3.2研究內容為實現(xiàn)上述研究目的，本研究將開展以下內容的研究：人CEA基因的克隆與鑒定：從人腫瘤組織中提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。根據(jù)GenBank中CEA基因的序列信息，設計特異性引物，通過PCR擴增CEA基因的編碼區(qū)域。將擴增得到的CEA基因片段進行測序鑒定，與已知序列進行比對，確?；蛐蛄械臏蚀_性。人CEA基因疫苗的構建與鑒定：選擇合適的真核表達載體，如pVAX1載體，用限制性內切酶對載體和CEA基因片段進行雙酶切，然后利用DNA連接酶將酶切后的CEA基因片段連接到載體上，構建重組人CEA基因疫苗。通過轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保CEA基因準確插入載體中，且無堿基突變。CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的轉染及表達檢測：選擇合適的舌癌細胞株，如Tca8113細胞株，采用脂質體轉染法將構建好的CEA基因疫苗轉染至舌癌細胞中。轉染后，通過Westernblot檢測CEA蛋白在舌癌細胞中的表達水平，免疫熒光染色觀察CEA蛋白在細胞內的定位，明確CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的表達情況。CEA基因疫苗對舌癌細胞生物學行為的影響研究：分別采用CCK-8法、流式細胞術、Transwell實驗檢測CEA基因疫苗轉染后舌癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。設置對照組和實驗組，實驗組轉染CEA基因疫苗，對照組轉染空載體或不進行轉染，對比分析兩組細胞生物學行為的差異，明確CEA基因疫苗對舌癌細胞的作用效果。CEA基因疫苗作用機制的初步探究：運用基因芯片技術篩選CEA基因疫苗轉染前后舌癌細胞中差異表達的基因，對差異表達基因進行生物信息學分析，富集相關信號通路。通過qRT-PCR和Westernblot驗證芯片結果，進一步檢測與差異表達基因相關的信號通路分子的表達變化，初步揭示CEA基因疫苗發(fā)揮作用的分子機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法分子生物學技術：運用反轉錄PCR（RT-PCR）技術從人腫瘤組織中提取總RNA，并反轉錄為cDNA，隨后通過PCR擴增CEA基因的編碼區(qū)域。采用限制性內切酶雙酶切技術，將擴增后的CEA基因片段與真核表達載體（如pVAX1載體）進行酶切處理，再利用DNA連接酶將兩者連接，構建重組人CEA基因疫苗。通過轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保CEA基因準確插入載體且無堿基突變。細胞培養(yǎng)與轉染技術：選擇合適的舌癌細胞株，如Tca8113細胞株，在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用脂質體轉染法將構建好的CEA基因疫苗轉染至舌癌細胞中，設置對照組（轉染空載體或不進行轉染），轉染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，用于后續(xù)實驗檢測。蛋白質檢測技術：采用蛋白質印跡法（Westernblot）檢測CEA蛋白在舌癌細胞中的表達水平。收集轉染后的舌癌細胞，提取總蛋白，進行SDS電泳分離，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，加入CEA特異性一抗孵育過夜，再加入相應的二抗孵育，最后通過化學發(fā)光法顯影，檢測CEA蛋白的表達情況。運用免疫熒光染色技術觀察CEA蛋白在細胞內的定位。將轉染后的舌癌細胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)至合適密度后，用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100通透，5%BSA封閉，加入CEA特異性一抗孵育，再加入熒光標記的二抗孵育，DAPI染核，最后在熒光顯微鏡下觀察CEA蛋白的定位。細胞生物學檢測技術：利用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測CEA基因疫苗轉染后舌癌細胞的增殖能力。將轉染后的舌癌細胞以合適密度接種于96孔板中，分別在培養(yǎng)0、24、48、72h時，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h，用酶標儀檢測450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線。采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。收集轉染后的舌癌細胞，用不含EDTA的胰酶消化，PBS洗滌后，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。通過Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。將轉染后的舌癌細胞懸浮于無血清培養(yǎng)基中，接種于Transwell小室的上室（遷移實驗小室中鋪無基質膠，侵襲實驗小室中鋪Matrigel基質膠），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h后，取出小室，固定、染色，在顯微鏡下計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量，評估細胞遷移和侵襲能力。基因芯片與生物信息學分析技術：運用基因芯片技術篩選CEA基因疫苗轉染前后舌癌細胞中差異表達的基因。提取轉染前后舌癌細胞的總RNA，進行質量檢測和標記后，與基因芯片進行雜交，掃描芯片獲取數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)分析軟件篩選出差異表達基因。對差異表達基因進行生物信息學分析，包括基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，明確差異表達基因參與的生物學過程和相關信號通路。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）驗證芯片結果，進一步檢測與差異表達基因相關的信號通路分子的表達變化。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示：人CEA基因的獲?。簭娜四[瘤組織中提取總RNA，反轉錄為cDNA，利用特異性引物通過PCR擴增CEA基因編碼區(qū)域，對擴增產物進行測序鑒定。人CEA基因疫苗的構建：將測序正確的CEA基因片段與真核表達載體（如pVAX1載體）進行雙酶切，連接構建重組人CEA基因疫苗，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質粒進行酶切鑒定和測序驗證。CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的轉染及表達檢測：培養(yǎng)舌癌細胞株（如Tca8113細胞株），采用脂質體轉染法將構建好的CEA基因疫苗轉染至舌癌細胞中，設置對照組。轉染后通過Westernblot檢測CEA蛋白表達水平，免疫熒光染色觀察CEA蛋白定位。CEA基因疫苗對舌癌細胞生物學行為的影響研究：分別采用CCK-8法、流式細胞術、Transwell實驗檢測CEA基因疫苗轉染后舌癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化，對比實驗組和對照組結果。