MAPK-MrHog1通路：解鎖綠僵菌脅迫應(yīng)答與毒力調(diào)控的分子密碼一、引言1.1研究背景在農(nóng)業(yè)和林業(yè)領(lǐng)域，病蟲害的防治始終是保障作物和林木健康生長(zhǎng)、實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長(zhǎng)期以來，化學(xué)農(nóng)藥憑借其高效、快速的殺蟲殺菌效果，在病蟲害防治中占據(jù)主導(dǎo)地位。然而，隨著化學(xué)農(nóng)藥的廣泛且大量使用，一系列弊端逐漸凸顯，如害蟲抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染加劇、生態(tài)平衡遭到破壞以及食品安全受到威脅等問題日益嚴(yán)重。在此背景下，生物防治作為一種綠色、環(huán)保、可持續(xù)的病蟲害防控策略，受到了廣泛關(guān)注和深入研究。綠僵菌（Metarhizium）作為生物防治領(lǐng)域中極具潛力的昆蟲病原真菌，在農(nóng)林害蟲防治方面發(fā)揮著重要作用。其寄主范圍廣泛，涵蓋了直翅目、鱗翅目、鞘翅目、同翅目等多個(gè)目的200余種害蟲，對(duì)蝗蟲、蠐螬、小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲等常見農(nóng)林害蟲均有顯著的寄生性。綠僵菌作用機(jī)制獨(dú)特，通過產(chǎn)生綠僵菌素等活性物質(zhì)，破壞害蟲的生理機(jī)能，進(jìn)而達(dá)到殺蟲的目的。同時(shí)，綠僵菌對(duì)人畜安全，不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染，也不易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，這使得它成為替代化學(xué)農(nóng)藥的理想選擇之一，在綠色食品生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，在蝗蟲防治中，綠僵菌可通過接觸感染蝗蟲，使其食欲減退、行動(dòng)遲緩，最終死亡，從而有效控制蝗蟲種群數(shù)量，減少對(duì)農(nóng)作物的危害。然而，綠僵菌在實(shí)際應(yīng)用過程中，其防治效果受到多種環(huán)境因素的顯著影響。綠僵菌分生孢子萌發(fā)對(duì)溫度和濕度要求較為嚴(yán)格，最適溫度為28℃，在25-32℃有較好的殺蟲效果，當(dāng)溫度高于40℃或低于7-8℃時(shí)，分生孢子不萌發(fā)；生長(zhǎng)發(fā)育要求空氣相對(duì)濕度93%以上，98%-100%為最適，在低濕度環(huán)境下，綠僵菌的生長(zhǎng)和侵染能力會(huì)受到明顯抑制。紫外線輻射也會(huì)對(duì)綠僵菌的活性產(chǎn)生負(fù)面影響，降低其防治效果。這些環(huán)境因素的限制，導(dǎo)致綠僵菌在不同的自然條件下防治效果不穩(wěn)定，限制了其大規(guī)模推廣和應(yīng)用。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信號(hào)通路是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路高度保守，廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中。在真菌中，MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控多個(gè)重要的生理過程，包括對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答以及致病性的調(diào)節(jié)等。MAPK-MrHog1通路作為MAPK信號(hào)通路中的重要成員，在綠僵菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫和調(diào)控毒力方面可能扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)綠僵菌面臨高滲透壓、氧化應(yīng)激、熱激以及紫外線輻射等環(huán)境脅迫時(shí)，MAPK-MrHog1通路可能被激活，通過一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將外界信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性，使綠僵菌能夠適應(yīng)脅迫環(huán)境，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。該通路還可能參與調(diào)控綠僵菌的毒力相關(guān)因子，影響其對(duì)寄主昆蟲的侵染和致病過程。深入研究MAPK-MrHog1通路，對(duì)于揭示綠僵菌的脅迫應(yīng)答機(jī)制和毒力調(diào)控機(jī)制具有重要意義。通過解析該通路的具體組成、信號(hào)傳遞過程以及與其他信號(hào)通路的交互作用，可以為提高綠僵菌的抗逆性和防治效果提供理論基礎(chǔ)，有助于開發(fā)更加高效、穩(wěn)定的綠僵菌生物防治制劑，推動(dòng)生物防治技術(shù)在農(nóng)林病蟲害防控中的廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.2綠僵菌概述綠僵菌隸屬于真菌界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae），是一類重要的昆蟲病原真菌。自1879年俄國(guó)生物學(xué)家Metschnikoff發(fā)現(xiàn)綠僵菌以來，其在生物防治領(lǐng)域的潛力逐漸受到關(guān)注。在真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中，綠僵菌屬下共有92個(gè)種，常見的有金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）、蝗綠僵菌（Metarhiziumacridum）、黃綠綠僵菌（Metarhiziumflavoviride）等。不同種類的綠僵菌在形態(tài)、生理特性和寄主范圍上存在一定差異，如金龜子綠僵菌寄主廣泛，可侵染多種昆蟲；而蝗綠僵菌則對(duì)蝗蟲等直翅目昆蟲具有較強(qiáng)的致病性。