第六章細(xì)菌的遺傳分析大腸桿菌得突變類型突變型篩選(自學(xué))第二節(jié)大腸桿菌得突變型及篩選一、大腸桿菌得突變類型1、合成代謝功能得突變型——營(yíng)養(yǎng)缺陷型

合成代謝功能(anabolicfunction)

命名:Met-,Lys-原養(yǎng)型/野生型在基本培養(yǎng)基上,具有合成所有代謝和生長(zhǎng)所必須得復(fù)雜有機(jī)分子得功能。營(yíng)養(yǎng)缺陷型:一個(gè)必需得基因發(fā)生了突變不能進(jìn)行一個(gè)特定得生化反應(yīng),從而阻礙整個(gè)合成代謝功能得實(shí)現(xiàn)。2、分解代謝功能得突變型(catabolicfunctionalmutants)分解代謝功能(anabolicfunction)一系列降解功能得實(shí)現(xiàn)也需要許多基因得表達(dá),其中任何一個(gè)基因突變都會(huì)影響降解功能得實(shí)現(xiàn)。如Lac-突變型不能分解乳糖,因此就不能生長(zhǎng)在以乳糖為唯一碳源得基本培養(yǎng)基上。3、抗性突變型:細(xì)菌由于某基因得突變而對(duì)某些噬菌體或抗菌素產(chǎn)生抗性。如:抗藥突變型:抗鏈霉素突變型:Strr,(野生型Strs)抗青霉素突變型:Penr,(野生型Pens)抗phage突變型:抗T1-phage突變型:Tonr,(野生型Tons)細(xì)菌接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)F因子及其轉(zhuǎn)移細(xì)菌重組得特點(diǎn)第三節(jié)細(xì)菌得接合與染色體作圖一、細(xì)菌接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)菌株A:met-

bio-

thr+

leu+

thi+菌株B:met+

bio+

thr-

leu-

thi-Met+

bio+

thr+

leu+

thi+二、F因子及其轉(zhuǎn)移細(xì)菌主要就是無(wú)性繁殖,直到1946年人們才注意到不同品系大腸桿菌間可以雜交,并進(jìn)行了基因重組,從而首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌也有“性別”。1、細(xì)菌得性別9大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流2、F因子/性因子/致育因子F因子:環(huán)狀DNA,含6×104個(gè)bp。大腸桿菌供體中含有,而受體無(wú)。由原點(diǎn)、致育基因、配對(duì)區(qū)三個(gè)部分組成。環(huán)狀F因子得模式圖組成F因子各部分得功能原點(diǎn):就是轉(zhuǎn)移得起點(diǎn)。配對(duì)區(qū):此處與大腸桿菌DNA多處核苷酸序列相對(duì)應(yīng)(即同源序列),故可通過交換而使F因子整合到大腸桿菌DNA上。致育基因:其上一些基因編碼生成F菌毛得蛋白質(zhì),即供體菌細(xì)胞表面得管狀結(jié)構(gòu),F菌毛與受體菌細(xì)胞表面得受體相結(jié)合,在兩個(gè)細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)橋。3、F+、F-與HfrF+:細(xì)胞質(zhì)中具有F因子得大腸桿菌(供體)F-:細(xì)胞質(zhì)中沒有F因子得大腸桿菌(受體)大腸桿菌性別F-F+F+F-大腸桿菌性別大腸桿菌DNAF因子F因子及其在雜交中得行為細(xì)胞質(zhì)橋(接合管)F+×F-F+F+F因子轉(zhuǎn)移得頻率很高,但細(xì)菌DNA間得重組率很低,故稱F+為低頻重組品系(lowfrequencerebination,Lfr)。F+×F-Hfr(highfrequencerebination)F因子整合入大腸桿菌染色體中原點(diǎn)致育基因配對(duì)區(qū)大腸桿菌性別致育基因原點(diǎn)配對(duì)區(qū)細(xì)菌染色體F-細(xì)菌DNA間得重組率很高,故稱之為高頻重組品系(highfrequencerebination,Hfr),重組率為10-2。F因子轉(zhuǎn)移得頻率很低。F因子得環(huán)出4、附加體象F因子既可獨(dú)立存在于染色體之外作為一個(gè)獨(dú)立得復(fù)制子,也可整合到大腸桿菌染色體中作為大腸桿菌復(fù)制子得一部分得遺傳物質(zhì)(遺傳因子),稱為附加體。三、細(xì)菌重組得特點(diǎn)及機(jī)制細(xì)菌重組得特點(diǎn)細(xì)菌同源重組得分子基礎(chǔ)(一)細(xì)菌重組得特點(diǎn)中斷雜交實(shí)驗(yàn)與重組作圖細(xì)菌重組不同于真核生物得完整二倍體得重組。Hfr與F－接合常會(huì)形成部分二倍體部分二倍體:這種含有一個(gè)親體F-全部基因組和另一親體部分基因組得合子叫部分合子(半合子)/部分二倍體。細(xì)菌得重組就就是指F-得DNA(內(nèi)基因子)與Hfr得部分DNA(外基因子)之間得重組。F-的DNAHfr的部分DNA內(nèi)、外基因子得交換情況單交換