CEA基因疫苗作用機制的初步探究：運用基因芯片技術篩選CEA基因疫苗轉染前后舌癌細胞中差異表達的基因，對差異表達基因進行生物信息學分析，通過qRT-PCR和Westernblot驗證芯片結果，檢測相關信號通路分子表達變化，揭示CEA基因疫苗發(fā)揮作用的分子機制。[此處插入技術路線圖1-1，技術路線圖以清晰直觀的流程圖形式展示上述研究步驟，各步驟之間用箭頭連接，標注關鍵實驗操作和檢測指標][此處插入技術路線圖1-1，技術路線圖以清晰直觀的流程圖形式展示上述研究步驟，各步驟之間用箭頭連接，標注關鍵實驗操作和檢測指標]二、人CEA基因疫苗構建的理論基礎2.1CEA基因概述癌胚抗原（CarcinoembryonicAntigen，CEA）基因作為腫瘤研究領域的重要靶點，其結構與功能的深入探究對于理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制具有關鍵意義。CEA基因位于人類染色體19q13.2區(qū)域，由多個外顯子和內含子組成。其編碼的CEA蛋白屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種富含多糖的糖蛋白，分子量約為180-200kDa。CEA蛋白的結構包含一個N-末端免疫球蛋白可變樣結構域（Ndomain）以及多個免疫球蛋白恒定樣結構域（A1、B1、A2、B2、A3、B3等），這些結構域通過特定的氨基酸序列和空間構象相互作用，賦予CEA蛋白獨特的生物學功能。在正常生理狀態(tài)下，CEA基因主要在胚胎發(fā)育時期的胃腸道、肝臟和胰腺等組織中表達，出生后其表達水平顯著降低，在健康成年人的血清中含量極低。然而，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，CEA基因的表達調控機制出現(xiàn)異常，導致CEA蛋白在腫瘤細胞表面大量表達。研究表明，CEA在結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌以及舌癌等多種癌癥組織中的表達水平明顯升高，且其表達量與腫瘤的分期、轉移和預后密切相關。CEA在腫瘤細胞中的高表達使其成為腫瘤診斷和治療的重要標志物。在腫瘤診斷方面，血清CEA水平的檢測已廣泛應用于臨床實踐。當血清CEA水平超過正常參考范圍時，提示患者可能存在腫瘤風險，尤其是對于結直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤，CEA檢測具有較高的敏感性和特異性。通過定期監(jiān)測血清CEA水平的動態(tài)變化，還可以評估腫瘤的治療效果和復發(fā)情況。若腫瘤患者在接受手術、化療或放療等治療后，血清CEA水平明顯下降，表明治療有效；反之，若CEA水平持續(xù)升高或不降反升，則可能提示腫瘤復發(fā)、轉移或對治療產生耐藥性。在腫瘤治療監(jiān)測中，CEA同樣發(fā)揮著重要作用。一方面，CEA可以作為腫瘤靶向治療的靶點?；贑EA的特異性單克隆抗體藥物，如西妥昔單抗等，能夠與腫瘤細胞表面的CEA蛋白結合，阻斷其信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖。另一方面，以CEA基因為基礎構建的基因疫苗，可通過激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，誘導產生針對CEA陽性腫瘤細胞的特異性免疫應答，實現(xiàn)對腫瘤的免疫治療。這種基于CEA的免疫治療方法具有特異性強、副作用小等優(yōu)點，為腫瘤治療開辟了新的途徑。2.2基因疫苗原理與優(yōu)勢基因疫苗，又被稱為核酸疫苗，是一種創(chuàng)新性的疫苗類型，其核心原理是將編碼特定抗原的基因片段整合至含有真核表達系統(tǒng)的質粒載體上。通過直接將該重組質粒導入人或動物體內，借助宿主細胞內的基因表達機制，使外源基因在細胞內得以表達，合成相應的抗原蛋白。這些抗原蛋白能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，誘導產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答，從而實現(xiàn)對特定病原體或腫瘤細胞的免疫預防和治療作用。從作用機制來看，基因疫苗進入機體后，首先被宿主細胞攝取。在細胞內，質粒上的抗原基因在啟動子、增強子等調控元件的作用下，轉錄生成mRNA，隨后mRNA在核糖體上翻譯合成抗原蛋白。這些抗原蛋白一部分以可溶性蛋白的形式分泌到細胞外，激活B淋巴細胞，使其分化為漿細胞，分泌特異性抗體，引發(fā)體液免疫應答；另一部分抗原蛋白則被細胞內的蛋白酶體降解為短肽片段，這些短肽與細胞內的主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子結合，形成抗原肽-MHCⅠ類分子復合物，轉運至細胞表面，被CD8?T淋巴細胞識別，激活細胞毒性T淋巴細胞（CTL），引發(fā)細胞免疫應答。此外，基因疫苗還可通過激活樹突狀細胞等抗原呈遞細胞，增強抗原的呈遞效率，進一步促進免疫應答的產生。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗具有諸多顯著優(yōu)勢。在制備工藝方面，傳統(tǒng)疫苗的制備往往依賴于病原體的培養(yǎng)、滅活或減毒等復雜過程，生產周期長，成本高，且存在病原體泄漏、毒力回復等安全風險。而基因疫苗只需獲取病原體的特定抗原基因，通過基因工程技術將其克隆至表達載體中，即可在大腸桿菌等工程菌內快速增殖，提取純化過程相對簡便，可大幅縮短生產周期，降低生產成本。例如，在流感疫苗的制備中，傳統(tǒng)方法需要培養(yǎng)大量的流感病毒，經(jīng)過滅活或減毒處理后制成疫苗，整個過程耗時較長；而基因疫苗只需克隆流感病毒的關鍵抗原基因，構建重組質粒，即可快速生產，大大提高了疫苗的制備效率。在免疫效果上，傳統(tǒng)疫苗主要激發(fā)機體的體液免疫應答，對細胞免疫的激活作用相對較弱。而基因疫苗能夠同時誘導機體產生體液免疫和細胞免疫應答，尤其是細胞免疫在清除被病原體感染的細胞以及腫瘤細胞方面具有重要作用。例如，對于一些病毒感染性疾病，如艾滋病、乙肝等，基因疫苗誘導的細胞免疫可以有效殺傷被病毒感染的細胞，阻止病毒的復制和傳播。此外，基因疫苗接種后，抗原基因在體內能夠持續(xù)表達一段時間，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)，可產生更持久的免疫記憶，增強免疫效果。從安全性角度考量，傳統(tǒng)疫苗中的滅活疫苗可能存在滅活不完全的風險，減毒活疫苗則有一定概率發(fā)生毒力回復，導致接種者感染疾病?；蛞呙绮缓谢畹牟≡w，不存在毒力回復和感染的風險，且其抗原是在體內細胞內合成，以天然構象被免疫系統(tǒng)識別，減少了因抗原加工處理不當而引發(fā)的免疫副反應，安全性更高。例如，脊髓灰質炎減毒活疫苗在極少數(shù)情況下會發(fā)生毒力回復，導致接種者患上脊髓灰質炎；而基因疫苗在這方面則具有明顯的安全優(yōu)勢。基因疫苗還具有高度的靈活性和可設計性。通過基因工程技術，可以方便地對疫苗的抗原基因進行修飾、改造，或構建多價疫苗，以應對病原體的變異和多種病原體的混合感染。例如，針對新冠病毒的不斷變異，科研人員可以快速對基因疫苗的抗原基因進行優(yōu)化，使其能夠有效識別變異株，提高疫苗的保護效果。同時，基因疫苗可以同種異株交叉保護，選擇某一種病原體的編碼保守蛋白的核酸序列作為基因疫苗，因其不會變異，故可對同一種病原體的變異型或新型產生交叉免疫，從而起到免疫保護作用。2.3人CEA基因疫苗構建的關鍵技術在人CEA基因疫苗的構建過程中，涉及到多種關鍵技術，其中反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術和基因重組技術發(fā)揮著核心作用。RT-PCR技術是實現(xiàn)從RNA到DNA的關鍵轉換，并擴增特定基因片段的重要手段。其原理基于兩個緊密相連的過程：逆轉錄和聚合酶鏈式反應。