綠僵菌的菌落初期通常呈白色，茸狀，隨著生長(zhǎng)進(jìn)入產(chǎn)孢階段，菌落中間會(huì)出現(xiàn)一叢叢具有不同程度綠色的分生孢子堆，顏色可由綠色逐漸變灰綠直至黑色，或者保持翡翠綠色，基質(zhì)反面色澤多呈淡褐色，少數(shù)菌種呈赭色。其分生孢子梗單生或聚集形成分生孢子梗座，緊密排列，具有帚狀分枝或輪生體，帚狀枝層次一般不復(fù)雜，多為1-2層，頂端分枝，末端為瓶狀小梗，以向基式產(chǎn)生分生孢子。分生孢子單細(xì)胞，呈鏈狀連接，初期無色，成熟時(shí)呈淡綠色至橄欖綠色，形體一般較青霉屬孢子大，且常以粘液粘成平行排列的柱狀孢子鏈柱，在老培養(yǎng)體中，柱狀孢子鏈柱會(huì)潰散為菱形或其他不規(guī)則形狀的分生孢子團(tuán)塊。綠僵菌的蟲菌體以裂殖和芽殖方式進(jìn)行繁殖，在適宜條件下，能夠快速增殖并侵染寄主昆蟲。綠僵菌具有廣泛的寄主范圍，可在8個(gè)目30個(gè)科200余種害蟲上寄生，涵蓋了鱗翅目、直翅目、鞘翅目、同翅目等多個(gè)目的眾多害蟲。例如，在鱗翅目害蟲防治中，綠僵菌對(duì)小菜蛾、菜青蟲等具有顯著的寄生性，能夠有效抑制其種群數(shù)量；對(duì)于直翅目害蟲，如蝗蟲，綠僵菌是一種重要的生物防治手段，可通過接觸感染蝗蟲，使其感染發(fā)病死亡。在鞘翅目害蟲防治方面，綠僵菌對(duì)蠐螬等地下害蟲也有一定的防治效果。在生物防治應(yīng)用中，綠僵菌具有諸多優(yōu)勢(shì)。綠僵菌是一種生物農(nóng)藥，對(duì)人畜安全，不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染，也不會(huì)像化學(xué)農(nóng)藥那樣在農(nóng)產(chǎn)品中殘留有害物質(zhì)，保障了食品安全，這使得它在綠色食品生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。綠僵菌對(duì)目標(biāo)害蟲作用專一，不殺傷自然界中的害蟲天敵，有助于維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。害蟲對(duì)綠僵菌不易產(chǎn)生抗藥性，這保證了其長(zhǎng)期的防治效果，避免了因害蟲抗藥性導(dǎo)致的防治失效問題。然而，綠僵菌在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些限制因素。綠僵菌的防治效果受環(huán)境因素影響較大，其分生孢子萌發(fā)對(duì)溫度和濕度要求較為嚴(yán)格，最適溫度為28℃，在25-32℃有較好的殺蟲效果，當(dāng)溫度高于40℃或低于7-8℃時(shí)，分生孢子不萌發(fā)；生長(zhǎng)發(fā)育要求空氣相對(duì)濕度93%以上，98%-100%為最適。在干旱、高溫或低溫等不利環(huán)境條件下，綠僵菌的生長(zhǎng)和侵染能力會(huì)受到明顯抑制，從而影響其防治效果。紫外線輻射也會(huì)對(duì)綠僵菌的活性產(chǎn)生負(fù)面影響，降低其防治效果，限制了其在戶外環(huán)境中的應(yīng)用。綠僵菌的殺蟲速度相對(duì)較慢，從感染害蟲到害蟲死亡通常需要一定的時(shí)間，在害蟲爆發(fā)初期，可能無法迅速控制害蟲的危害，這在一定程度上限制了其在一些緊急病蟲害防治場(chǎng)景中的應(yīng)用。1.3MAPK信號(hào)通路簡(jiǎn)介絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信號(hào)通路是真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守且至關(guān)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。該通路在從酵母到人類等幾乎所有真核生物中均廣泛存在，充分體現(xiàn)了其在生物進(jìn)化過程中的重要性和保守性。在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，MAPK信號(hào)通路猶如一個(gè)精密的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用。從細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的角度來看，MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，推動(dòng)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖期，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。在胚胎發(fā)育過程中，該通路對(duì)細(xì)胞的分化和組織器官的形成起著不可或缺的調(diào)控作用，影響著細(xì)胞的發(fā)育方向和進(jìn)程，確保胚胎能夠正常發(fā)育成完整的個(gè)體。在神經(jīng)系統(tǒng)的形成過程中，MAPK信號(hào)通路參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化，影響神經(jīng)元的生成和突觸的形成，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。在細(xì)胞對(duì)應(yīng)激反應(yīng)方面，MAPK信號(hào)通路能夠感知并響應(yīng)各種外界環(huán)境壓力，如氧化應(yīng)激、熱激、紫外線輻射、高滲透壓等。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，通過一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性，使細(xì)胞能夠調(diào)整自身的生理狀態(tài)，適應(yīng)并抵抗這些壓力。在氧化應(yīng)激條件下，MAPK信號(hào)通路可以激活抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化損傷；在高滲透壓環(huán)境中，該通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。MAPK信號(hào)通路主要由三個(gè)關(guān)鍵的激酶級(jí)聯(lián)組成，分別是MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）。