部分二倍性線狀體雙交換

重組體＋線性片斷偶數(shù)次交換結(jié)果:只產(chǎn)生一種重組體,而無(wú)另一相應(yīng)得重組體。由此可見在細(xì)菌得重組中有下列兩個(gè)特點(diǎn):1、只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡得重組子;2、不出現(xiàn)相反得重組子,所以在選擇培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種重組子。(二)細(xì)菌同源重組得分子基礎(chǔ)RecBCD識(shí)別chi序列引發(fā)重組RecA催化單鏈同化Ruv系統(tǒng)解離Holiday連接點(diǎn)1、RecBCD識(shí)別chi序列引發(fā)重組保守得8堿基非對(duì)稱序列大腸桿菌DNA每5-10Kb自然出現(xiàn)一次被recBCD編碼得酶所識(shí)別刺激重組——重組熱點(diǎn)1)chi

位點(diǎn)2)RecBCD酶得功能①能降解DNA得核酸酶(核酸外切酶Ⅴ)②解旋酶活性③ATP酶活性目標(biāo):提供一條含游離3’端得單鏈區(qū)域(RecA可以作用得底物)RecBCD酶識(shí)別chi序列引發(fā)重組含游離3’端的單鏈2、RecA催化單鏈同化①具有蛋白酶活性②在單鏈DNA和ATP存在得條件下啟動(dòng)DNA單鏈和與之互補(bǔ)得雙鏈分子進(jìn)行堿基配對(duì)。單鏈同化:RecA可使一條DNA單鏈置換一條雙鏈DNA分子中同源鏈得反應(yīng)。單鏈同化需要得條件:a、必須有一個(gè)單鏈DNA分子區(qū)域。b、必須有一個(gè)具游離3’端得DNA分子;c、該單鏈區(qū)域和3’端必須位于這兩個(gè)分子得互補(bǔ)區(qū)域中。具有游離3’端得單鏈單鏈具有游離3’端3、Ruv系統(tǒng)解離Holiday連接點(diǎn)RuvA:識(shí)別Holliday連接點(diǎn)得結(jié)構(gòu)RuvB:具ATP酶得活性,為分支遷移提供動(dòng)力。RuvC:具有核酸內(nèi)切酶活性,可特異識(shí)別Holliday連接點(diǎn)。一、中斷雜交實(shí)驗(yàn)原理二、中斷雜交作圖三、重組作圖(自學(xué))第四節(jié)中斷雜交與重組作圖一、中斷雜交實(shí)驗(yàn)原理Hfr細(xì)胞和F-細(xì)胞雜交,基因從Hfr細(xì)胞按次序轉(zhuǎn)入F-細(xì)胞,可根據(jù)基因進(jìn)入F-細(xì)胞得時(shí)間和次序制作基因圖譜。實(shí)驗(yàn)材料

Hfr:thr+leu+azistonslac+gal+strs

F-:thr-leu-azirtonrlac-gal-strr

strr(F-可以在鏈霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng))strs(Hfr不能在鏈霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng))實(shí)驗(yàn)方法-中斷雜交實(shí)驗(yàn)兩品系在液體培養(yǎng)基里,通氣混合培養(yǎng),定時(shí)取樣,猛烈攪拌以中斷雜交,釋稀菌液,在含Str得基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。AABBCCDDDDCCB二、中斷雜交作圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果混合時(shí)間(min)結(jié)果8出現(xiàn)得菌落與F－相同,說(shuō)明Hfr得基因未進(jìn)入F－9出現(xiàn)少量得azis菌落,說(shuō)明azis己從Hfr轉(zhuǎn)移到F－11出現(xiàn)azistons型得F－菌落18出現(xiàn)azistonslac＋型得F－菌落24出現(xiàn)azistonslac＋gal＋型得F－菌落隨時(shí)間推移,具有某一基因得菌落逐漸增加,達(dá)到一定頻率后就不再變動(dòng),而且愈早轉(zhuǎn)入得基因,所達(dá)到得頻率也愈高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明:Hfr得DNA從一端開始,以線性方式逐段進(jìn)入F－,這一端叫原點(diǎn)或O點(diǎn)。O點(diǎn)

azis

tons

lac＋

gal＋

時(shí)間單位法以轉(zhuǎn)移時(shí)間單位(每分鐘)作為基因間距單位,可作出Hfr得“染色體”上得基因分布圖(基因連鎖圖)。E、coli得連鎖群E、coliK12得基因組環(huán)形圖為100min假如讓Hfr×F－雜交持續(xù)2h后中斷雜交,發(fā)現(xiàn)一些F－