在逆轉錄階段，以RNA為模板，在逆轉錄酶的催化作用下，根據(jù)堿基互補配對原則，合成與之互補的單鏈cDNA。逆轉錄酶具有以RNA為模板合成DNA的特殊能力，能夠將細胞內的總RNA或mRNA逆轉錄為cDNA，為后續(xù)的基因擴增提供模板。隨后進入聚合酶鏈式反應階段，以逆轉錄得到的cDNA為模板，在DNA聚合酶、特異性引物、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）以及Mg2?等物質的參與下，通過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟的循環(huán)往復，實現(xiàn)對目的基因的指數(shù)級擴增。高溫變性時，將反應體系加熱至95℃左右，使雙鏈DNA解旋成為單鏈，為引物結合提供模板；低溫退火階段，將溫度降至引物的退火溫度（一般為Tm-5℃，Tm為引物的解鏈溫度），引物與單鏈模板特異性結合；適溫延伸時，將溫度調整至DNA聚合酶的最適反應溫度（通常為72℃左右），DNA聚合酶從引物的3′-OH端開始，按照堿基互補配對原則，以dNTPs為原料，沿著5′-3′方向合成互補鏈，完成一輪擴增。經(jīng)過25-30次循環(huán)后，模板DNA的含量可擴大100萬倍以上。在人CEA基因克隆中，RT-PCR技術發(fā)揮著不可或缺的作用。從人腫瘤組織中提取總RNA后，利用RT-PCR技術可以快速、高效地獲取CEA基因的編碼區(qū)域。通過設計特異性引物，這些引物與CEA基因的兩端序列互補，能夠在PCR反應中精準地引導DNA聚合酶擴增出CEA基因片段。引物設計的質量直接影響到擴增的特異性和效率，需要遵循一系列原則，如引物應在高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源性；引物長度以15-40bp為宜；堿基盡可能隨機分布，G+C占40-60%；引物內部避免形成二級結構；兩引物間避免有互補序列；3′端為關鍵堿基，5′端無嚴格限制等。通過優(yōu)化引物設計和PCR反應條件，可以確保擴增得到的CEA基因片段準確無誤，為后續(xù)的基因疫苗構建奠定堅實基礎。基因重組技術則是將擴增得到的CEA基因片段與合適的載體進行連接，構建重組人CEA基因疫苗的關鍵環(huán)節(jié)。其基本操作流程包括：首先選擇合適的真核表達載體，如pVAX1載體，該載體具有在真核細胞中高效表達外源基因的能力，并且含有多個限制性內切酶酶切位點，便于基因片段的插入。用特定的限制性內切酶對載體和CEA基因片段進行雙酶切處理，限制性內切酶能夠識別并切割特定的DNA序列，在載體和基因片段兩端產生互補的粘性末端或平末端。然后利用DNA連接酶將酶切后的CEA基因片段與載體進行連接，DNA連接酶能夠催化相鄰的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而將CEA基因準確地插入到載體中，構建成重組人CEA基因疫苗。將重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，感受態(tài)細胞具有攝取外源DNA的能力，在一定條件下，重組質粒能夠進入大腸桿菌細胞內。通過在含有相應抗生素的培養(yǎng)基上篩選，只有成功導入重組質粒的大腸桿菌才能生長繁殖，形成陽性克隆。對陽性克隆進行進一步的鑒定，如提取重組質粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保CEA基因準確插入載體中，且無堿基突變?；蛑亟M技術在人CEA基因疫苗構建中具有至關重要的作用。它不僅實現(xiàn)了CEA基因與表達載體的有效整合，使得CEA基因能夠在載體的調控下在宿主細胞中穩(wěn)定表達，而且通過對載體的選擇和改造，可以優(yōu)化CEA基因的表達水平和免疫原性。例如，在載體中添加合適的啟動子、增強子等調控元件，能夠增強CEA基因的轉錄和翻譯效率，提高疫苗的免疫效果。此外，基因重組技術還為疫苗的大規(guī)模生產提供了可能，通過在大腸桿菌等工程菌中大量培養(yǎng)重組質粒，可快速獲取大量的人CEA基因疫苗，滿足臨床研究和治療的需求。三、人CEA基因疫苗的構建過程3.1實驗材料準備細胞株：選用人舌癌細胞株Tca8113，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞株具有穩(wěn)定的生物學特性，能夠較好地模擬舌癌的發(fā)病機制和生物學行為，為后續(xù)研究CEA基因疫苗在舌癌細胞中的表達及作用機制提供理想的細胞模型。菌株：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌DH5α是基因工程中常用的宿主菌株，其具有生長迅速、易于轉化、遺傳背景清晰等優(yōu)點，能夠高效攝取外源DNA，并在合適的培養(yǎng)條件下大量繁殖，便于重組質粒的擴增和提取。載體：真核表達載體pVAX1，購自Invitrogen公司。pVAX1載體含有CMV啟動子，能夠在真核細胞中高效啟動外源基因的轉錄；具有氨芐青霉素抗性基因，便于在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆；同時具備多個限制性內切酶酶切位點，方便目的基因的插入，是構建人CEA基因疫苗的理想載體。工具酶：限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，購自NEB公司；T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司。限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ能夠識別并切割特定的DNA序列，在載體和CEA基因片段兩端產生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應；T4DNA連接酶則能夠催化相鄰的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)CEA基因片段與載體的有效連接。試劑：RNA提取試劑盒（TRIzol試劑），購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒，購自Promega公司；PCR擴增試劑盒，購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒，購自OMEGA公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；胰蛋白酶，購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑如***、異丙醇、75%乙醇、DEPC水等，均為國產分析純試劑。RNA提取試劑盒用于從人腫瘤組織中提取總RNA，反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增試劑盒用于擴增CEA基因片段，質粒提取試劑盒用于從大腸桿菌中提取重組質粒，DNA凝膠回收試劑盒用于回收酶切后的DNA片段，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶用于細胞培養(yǎng)，其他常規(guī)試劑用于實驗中的各種溶液配制和樣品處理。儀器設備：PCR擴增儀，型號為ABI2720，購自ThermoFisherScientific公司；高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424，購自Eppendorf公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，型號為HZQ-C，購自哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；超凈工作臺，型號為SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，型號為Bio-RadGelDocXR+，購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡，型號為OlympusIX73，購自Olympus公司；酶標儀，型號為ThermoMultiskanFC，購自ThermoFisherScientific公司；流式細胞儀，型號為BDFACSCalibur，購自BD公司；CO?