這三個(gè)激酶在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)有序的信號(hào)傳遞鏈條，通過磷酸化作用將信號(hào)逐級(jí)傳遞和放大。當(dāng)細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞內(nèi)的傳感器感知到外界刺激信號(hào)后，首先激活MAPKKK。MAPKKK是一種上游激酶，它能夠通過磷酸化作用激活下游的MAPKK?；罨腗APKK進(jìn)一步發(fā)揮激酶活性，將MAPK磷酸化，使其激活。激活后的MAPK具有活性，可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子或其他靶蛋白，調(diào)控基因的表達(dá)和細(xì)胞的生物學(xué)過程。除了這三個(gè)核心激酶外，MAPK信號(hào)通路還包括一些上游激活蛋白和抑制蛋白。上游激活蛋白能夠?qū)⑼饨缧盘?hào)傳遞給MAPKKK，啟動(dòng)信號(hào)通路的激活過程；而抑制蛋白則可以通過與通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，抑制MAPK信號(hào)通路的活性，從而精細(xì)地調(diào)控信號(hào)通路的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。根據(jù)MAPK的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，MAPK信號(hào)通路可進(jìn)一步分為四大類，分別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路、p38MAPK通路和ERK5通路。ERK通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖過程。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，ERK通路被激活，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，在細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生發(fā)展和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著至關(guān)重要的作用。JNK通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。在細(xì)胞受到紫外線、氧化應(yīng)激等外界刺激時(shí)，JNK通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或產(chǎn)生其他應(yīng)激反應(yīng)，在癌癥、神經(jīng)退行性疾病和炎癥性疾病中發(fā)揮作用。p38MAPK通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子、細(xì)菌或病毒等刺激時(shí)，p38MAPK通路被激活，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病中起著重要作用。ERK5通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的生存、血管生成和細(xì)胞遷移等過程。在細(xì)胞受到某些生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，ERK5通路被激活，促進(jìn)細(xì)胞的生存和遷移。這四類MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞中分工協(xié)作，各自發(fā)揮獨(dú)特的作用，共同維持細(xì)胞的正常生理功能。1.4Hog1MAPK信號(hào)通路研究進(jìn)展Hog1MAPK信號(hào)通路作為MAPK信號(hào)通路家族中的重要成員，在真菌的生理過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，尤其是在應(yīng)對(duì)高滲透壓等脅迫環(huán)境時(shí)，其調(diào)控機(jī)制對(duì)于真菌的生存和適應(yīng)至關(guān)重要。Hog1MAPK信號(hào)通路主要由一系列保守的蛋白激酶組成，包括MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），以及一些上游激活蛋白和調(diào)節(jié)因子。在釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，該通路的核心組成部分包括Ssk2/Ssk22（MAPKKK）、Pbs2（MAPKK）和Hog1（MAPK）。當(dāng)細(xì)胞感受到外界高滲透壓刺激時(shí)，位于細(xì)胞膜上的感受器Sln1和Ypd1首先感知信號(hào)，并將其傳遞給下游的Ssk1。Ssk1進(jìn)而激活Ssk2/Ssk22，使其磷酸化并激活Pbs2。Pbs2再將Hog1磷酸化，激活的Hog1進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Sko1、Msn2和Msn4等，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞適應(yīng)高滲透壓環(huán)境。Hog1MAPK信號(hào)通路的激活是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控。除了上述的滲透壓感受器介導(dǎo)的激活途徑外，該通路還可以通過其他方式被激活。在一些真菌中，氧化應(yīng)激、熱激、細(xì)胞壁損傷等脅迫條件也能誘導(dǎo)Hog1MAPK信號(hào)通路的激活。當(dāng)真菌受到過氧化氫等氧化劑的刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激信號(hào)可以通過特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活Hog1MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制，以應(yīng)對(duì)氧化損傷。