F＋。這說(shuō)明Hfr得全部基因轉(zhuǎn)移到F－內(nèi),排列到最后得F因子才進(jìn)入F－,使F－

F＋。中斷雜交實(shí)驗(yàn)與重組作圖原點(diǎn)致育基因配對(duì)區(qū)致育基因F因子在細(xì)菌染色體上有很多插入位點(diǎn),并且插入得取向不同一個(gè)F＋品系可以產(chǎn)生很多Hfr品系幾個(gè)Hfr菌株得線性連鎖群得產(chǎn)生HfrH菌株得基因轉(zhuǎn)移順序thrprolacpurgalhisglythiHfr1菌株得基因轉(zhuǎn)移順序thrthiglyhisgalpurlacproF′因子的形成細(xì)菌染色體第五節(jié)F′因子與性導(dǎo)一、F′因子與F′菌株帶有部分細(xì)菌染色體得F因子稱F′因子。特點(diǎn):能獨(dú)立復(fù)制

F′菌株:指帶有F′因子得細(xì)菌。二、性導(dǎo)(sexduction或F′

-duction)通過F′因子將供體細(xì)胞得基因?qū)胧荏w形成部分二倍體得過程叫性導(dǎo)。性導(dǎo)F′因子F-部分二倍體F′菌株Hfr菌株F′菌株aa細(xì)菌得轉(zhuǎn)化與作圖細(xì)菌得轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖第六節(jié)細(xì)菌得轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖一、細(xì)菌得轉(zhuǎn)化與作圖轉(zhuǎn)化作用:從細(xì)菌得培養(yǎng)物提取得DNA可以在體外轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌中得過程。發(fā)生轉(zhuǎn)化得頻率很低:大約為1％得受體細(xì)菌可吸收外源DNA并發(fā)生轉(zhuǎn)化。原因:受體細(xì)菌得受體部位得數(shù)目就是有限得。外源DNA片段只就是在受體部位通過。外源DNA得進(jìn)入,除受體部位外,還必須有酶或蛋白質(zhì)分子,以及能量等得協(xié)同作用。外源DNA只有在酶促旺盛得受體部位進(jìn)入。感受態(tài)細(xì)胞與感受態(tài)因子感受態(tài)細(xì)胞:這種能接受外源DNA分子并被轉(zhuǎn)化得細(xì)菌細(xì)胞。感受態(tài)因子:促進(jìn)轉(zhuǎn)化作用得酶或蛋白質(zhì)得分子。感受態(tài)細(xì)胞單鏈通過交換進(jìn)行整合座位轉(zhuǎn)化體類別trp2+---+++his2++-+--+tyr1+++--+-11940366068541826001071180親本型(++)重組型(+-)和(-+)重組值(重組體數(shù)/總數(shù))Trp2-his2Trp2-tyr1His2-tyr1供體trp2+his2+tyr1+

DNA向受體trp2-his2-tyr1-

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化體得類別及重組值得計(jì)算11940+11802600+107+3660+41811940+1072600+1180+3660+68511940+3660418+1180+685+107轉(zhuǎn)化基因間重組值得計(jì)算

轉(zhuǎn)化子數(shù)(重組體數(shù))親組合數(shù)+轉(zhuǎn)化子數(shù)

trp2—his2得重組值=34%trp2—tyr1得重組值=40%his2—tyr1得重組值=13%根據(jù)重組值作圖:trp234cM

his2

13cMtyr1重組值==

(+-)+(-+)(++)+(+-)+(-+)

二、細(xì)菌得轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖(后學(xué))轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:以噬菌體為媒介,將細(xì)菌得小片段DNA或基因,從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一細(xì)菌得過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。(一)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與作圖J、Lederberg和N、Zinder做了這樣一個(gè)雜交試驗(yàn):鼠沙門氏菌得2個(gè)突變菌株:LA22:phe-trp-met+his+LA2:phe+trp+met-his-LA22+LA2混合培養(yǎng)得野生型(10-5)U型管實(shí)驗(yàn)只允許DNA等大分子及病毒通過,細(xì)菌細(xì)胞不能通過。Hfr實(shí)驗(yàn)結(jié)果:右臂得到了野生型細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果得解釋p22得釋放:LA22就是帶有P22原phage得細(xì)菌;在培養(yǎng)過程中,少數(shù)LA22細(xì)菌自溶釋放出游離得p22。p22得侵染:這種游離得p22通過濾孔進(jìn)入左臂而感染了LA2細(xì)菌。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體得形成:在裂解LA2