細胞培養(yǎng)箱，型號為ThermoForma3111，購自ThermoFisherScientific公司。PCR擴增儀用于基因擴增反應，高速冷凍離心機用于細胞和DNA樣品的離心分離，恒溫振蕩培養(yǎng)箱用于細菌和細胞的培養(yǎng)，超凈工作臺用于提供無菌操作環(huán)境，凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析DNA凝膠電泳結果，熒光顯微鏡用于觀察細胞內的熒光標記情況，酶標儀用于檢測細胞增殖實驗中的吸光度值，流式細胞儀用于檢測細胞凋亡率，CO?細胞培養(yǎng)箱用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度。3.2CEA基因的獲取從腫瘤細胞中成功獲取CEA基因是構建人CEA基因疫苗的關鍵起始步驟，這一過程主要涉及從腫瘤細胞提取RNA、反轉錄成cDNA及PCR擴增CEA基因，每一步都對實驗結果的準確性和后續(xù)疫苗構建的成功與否起著決定性作用。腫瘤細胞RNA的提?。罕狙芯窟x用液氮冷凍保存的人腫瘤組織，從中提取總RNA。將約50-100mg的腫瘤組織迅速轉移至預冷的研缽中，加入適量液氮，快速研磨組織，使其呈粉末狀。在研磨過程中，不斷補充液氮，以保持低溫環(huán)境，防止RNA降解。研磨完成后，立即加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。隨后，向裂解液中加入0.2ml***，劇烈振蕩15s，室溫放置3min，使溶液充分乳化。4℃、12000g離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色水相，含有RNA；中間為白色蛋白層；下層為紅色有機相。小心吸取上層水相，轉移至新的離心管中，避免吸取到中間蛋白層和下層有機相，以免污染RNA。向上清液中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10min，可見管底出現(xiàn)白色膠狀RNA沉淀。小心棄去上清，沿離心管壁緩慢加入1ml75%乙醇（用DEPC-Water配制），輕輕顛倒離心管，洗滌沉淀，4℃、12000g離心5min，棄去乙醇。重復洗滌一次，盡量去除殘留的鹽離子和雜質。室溫干燥沉淀2-5min，注意不要干燥過度，以免RNA難以溶解。加入適量的Rnase-free水，用移液槍輕輕吹打沉淀，使其完全溶解，得到總RNA溶液。將提取的RNA立即進行反轉錄，或保存于-80℃冰箱備用。在整個RNA提取過程中，要嚴格遵守操作規(guī)程，戴一次性手套，使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。提取RNA所用的器具，如玻璃器皿需在180℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，然后用水清洗，再滅菌，以去除RNase。配制溶液應使用經(jīng)DEPC處理的無RNase水，DEPC有致癌之嫌，操作時需格外小心。RNA反轉錄成cDNA：使用Promega公司的反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄為cDNA。在冰上配置反轉錄反應體系，首先在無RNase的Microtube管中加入5ul總RNA、1ulOligoDtPrimer（2.5uM）、1uldNTPMixture（10mMeach），用Rnase-FreedH?O補足至10ul，輕輕混勻。將反應管置于PCR儀中，進行變性、退火反應，條件為65℃5min，4℃。此步驟可使模板RNA變性，促進反轉錄引物與模板的特異性退火，提高反轉錄反應效率。反應結束后，短暫離心，使溶液聚集于管底。然后在上述反應管中加入10ul變性、退火后的反應液，再依次加入4ul5×PrimeScriptTMBuffer、0.5ulRnaseInhibitor（40U/ul）、1ulPrimeScriptTMRtase（for2Step）、4.5ulRnase-FreeDh?O，總體積為20ul。將反應管再次置于PCR儀中，按42-50℃15-30min，95℃5min，4℃的條件進行反轉錄反應。反應結束后，得到的cDNA可立即用于后續(xù)的PCR擴增，或保存于-20℃冰箱備用。反轉錄反應過程中，需建立無RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。同時，要嚴格控制反應溫度和時間，確保反轉錄反應的順利進行。PCR擴增CEA基因：根據(jù)GenBank中CEA基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，引物序列如下：上游引物5'-CCCGAATTCATGGGGAAGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-CCGCTCGAGTCAGGCAGGGCGTGGGG-3'。上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點（下劃線部分），下游引物中引入XhoⅠ酶切位點（下劃線部分），以便后續(xù)的基因克隆和載體構建。引物設計遵循一系列原則，如引物應在高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源性；引物長度以15-40bp為宜；堿基盡可能隨機分布，G+C占40-60%；引物內部避免形成二級結構；兩引物間避免有互補序列；3'端為關鍵堿基，5'端無嚴格限制等。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。在0.2ml薄壁PCR管中配置PCR反應體系，依次加入13.2ulddH?O、2ul10×PCRBuffer（含Mg2?）、1.6uldNTPMixture（2.5mMeach）、1ul上游引物（10uM）、1ul下游引物（10uM）、1ul模板cDNA、0.2ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），總體積為20ul。將PCR管放入PCR儀中，按以下程序進行擴增：94℃預變性3min，使DNA雙鏈充分解離；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，使DNA雙鏈解旋；58℃退火30s，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；72℃延伸1min，DNA聚合酶從引物的3'端開始，以dNTP為原料，沿模板5'-3'方向合成互補鏈；循環(huán)結束后，72℃終延伸10min，使PCR反應完全，提高擴增產量。反應結束后，取5ulPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。若在約2.1kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的CEA基因片段大小相符，則表明PCR擴增成功。在PCR擴增過程中，要注意引物的質量和濃度，引物濃度過高可能導致非特異性擴增，過低則會影響擴增效率。同時，要嚴格控制反應條件，如溫度、時間和循環(huán)次數(shù)等，以確保擴增結果的特異性和穩(wěn)定性。此外，為避免污染，應設置陰性對照（無模板對照），以檢測反應體系是否受到污染。