一些細(xì)胞因子和激素也可能參與Hog1MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步豐富了其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在真菌應(yīng)對(duì)高滲透壓脅迫的過程中，Hog1MAPK信號(hào)通路發(fā)揮著核心作用。激活后的Hog1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓平衡，通過促進(jìn)甘油等相容性溶質(zhì)的合成和積累，提高細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，防止細(xì)胞失水。Hog1還能調(diào)控細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，維持細(xì)胞內(nèi)離子的平衡，穩(wěn)定細(xì)胞的生理功能。在高滲透壓環(huán)境下，Hog1可以激活甘油合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)甘油含量升高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，適應(yīng)高滲環(huán)境。除了高滲透壓脅迫，Hog1MAPK信號(hào)通路在真菌應(yīng)對(duì)其他多種脅迫時(shí)也發(fā)揮著重要作用。在氧化應(yīng)激條件下，該通路可以誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化損傷。當(dāng)真菌受到紫外線輻射時(shí)，Hog1MAPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，幫助細(xì)胞修復(fù)受損的DNA。在熱激脅迫下，該通路能夠調(diào)控?zé)嵝菘说鞍椎谋磉_(dá)，保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能，維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。Hog1MAPK信號(hào)通路在真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性等方面也具有重要的調(diào)控作用。在真菌的生長(zhǎng)過程中，該通路參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，影響細(xì)胞的分裂和增殖。在真菌的發(fā)育階段，Hog1MAPK信號(hào)通路對(duì)菌絲的生長(zhǎng)、分化和產(chǎn)孢等過程具有重要影響。在致病性方面，該通路與真菌的侵染能力和毒力密切相關(guān)。一些植物病原真菌中，Hog1MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)病原菌對(duì)植物細(xì)胞壁的降解酶的分泌，增強(qiáng)病原菌的侵染能力。在昆蟲病原真菌中，該通路可能參與調(diào)控真菌與昆蟲寄主之間的相互作用，影響真菌的毒力和致病效率。1.5研究目的與意義本研究旨在深入探究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫以及調(diào)控毒力過程中的分子機(jī)制，為提高綠僵菌在生物防治中的效果提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和潛在的技術(shù)策略。從理論研究角度來看，MAPK信號(hào)通路在真核生物中高度保守且功能多樣，但在綠僵菌中，關(guān)于MAPK-MrHog1通路的具體組成、信號(hào)傳遞過程以及其與其他信號(hào)通路的交互作用等方面，仍存在諸多未知。深入研究該通路，能夠豐富我們對(duì)綠僵菌分子生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步完善真菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論體系。通過揭示MAPK-MrHog1通路在綠僵菌生長(zhǎng)、發(fā)育、脅迫應(yīng)答和毒力調(diào)控等過程中的作用機(jī)制，有助于深入理解綠僵菌與寄主昆蟲之間的相互作用關(guān)系，以及綠僵菌在復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中的生存和適應(yīng)策略，為后續(xù)研究綠僵菌的遺傳改良和應(yīng)用提供理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，綠僵菌作為一種重要的生物防治真菌，其防治效果受環(huán)境因素影響較大，限制了其大規(guī)模推廣和應(yīng)用。深入研究MAPK-MrHog1通路，有可能發(fā)現(xiàn)提高綠僵菌抗逆性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過基因工程等技術(shù)手段，對(duì)該通路進(jìn)行調(diào)控，有望培育出具有更強(qiáng)抗逆性的綠僵菌菌株，使其能夠在更廣泛的環(huán)境條件下保持較高的活性和侵染能力，從而提高綠僵菌生物防治制劑的穩(wěn)定性和可靠性。研究MAPK-MrHog1通路對(duì)綠僵菌毒力的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示綠僵菌致病的分子基礎(chǔ)，為開發(fā)高效的綠僵菌生物防治產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。通過優(yōu)化綠僵菌的毒力相關(guān)基因表達(dá)，提高其對(duì)害蟲的侵染速度和致病力，有望縮短害蟲死亡時(shí)間，增強(qiáng)綠僵菌在害蟲防治中的速效性，使其能夠更好地滿足農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)中對(duì)病蟲害防治的需求，推動(dòng)生物防治技術(shù)在農(nóng)林領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)和林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用的綠僵菌菌株為金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）CQMa102，由本實(shí)驗(yàn)室保存。該菌株經(jīng)過多代培養(yǎng)和鑒定，其遺傳穩(wěn)定性和生物學(xué)特性均較為明確，在前期研究中已被證明對(duì)多種昆蟲具有較強(qiáng)的致病性，為研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌中的功能提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)昆蟲選用大蠟螟（Galleriamellonella）幼蟲，購(gòu)自當(dāng)?shù)乩ハx養(yǎng)殖基地。大蠟螟幼蟲生長(zhǎng)周期較為規(guī)律，對(duì)綠僵菌敏感，是研究綠僵菌毒力的常用模式昆蟲。在實(shí)驗(yàn)前，將大蠟螟幼蟲置于溫度為（28±1）℃、相對(duì)濕度為（70±5）%的人工氣候箱中，以新鮮的蜂蠟和花粉混合物為飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，保證幼蟲健康生長(zhǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供生理狀態(tài)一致的實(shí)驗(yàn)昆蟲。實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek-DoxMedium）和昆蟲血淋巴培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基用于綠僵菌的常規(guī)培養(yǎng)和保存，其配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。制備時(shí)，將馬鈴薯去皮切塊，煮沸30min后過濾取汁，加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌20min。察氏培養(yǎng)基用于綠僵菌的營(yíng)養(yǎng)成分研究和特定生理實(shí)驗(yàn)，其配方為：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。按上述方法加熱溶解、分裝和滅菌。昆蟲血淋巴培養(yǎng)基用于模擬昆蟲體內(nèi)環(huán)境，研究綠僵菌在侵染過程中的生長(zhǎng)特性，其制備方法較為復(fù)雜，需采集新鮮的大蠟螟血淋巴，加入適量的營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素，經(jīng)無菌處理后備用。實(shí)驗(yàn)用到的試劑主要有DNA提取試劑盒（TIANGENBiotech）、RNA提取試劑盒（OMEGABio-Tek）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa）、限制性內(nèi)切酶（NEB）、T4DNA連接酶（NEB）、氨芐青霉素、卡那霉素、潮霉素等。這些試劑均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用試劑，具有較高的純度和穩(wěn)定性，能夠滿足實(shí)驗(yàn)中基因克隆、表達(dá)分析和遺傳轉(zhuǎn)化等操作的要求。DNA提取試劑盒可高效提取綠僵菌基因組DNA，用于基因克隆和PCR擴(kuò)增；RNA提取試劑盒能快速提取高質(zhì)量的RNA，為后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR實(shí)驗(yàn)提供保障；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒的反應(yīng)體系穩(wěn)定，擴(kuò)增效率高，可準(zhǔn)確地檢測(cè)基因的表達(dá)水平；限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶用于構(gòu)建重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)基因的敲除和回補(bǔ)；抗生素則用于篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子。儀器設(shè)備方面，包括PCR儀（Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、電子天平（Sartorius）、核酸蛋白分析儀（ThermoScientific）等。PCR儀可精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；凝膠成像系統(tǒng)能清晰地顯示DNA和RNA電泳條帶，方便結(jié)果分析；恒溫培養(yǎng)箱為綠僵菌和昆蟲的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)可快速分離細(xì)胞和核酸等生物大分子；超凈工作臺(tái)確保實(shí)驗(yàn)操作在無菌條件下進(jìn)行，防止雜菌污染；電子天平用于準(zhǔn)確稱量試劑和培養(yǎng)基成分；核酸蛋白分析儀可測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度和純度，為實(shí)驗(yàn)提供重要的數(shù)據(jù)支持。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1綠僵菌的培養(yǎng)與保存將保存的金龜子綠僵菌CQMa102菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，待菌落長(zhǎng)滿平板且產(chǎn)生大量分生孢子后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在無菌條件下，用無菌水將平板上的分生孢子洗下，制成濃度為1×10^8個(gè)/mL的分生孢子懸浮液，可用于接種實(shí)驗(yàn)昆蟲或進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)操作。對(duì)于綠僵菌的保存，采用斜面低溫保藏法和甘油管冷凍保藏法相結(jié)合的方式。將綠僵菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-10天，待斜面長(zhǎng)滿菌絲和分生孢子后，置于4℃冰箱中保存，每3-6個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，以保持菌株的活性。