3.3基因與載體的連接在成功獲取CEA基因后，將其與合適的載體進行連接是構建人CEA基因疫苗的關鍵步驟，這一步驟決定了CEA基因能否在宿主細胞中穩(wěn)定表達，進而影響疫苗的免疫效果。選擇合適的載體對于基因疫苗的構建至關重要。本研究選用Invitrogen公司的真核表達載體pVAX1，該載體具有諸多優(yōu)勢，使其成為構建人CEA基因疫苗的理想選擇。pVAX1載體含有強大的CMV啟動子，這一啟動子在真核細胞中具有高效啟動外源基因轉錄的能力，能夠確保CEA基因在細胞內實現(xiàn)高水平表達。例如，多項研究表明，在多種真核細胞系中，CMV啟動子驅動下的外源基因表達量顯著高于其他常見啟動子，為基因疫苗發(fā)揮免疫作用提供了充足的抗原來源。pVAX1載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，這一特性為后續(xù)的篩選工作提供了極大便利。在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，只有成功導入pVAX1載體或重組質粒的大腸桿菌能夠生長繁殖，而未導入載體的細菌則無法存活，從而能夠快速、準確地篩選出陽性克隆。此外，pVAX1載體具備多個限制性內切酶酶切位點，這些位點分布合理，便于目的基因的插入，能夠滿足不同基因克隆的需求。在進行基因與載體的連接之前，需要對CEA基因片段和pVAX1載體進行酶切處理，以產生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應。根據(jù)前期設計，選用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對兩者進行雙酶切。在0.5ml離心管中，按照如下體系進行酶切反應：取10ulCEA基因PCR產物（約0.5-1ugDNA）或pVAX1載體（1ug），加入10×Buffer（含Mg2?）2ul，EcoRⅠ和XhoⅠ各1ul（10U/ul），用ddH?O補足至20ul。輕輕混勻后，短暫離心，使溶液聚集于管底。將離心管置于37℃恒溫金屬浴中，反應2-3h，使酶切反應充分進行。酶切結束后，取5ul酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。若在凝膠上出現(xiàn)預期大小的條帶，即CEA基因片段約2.1kb，pVAX1載體線性化后約3.6kb，則表明酶切成功。在酶切過程中，要注意酶的活性和用量，酶活性過低或用量不足可能導致酶切不完全，影響后續(xù)連接反應；而酶用量過多則可能造成非特異性酶切，破壞目的基因和載體的完整性。同時，要嚴格控制反應溫度和時間，確保酶切反應在最適條件下進行。酶切后的CEA基因片段和pVAX1載體需要通過連接反應形成重組質粒。使用T4DNA連接酶進行連接，在0.5ml離心管中配置連接反應體系：取酶切后的CEA基因片段5ul（約50-100ngDNA），酶切后的pVAX1載體1ul（約50ng），10×T4DNALigaseBuffer1ul，T4DNALigase1ul（3-5U/ul），用ddH?O補足至10ul。輕輕混勻后，短暫離心，將離心管置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜（12-16h）。連接反應完成后，取5ul連接產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)重組質粒條帶。由于重組質粒大小為CEA基因片段與pVAX1載體之和，約5.7kb，若在凝膠上相應位置出現(xiàn)條帶，則初步表明連接成功。連接反應的關鍵在于連接酶的活性和反應條件的優(yōu)化。連接酶活性受到溫度、pH值等因素的影響，16℃是T4DNA連接酶的最適反應溫度，在此溫度下，連接酶能夠高效地催化相鄰DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。此外，反應體系中DNA片段的濃度和比例也會對連接效果產生影響，適當調整CEA基因片段和pVAX1載體的比例，可提高重組質粒的連接效率。3.4重組質粒的轉化與篩選將連接反應得到的重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，是實現(xiàn)重組質粒擴增和后續(xù)鑒定的關鍵步驟。本研究采用熱激法進行轉化，該方法基于大腸桿菌在特定條件下細胞膜通透性改變，從而能夠攝取外源DNA的原理。具體操作如下：從-80℃冰箱中取出保存的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，迅速置于冰上緩慢解凍。取100μl感受態(tài)細胞懸液，加入5μl連接產物（即重組質粒），輕輕混勻，避免產生氣泡，冰上靜置30min，使重組質粒與感受態(tài)細胞充分接觸。將離心管迅速放入42℃水浴中熱激45s，這一短暫的高溫處理可使細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，出現(xiàn)許多間隙，從而增加細胞膜的通透性，有利于重組質粒進入細胞。熱激結束后，立即將離心管轉移至冰上，放置2-3min，使細胞膜結構恢復穩(wěn)定。向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使轉化后的大腸桿菌能夠恢復生長，并表達質粒上的抗性基因。為篩選出含有目的基因重組質粒的大腸桿菌，采用在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選的策略。氨芐青霉素是一種β-內酰胺類抗生素，能夠抑制細菌細胞壁的合成，從而殺死未攜帶氨芐青霉素抗性基因的細菌。而本研究中使用的pVAX1載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，成功導入重組質粒的大腸桿菌由于獲得了該抗性基因，能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，形成陽性克隆。將培養(yǎng)后的菌液以適當比例均勻涂布于含有氨芐青霉素（終濃度為100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，使用無菌玻璃涂布棒將菌液均勻分散，確保細菌在平板上呈單個菌落生長。將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h。倒置平板可防止培養(yǎng)過程中產生的冷凝水滴滴落在培養(yǎng)基表面，導致菌落蔓延，影響篩選結果。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，在平板上會出現(xiàn)大小、形態(tài)各異的菌落。其中，白色菌落通常表示含有重組質粒，而藍色菌落則可能是未成功連接目的基因的空載體轉化的細菌。這是因為pVAX1載體上含有LacZ基因，當外源基因插入到LacZ基因中時，會導致LacZ基因失活，無法編碼β-半乳糖苷酶。在含有X-Gal和IPTG的培養(yǎng)基中，β-半乳糖苷酶能夠將X-Gal分解為藍色產物，使含有空載體的細菌菌落呈現(xiàn)藍色；而含有重組質粒的細菌由于LacZ基因失活，無法分解X-Gal，菌落則為白色。通過這種藍白斑篩選方法，可以初步篩選出含有重組質粒的陽性克隆。3.5重組質粒的鑒定為了確保成功構建人CEA基因疫苗，需要對重組質粒進行全面且嚴格的鑒定，本研究主要采用PCR擴增、酶切電泳分析和DNA測序等方法，以準確驗證重組質粒的結構和序列的正確性。以提取的重組質粒為模板，利用之前設計的特異性引物進行PCR擴增，以此驗證重組質粒中是否含有目的CEA基因片段。PCR反應體系和擴增程序與獲取CEA基因時一致。擴增結束后，取5ulPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，在凝膠成像系統(tǒng)下，于約2.1kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的CEA基因片段大小相符，這初步表明重組質粒中含有正確的CEA基因片段。在PCR擴增過程中，為確保結果的準確性和可靠性，設置了陰性對照（無模板對照），陰性對照在凝膠上未出現(xiàn)任何條帶，排除了反應體系被污染的可能性。酶切電泳分析是鑒定重組質粒的重要手段之一，它能夠直觀地展示重組質粒的酶切片段大小，進一步驗證CEA基因是否成功插入載體。用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對提取的重組質粒進行雙酶切處理。酶切反應體系和條件與基因與載體連接時的酶切反應一致。酶切結束后，取5ul酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，在凝膠上出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條約為2.1kb，與CEA基因片段大小相符；另一條約為3.6kb，與線性化的pVAX1載體大小一致。這一結果有力地證明了CEA基因已成功插入pVAX1載體中，重組質粒構建正確。在酶切電泳分析過程中，同時設置了未酶切的重組質粒作為對照，未酶切的重組質粒在凝膠上呈現(xiàn)出超螺旋、開環(huán)和線性三種形式的條帶，與預期結果相符，進一步驗證了實驗結果的可靠性。為了最終確定重組質粒中CEA基因的序列準確性，對酶切鑒定正確的重組質粒進行DNA測序。將重組質粒送至專業(yè)的測序公司進行測序，測序結果與GenBank中CEA基因的標準序列進行比對分析。比對結果顯示，重組質粒中CEA基因的序列與標準序列完全一致，無堿基突變和缺失，這充分證實了重組質粒構建的準確性和可靠性。通過DNA測序，不僅驗證了CEA基因的序列正確性，還確保了基因與載體連接的準確性，為后續(xù)的實驗研究提供了堅實的基礎。綜上所述，通過PCR擴增、酶切電泳分析和DNA測序等多種方法的綜合鑒定，結果均表明成功構建了人CEA基因疫苗，重組質粒中含有正確的CEA基因序列，且基因與載體連接準確無誤。這些鑒定結果為后續(xù)研究CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的表達及作用機制奠定了堅實的基礎。四、舌癌細胞株的選擇與培養(yǎng)4.1舌癌細胞株的特點與選擇依據(jù)在舌癌研究領域，多種舌癌細胞株被廣泛應用，它們各自具備獨特的生物學特性。其中，Tca8113細胞株作為國內建立的經(jīng)典舌癌細胞株，來源于人舌鱗狀細胞癌組織。該細胞株呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，貼壁生長，具有較強的增殖能力。研究表明，Tca8113細胞在體外培養(yǎng)條件下，能夠快速增殖，其細胞周期較短，S期細胞比例較高，這使得它在細胞增殖相關研究中具有重要價值。在腫瘤侵襲轉移能力方面，Tca8113細胞具有一定的侵襲特性，能夠分泌多種基質金屬蛋白酶，如MMP-2和MMP-9，這些酶能夠降解細胞外基質，促進細胞的遷移和侵襲。Tca8113細胞在裸鼠體內具有成瘤性，接種后可形成明顯的腫瘤結節(jié)，為研究舌癌的體內生長和轉移提供了良好的動物模型。SCC-9細胞株同樣是常用的舌癌細胞株，源自人類鱗狀上皮舌癌組織。其細胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長。SCC-9細胞在增殖特性上與Tca8113細胞有所不同，其增殖速度相對較慢，但細胞生長較為穩(wěn)定。在細胞周期分布中，G0/G1期細胞比例相對較高，這可能與該細胞株的分化程度和生長調控機制有關。在侵襲轉移能力方面，SCC-9細胞也表現(xiàn)出一定的侵襲性，但其侵襲能力相對Tca8113細胞較弱。研究發(fā)現(xiàn)，SCC-9細胞表面的整合素表達水平較低，這可能影響了其與細胞外基質的粘附和遷移能力。在裸鼠成瘤實驗中，SCC-9細胞同樣能夠形成腫瘤，但腫瘤生長速度相對較慢，腫瘤體積相對較小。本研究選擇Tca8113細胞株作為研究對象，主要基于以下多方面考慮。從細胞的生物學特性來看，Tca8113細胞的高增殖能力使其能夠在較短時間內獲得大量細胞，滿足后續(xù)實驗對細胞數(shù)量的需求。例如，在進行基因轉染實驗時，需要足夠數(shù)量的細胞來確保轉染效率和實驗結果的可靠性。Tca8113細胞較強的侵襲能力與舌癌的臨床特點相符，舌癌具有較高的侵襲和轉移傾向，選擇該細胞株能夠更好地模擬舌癌的生物學行為，為研究CEA基因疫苗對舌癌細胞侵襲轉移的影響提供理想的細胞模型。在實驗研究的便利性和可重復性方面，Tca8113細胞株在國內外研究中被廣泛應用，其培養(yǎng)條件和實驗操作方法已經(jīng)相對成熟，相關研究資料豐富。這使得研究者能夠快速掌握該細胞株的培養(yǎng)和實驗技術，減少實驗誤差，提高實驗的可重復性。例如，在細胞培養(yǎng)過程中，Tca8113細胞對培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)環(huán)境的要求相對明確，研究者可以根據(jù)已有的研究經(jīng)驗，優(yōu)化培養(yǎng)條件，確保細胞的良好生長狀態(tài)。綜上所述，Tca8113細胞株以其獨特的生物學特性和實驗研究的便利性，成為本研究探究人CEA基因疫苗在舌癌細胞株中表達及作用機制的理想選擇。4.2舌癌細胞株的培養(yǎng)條件與方法本研究選用的Tca8113舌癌細胞株，其培養(yǎng)條件及操作方法對細胞的生長狀態(tài)和實驗結果有著關鍵影響。在培養(yǎng)條件方面，細胞培養(yǎng)基是維持細胞生長和代謝的關鍵物質。本研究采用RPMI1640培養(yǎng)基，這是一種廣泛應用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，其成分包含多種氨基酸、維生素、糖類、無機鹽等，能夠為Tca8113細胞提供全面的營養(yǎng)支持，滿足細胞生長和增殖的需求。為增強培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，促進細胞生長，添加10%的胎牛血清。胎牛血清中富含多種生長因子、激素和營養(yǎng)物質，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子等，這些成分能夠刺激細胞的增殖和分化，提高細胞的存活率和生長速度。同時，為防止細胞培養(yǎng)過程中的微生物污染，在培養(yǎng)基中添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液。青霉素能夠抑制細菌細胞壁的合成，鏈霉素則能抑制細菌蛋白質的合成，兩者聯(lián)合使用，可有效防止細菌和支原體等微生物的污染，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。將Tca8113舌癌細胞株置于37℃的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，這是因為37℃接近人體體溫，是人體細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內的各種酶能夠保持最佳的活性狀態(tài)，參與細胞的代謝、增殖等生理過程，從而維持細胞的正常生長和功能。培養(yǎng)環(huán)境中的CO?濃度維持在5%，這是因為CO?在細胞培養(yǎng)中起著重要的作用。CO?能夠溶解于培養(yǎng)基中，與水反應生成碳酸，進而與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽形成緩沖對，維持培養(yǎng)基的pH值在7.2-7.4之間。適宜的pH值對于細胞的正常生理功能至關重要，過高或過低的pH值都會影響細胞內酶的活性、細胞膜的穩(wěn)定性以及細胞的代謝過程，導致細胞生長受阻甚至死亡。