制備甘油管，將綠僵菌分生孢子懸浮液與50%甘油按1:1的比例混合均勻，分裝至1.5mL離心管中，每管1mL，置于-80℃超低溫冰箱中保存，可長(zhǎng)期保存菌株，且在需要時(shí)能夠快速?gòu)?fù)蘇使用。2.2.2MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因的克隆與鑒定根據(jù)已公布的金龜子綠僵菌基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件，如NCBI的BLAST工具，分析并篩選出MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因，包括MrHog1基因及其上下游的MAPKKK、MAPKK等基因。針對(duì)篩選出的基因，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物的長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)堿基，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃之間。同時(shí)，在引物的5'端添加合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，便于后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建。以提取的綠僵菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s（根據(jù)引物Tm值調(diào)整退火溫度），72℃延伸1-2min（根據(jù)基因片段長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間），共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有特異性擴(kuò)增條帶，根據(jù)條帶的大小初步判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的基因。將PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段進(jìn)行切膠回收，使用DNA凝膠回收試劑盒（TIANGENBiotech）按照說明書操作，回收純化目的基因片段。將回收的目的基因片段連接到pMD19-T載體（TaKaRa）上，連接體系為10μL，包括pMD19-TVector1μL，目的基因片段4μL，SolutionI5μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TIANGENBiotech）中，具體操作如下：取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；取200μL菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGENBiotech）提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定體系為20μL，包括重組質(zhì)粒5μL，10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶（根據(jù)引物添加的酶切位點(diǎn)選擇）各1μL，ddH?O11μL，37℃酶切2-3h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司（如華大基因）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件與已知的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定克隆的基因序列的準(zhǔn)確性，并通過BLAST工具與其他物種的同源基因進(jìn)行比對(duì)，分析其同源性。2.2.3基因敲除與回復(fù)菌株的構(gòu)建采用同源重組的方法構(gòu)建基因敲除載體。以金龜子綠僵菌基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增目的基因的上下游同源臂。上下游同源臂的長(zhǎng)度一般為1-2kb，以保證同源重組的效率。擴(kuò)增上下游同源臂的引物設(shè)計(jì)時(shí)，在引物的5'端分別添加合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以便后續(xù)的連接操作。將擴(kuò)增得到的上下游同源臂和篩選標(biāo)記基因（如潮霉素抗性基因hph）依次連接到pUC19載體上，構(gòu)建成基因敲除載體。連接過程使用T4DNA連接酶（NEB），按照說明書進(jìn)行操作。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保基因敲除載體構(gòu)建正確。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium-mediatedtransformation，AMT）將基因敲除載體導(dǎo)入綠僵菌中。將構(gòu)建好的基因敲除載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中，通過凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將含有基因敲除載體的農(nóng)桿菌EHA105接種于含相應(yīng)抗生素（如利福平、卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜，使農(nóng)桿菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集農(nóng)桿菌菌體，用IM液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整OD600值至0.5左右。將綠僵菌分生孢子懸浮液與農(nóng)桿菌菌液按1:1的比例混合，均勻涂布于鋪有硝酸纖維素膜的共培養(yǎng)平板（含AS的IM固體培養(yǎng)基）上，25℃共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含有潮霉素（50-100μg/mL）和頭孢噻肟鈉（200-300μg/mL）的篩選平板上，28℃培養(yǎng)5-7天，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取篩選平板上的轉(zhuǎn)化子，接種于含潮霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3-5天。