細胞培養(yǎng)箱內的濕度需保持在95%左右，這是為了防止培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)，維持培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定。如果濕度不足，培養(yǎng)基中的水分會逐漸蒸發(fā)，導致培養(yǎng)基濃度升高，滲透壓改變，對細胞造成損傷；而濕度過高，則可能增加微生物污染的風險。在細胞復蘇操作中，從液氮罐中取出凍存的Tca8113細胞株凍存管時，需佩戴防護手套，防止液氮凍傷。迅速將凍存管放入37℃恒溫水浴鍋中，輕輕搖晃，使管內的細胞懸液快速解凍。這一過程要求在1-2分鐘內完成，因為快速解凍能夠減少冰晶對細胞的損傷，提高細胞的復蘇存活率。將解凍后的細胞懸液轉移至含有適量預熱RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，輕輕吹打混勻。在1000rpm的轉速下離心5分鐘，使細胞沉淀于離心管底部。離心過程能夠去除凍存液中的DMSO等對細胞有毒性的物質，避免其對復蘇后細胞生長的影響。棄去上清液，加入適量新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸細胞，將細胞懸液轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前24小時內，盡量避免頻繁移動培養(yǎng)瓶，以免影響細胞的貼壁和生長。當Tca8113細胞在培養(yǎng)瓶中生長至80%-90%匯合度時，需要進行傳代操作，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。具體步驟如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產物。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，通常T25培養(yǎng)瓶加入1-2mL，T75培養(yǎng)瓶加入2-3mL。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細胞的消化情況。當觀察到細胞大部分變圓并開始脫離瓶壁時，迅速將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，輕敲培養(yǎng)瓶壁，使細胞完全脫落。立即加入3-4mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，以終止胰蛋白酶的消化作用。胎牛血清中的蛋白質能夠與胰蛋白酶結合，使其失活，防止過度消化對細胞造成損傷。用吸管輕輕吹打細胞懸液，使細胞充分分散，避免細胞成團。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000rpm的轉速下離心5分鐘，使細胞沉淀。棄去上清液，根據(jù)實驗需求，加入適量新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基，重懸細胞。將細胞懸液按1:2-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，添加適量的培養(yǎng)基，使細胞在新的培養(yǎng)瓶中能夠繼續(xù)生長和增殖。傳代后的細胞需置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期觀察細胞的生長狀態(tài)，根據(jù)細胞的生長情況及時更換培養(yǎng)基。為保存細胞資源，需要對Tca8113細胞進行凍存操作。首先，取對數(shù)生長期的細胞，按照上述傳代方法收集消化好的細胞至離心管中?？墒褂醚蛴嫈?shù)板計數(shù)，以確定細胞的凍存密度，一般推薦的凍存密度為1×10?-1×10?個活細胞/mL。在1000rpm的轉速下離心3-5分鐘，去掉上清液。用提前配制好的細胞凍存液重懸細胞，凍存液通常由90%的胎牛血清和10%的DMSO組成。DMSO能夠降低細胞內溶液的冰點，減少冰晶的形成，從而保護細胞在凍存過程中免受損傷。將重懸后的細胞按每1mL凍存液含1×10?-1×10?個活細胞/mL的密度分配到凍存管中，標注好細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等信息。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，使細胞緩慢降溫。緩慢降溫能夠減少細胞內冰晶的形成，降低對細胞的損傷。第二天將凍存管轉入液氮容器中儲存，液氮的溫度極低（-196℃），能夠長期保存細胞的活性。同時，記錄好凍存管在液氮容器中的位置，以便后續(xù)查閱和使用。4.3細胞生長狀態(tài)的監(jiān)測與評估在舌癌細胞株的培養(yǎng)過程中，對細胞生長狀態(tài)進行準確的監(jiān)測與評估至關重要，這不僅能夠及時了解細胞的生長情況，還能為后續(xù)實驗提供可靠的細胞材料，確保實驗結果的準確性和可靠性。本研究采用多種方法對Tca8113舌癌細胞株的生長狀態(tài)進行全面監(jiān)測與評估。細胞計數(shù)是評估細胞生長狀態(tài)的基礎方法之一，它能夠直觀地反映細胞數(shù)量的變化。本研究使用血球計數(shù)板和顯微鏡進行細胞計數(shù)。在操作時，先取清潔的血球計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干。將細胞懸液與適量的結晶紫或臺盼藍染液混合，臺盼藍染色法可區(qū)分活細胞和死細胞，一般0.5%-1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，而活細胞不著色?；靹蚝螅“氲位旌弦旱斡谘蛴嫈?shù)板內，確保液體充滿計數(shù)室且不外溢，也無氣泡。在顯微鏡下，使用10×物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)。通過公式“細胞數(shù)/ml=(4大格細胞數(shù)之和/4)×10?×稀釋倍數(shù)”計算出細胞密度。同時，通過臺盼藍染色，可計算細胞存活百分率，公式為“細胞存活百分率=（4大格活細胞數(shù)/4大格活細胞+死細胞數(shù)）×100%”。在進行細胞計數(shù)時，需確保細胞懸液分散良好且充分混勻，若出現(xiàn)較多細胞團或細胞數(shù)不在合適范圍內（少于200個/10mm2或多于500個/100mm2），則需重新制備細胞懸液并再次計數(shù)。細胞活力檢測是衡量細胞生長狀態(tài)的關鍵指標，它反映了細胞的代謝活性和生存能力。本研究采用CCK-8法檢測細胞活力。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。具體操作如下：將Tca8113細胞以合適密度接種于96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液，每組設置3-5個復孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，每孔加入10μlCCK-8溶液。繼續(xù)孵育1-4h，期間甲臜產物不斷生成。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值的大小可判斷細胞活力，OD值越高，表明細胞活力越強，活細胞數(shù)量越多。在檢測過程中，需設置空白對照孔，即只加入培養(yǎng)基和CCK-8溶液，不加細胞，用于校正背景值。同時，要注意避免在加樣過程中產生氣泡，以免影響檢測結果的準確性。細胞形態(tài)觀察是一種直觀、簡便的監(jiān)測細胞生長狀態(tài)的方法，能夠從細胞的外觀形態(tài)變化初步判斷細胞的健康狀況。在倒置顯微鏡下，正常生長的Tca8113細胞呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長，細胞形態(tài)規(guī)則，邊界清晰，胞質均勻，細胞核清晰可見。