提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，通過PCR和Southernblot雜交驗(yàn)證目的基因是否被敲除。PCR驗(yàn)證時(shí)，設(shè)計(jì)特異性引物，分別擴(kuò)增目的基因的敲除片段和野生型片段，通過電泳檢測(cè)條帶的大小來判斷目的基因是否被敲除。Southernblot雜交驗(yàn)證時(shí)，用合適的限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交條帶的位置和數(shù)量確定目的基因的敲除情況。為驗(yàn)證基因敲除菌株的表型變化是由目的基因缺失引起的，構(gòu)建基因回復(fù)載體并獲得回復(fù)菌株。以野生型綠僵菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含目的基因完整編碼區(qū)及其上下游一定長(zhǎng)度的調(diào)控序列的片段。將擴(kuò)增得到的片段連接到含有潮霉素抗性基因的pBC-hph載體上，構(gòu)建成基因回復(fù)載體。將基因回復(fù)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入基因敲除菌株中，篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR和Southernblot雜交驗(yàn)證目的基因是否成功回補(bǔ)。2.2.4脅迫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同的脅迫條件，包括高滲透壓脅迫、氧化應(yīng)激脅迫、熱激脅迫和紫外線照射脅迫，處理綠僵菌菌株，觀察其生長(zhǎng)、形態(tài)和生理指標(biāo)的變化。對(duì)于高滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)，將綠僵菌接種于含有不同濃度NaCl（0.5M、1.0M、1.5M）或山梨醇（0.8M、1.2M、1.6M）的PDA培養(yǎng)基平板上，以不含脅迫劑的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期測(cè)量菌落直徑，觀察菌落生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察7-10天，計(jì)算不同處理下綠僵菌的生長(zhǎng)速率，分析高滲透壓對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)的影響。在氧化應(yīng)激脅迫實(shí)驗(yàn)中，將綠僵菌接種于含有不同濃度過氧化氫（H?O?，1mM、5mM、10mM）或甲基紫精（MV，0.1mM、0.5mM、1.0mM）的PDA培養(yǎng)基平板上，以不含氧化應(yīng)激劑的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照。按照上述高滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)和觀察方法，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率，同時(shí)觀察菌落顏色、形態(tài)等變化，分析氧化應(yīng)激對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)和形態(tài)的影響。通過測(cè)定綠僵菌細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等，以及丙二醛（MDA）含量，評(píng)估氧化應(yīng)激對(duì)綠僵菌生理狀態(tài)的影響。熱激脅迫實(shí)驗(yàn)中，將綠僵菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，待菌落長(zhǎng)出后，將平板分別置于37℃、40℃、42℃的恒溫培養(yǎng)箱中處理不同時(shí)間（1h、2h、4h），然后轉(zhuǎn)移回28℃繼續(xù)培養(yǎng)。以未進(jìn)行熱激處理的平板為對(duì)照，觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率，分析熱激脅迫對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)的影響。通過觀察綠僵菌菌絲和分生孢子的形態(tài)變化，如菌絲斷裂、扭曲，分生孢子變形等，評(píng)估熱激脅迫對(duì)綠僵菌形態(tài)的影響。紫外線照射脅迫實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，將綠僵菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，待菌落長(zhǎng)出后，將平板置于紫外燈下，距離燈管30cm，分別照射不同時(shí)間（10min、20min、30min）。照射結(jié)束后，用錫箔紙包裹平板，避免再次受到光照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未進(jìn)行紫外線照射的平板為對(duì)照，觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率，分析紫外線照射對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)的影響。通過檢測(cè)綠僵菌分生孢子的萌發(fā)率，評(píng)估紫外線照射對(duì)綠僵菌繁殖能力的影響。2.2.5毒力測(cè)定實(shí)驗(yàn)以大蠟螟幼蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用體表接種和體內(nèi)注射兩種方法，測(cè)定不同綠僵菌菌株的毒力。體表接種實(shí)驗(yàn)中，將綠僵菌分生孢子懸浮液用無菌水稀釋成不同濃度（1×10^6個(gè)/mL、1×10^7個(gè)/mL、1×10^8個(gè)/mL）。選取健康、大小一致的大蠟螟幼蟲，每組10頭，共設(shè)3組，分別將不同濃度的分生孢子懸浮液10μL滴加在大蠟螟幼蟲的體表，對(duì)照組滴加等量的無菌水。