當細胞生長狀態(tài)良好時，細胞呈多邊形或梭形，伸展充分，相互之間緊密連接，形成致密的細胞單層。隨著培養(yǎng)時間的延長，若細胞進入對數(shù)生長期，細胞數(shù)量迅速增加，細胞形態(tài)更加飽滿，立體感增強。然而，當細胞生長環(huán)境不佳或受到外界因素干擾時，細胞形態(tài)會發(fā)生明顯變化。例如，當細胞受到污染時，可見細胞周圍出現(xiàn)小黑點或絲狀物質，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象。若細胞營養(yǎng)缺乏，細胞會變得扁平，胞質內出現(xiàn)空泡，細胞之間的連接變松散。通過定期觀察細胞形態(tài)，能夠及時發(fā)現(xiàn)細胞生長過程中出現(xiàn)的問題，并采取相應的措施進行調整，如更換培養(yǎng)基、調整培養(yǎng)條件等，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。五、人CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的表達檢測5.1轉染實驗設計與操作在探究人CEA基因疫苗在舌癌細胞株中的表達情況時，轉染實驗是關鍵環(huán)節(jié)。本研究選用脂質體轉染法將構建好的人CEA基因疫苗導入Tca8113舌癌細胞株中，脂質體轉染法具有操作簡便、轉染效率高、對細胞毒性小等優(yōu)點，在基因轉染實驗中被廣泛應用。在轉染實驗前，需要進行精心的準備工作。準備適量處于對數(shù)生長期的Tca8113舌癌細胞，此時的細胞生長旺盛，代謝活躍，對轉染試劑的耐受性較好，有利于提高轉染效率。將細胞接種于6孔板中，每孔接種細胞密度為1×10?個，加入適量的含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，使細胞在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中貼壁生長。待細胞生長至匯合度達到70%-80%時，進行轉染操作，此時細胞狀態(tài)良好，能夠更好地攝取外源基因。為了準確評估人CEA基因疫苗在舌癌細胞中的表達效果，本實驗設置了多個實驗組和對照組。實驗組轉染構建好的人CEA基因疫苗，以觀察CEA基因在舌癌細胞中的表達情況及對細胞生物學行為的影響。陽性對照組轉染已知能夠在Tca8113細胞中高效表達的報告基因質粒，如綠色熒光蛋白（GFP）表達質粒，用于驗證轉染實驗的有效性和細胞對轉染試劑的耐受性。陰性對照組轉染空的pVAX1載體，以排除載體本身對實驗結果的影響?？瞻讓φ战M不進行任何轉染操作，僅培養(yǎng)Tca8113細胞，用于提供正常細胞生長狀態(tài)的參照。通過設置這些對照組，能夠有效控制實驗變量，提高實驗結果的可靠性和準確性。轉染操作步驟如下：首先，在無菌的1.5ml離心管中，將5μg的人CEA基因疫苗質?；蛳鄳膶φ召|粒（陽性對照的GFP表達質粒、陰性對照的空pVAX1載體）加入250μl無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，輕輕混勻，避免產生氣泡。在另一離心管中，取10μl的脂質體轉染試劑（如Lipofectamine3000）加入250μl無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，同樣輕輕混勻。將上述兩種混合液室溫孵育5min，使脂質體與質粒充分結合，形成脂質體-質粒復合物。孵育結束后，將含有脂質體-質粒復合物的兩種溶液緩慢混合，輕輕顛倒離心管，使溶液充分混勻，再室溫孵育20min，進一步促進復合物的形成。此時，復合物中的脂質體能夠與細胞膜相互作用，將質粒導入細胞內。將6孔板中的原培養(yǎng)基吸出，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清，因為血清中的某些成分可能會影響脂質體與細胞膜的結合，降低轉染效率。向每孔中加入500μl含有脂質體-質粒復合物的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕搖勻，使復合物均勻分布在細胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4-6h，期間復合物會逐漸被細胞攝取。孵育結束后，吸出含有復合物的培養(yǎng)基，向每孔中加入2ml含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞。在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，根據(jù)實驗需求，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，并在合適的時間點收集細胞，用于檢測CEA基因的表達情況。在轉染操作過程中，有多個關鍵要點需要特別注意。要嚴格遵守無菌操作原則，在超凈工作臺中進行所有操作，避免微生物污染，因為污染可能導致細胞生長異常，影響轉染效果和實驗結果。準確控制轉染試劑和質粒的用量至關重要，用量過少可能導致轉染效率低下，無法檢測到目的基因的表達；而用量過多則可能對細胞產生毒性，影響細胞的正常生理功能。轉染試劑與質粒的比例也需要優(yōu)化，不同的細胞株和質粒可能需要不同的比例才能達到最佳轉染效果。在本實驗中，經(jīng)過預實驗優(yōu)化，確定了脂質體轉染試劑與質粒的最佳比例為2:1。此外，轉染過程中的溫度、時間等條件也會對轉染效率產生影響，需嚴格按照實驗方案進行控制。在孵育含有脂質體-質粒復合物的培養(yǎng)基時，溫度過高或過低都可能影響復合物的穩(wěn)定性和細胞的攝取效率，孵育時間過短則可能導致復合物與細胞結合不充分，轉染效率降低。5.2目的基因mRNA表達水平檢測運用RT-qPCR技術對CEA基因mRNA表達進行檢測，該技術能夠精準且靈敏地對特定DNA進行定量分析，為深入了解CEA基因在舌癌細胞株中的表達情況提供關鍵數(shù)據(jù)支持。實驗步驟如下：首先，使用TRIzol試劑提取轉染人CEA基因疫苗后的Tca8113舌癌細胞株以及對照組細胞（陽性對照組轉染GFP表達質粒、陰性對照組轉染空pVAX1載體、空白對照組未轉染）的總RNA。在提取過程中，嚴格按照試劑說明書操作，確保RNA的完整性和純度。取適量細胞，加入TRIzol試劑，充分裂解細胞，使RNA釋放出來。通過***抽提、異丙醇沉淀等步驟，去除蛋白質、DNA等雜質，獲得純凈的RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質量滿足后續(xù)實驗要求。將提取的總RNA反轉錄為cDNA，采用逆轉錄試劑盒，按照試劑盒說明書配置反應體系。在反應體系中，加入適量的總RNA、Oligo(dT)引物、dNTPs、逆轉錄酶等成分，在PCR儀中進行反應。反應條件為：42℃孵育60min，使RNA逆轉錄為cDNA；70℃加熱15min，終止逆轉錄反應。反應結束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。根據(jù)CEA基因和內參基因GAPDH的序列信息，設計特異性引物。CEA基因上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；GAPDH基因上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。引物設計遵循引物長度適中、GC含量合理、避免引物二聚體和發(fā)夾結構等原則，以確保擴增的特異性和效率。在PCR反應體系中，加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix、ddH?O等成分，總體積為20μl。將反應體系置于實時熒光定量PCR儀中進行擴增，擴增程序為：95℃預變性30s，使DNA雙鏈充分解