將處理后的大蠟螟幼蟲置于塑料培養(yǎng)盒中，以新鮮的蜂蠟和花粉混合物為飼料，在溫度為（28±1）℃、相對(duì)濕度為（70±5）%的人工氣候箱中飼養(yǎng)。每天觀察并記錄大蠟螟幼蟲的死亡情況，連續(xù)觀察10-14天，計(jì)算不同濃度下綠僵菌對(duì)大蠟螟幼蟲的累計(jì)死亡率、校正死亡率，分析綠僵菌濃度與毒力的關(guān)系。體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)中，將綠僵菌分生孢子懸浮液稀釋成1×10^7個(gè)/mL的濃度。選取健康、大小一致的大蠟螟幼蟲，每組10頭，共設(shè)3組，用微量注射器將10μL的分生孢子懸浮液注射到大蠟螟幼蟲的腹部節(jié)間膜處，對(duì)照組注射等量的無菌水。注射后的大蠟螟幼蟲飼養(yǎng)條件同體表接種實(shí)驗(yàn)。每天觀察并記錄大蠟螟幼蟲的死亡情況，計(jì)算累計(jì)死亡率、校正死亡率，同時(shí)記錄大蠟螟幼蟲的發(fā)病癥狀，如體色變化、行動(dòng)遲緩、體表出現(xiàn)菌絲等，分析綠僵菌的侵染過程和致病機(jī)制。采用SPSS軟件對(duì)毒力測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算半致死濃度（LC50）和半致死時(shí)間（LT50），通過方差分析和顯著性檢驗(yàn)（如Duncan's新復(fù)極差法），比較不同綠僵菌菌株以及不同處理組之間的毒力差異，判斷差異是否顯著。2.2.6分子生物學(xué)分析通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因在不同脅迫條件下和侵染昆蟲過程中的表達(dá)水平變化。提取不同處理組綠僵菌的總RNA，使用RNA提取試劑盒（OMEGABio-Tek）按照說明書操作。用核酸蛋白分析儀（ThermoScientific）測(cè)定RNA的濃度和純度，要求RNA的OD260/OD280值在1.8-2.0之間，OD260/OD230值大于2.0。取1μg總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需保證引物的特異性，避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。引物的長(zhǎng)度一般為18-22個(gè)堿基，Tm值在58-62℃之間。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。使用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析不同處理組之間基因表達(dá)水平的差異。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)蛋白在不同脅迫條件下和侵染昆蟲過程中的表達(dá)水平和磷酸化水平變化。提取不同處理組綠僵菌的總蛋白，使用蛋白提取試劑盒（如碧云天生物技術(shù)有限公司的全蛋白提取試劑盒）按照說明書操作。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（ThermoScientific）測(cè)定蛋白濃度，使各樣本蛋白濃度一致。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳條件根據(jù)蛋白分子量大小進(jìn)行調(diào)整，一般采用8%-12%的分離膠。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白分子量和膜的類型進(jìn)行優(yōu)化。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（如抗MrHog1抗體、抗磷酸化MrHog1抗體、抗β-actin抗體），4℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2h。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL發(fā)光液）進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）曝光成像，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量和磷酸化水平，比較不同處理組之間蛋白表達(dá)和磷酸化水平的差異。2.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0軟件和GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行。對(duì)于生長(zhǎng)速率、毒力測(cè)定等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)滿足方差齊性，則采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析；若數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（如Kruskal-Wallis檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。對(duì)于基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，采用2^(-ΔΔCt)法或灰度值分析計(jì)算相對(duì)表達(dá)量后，進(jìn)行Student'st-test或方差分析，比較不同處理組之間的差異顯著性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以圖表形式呈現(xiàn)，使結(jié)果更加直觀。使用GraphPadPrism8.0軟件繪制柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等，展示不同處理組之間的差異和變化趨勢(shì)。在圖表中，明確標(biāo)注坐標(biāo)軸的含義、單位和圖例，確保圖表清晰易懂。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，得出科學(xué)準(zhǔn)確的結(jié)論，為研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌脅迫應(yīng)答和毒力調(diào)控中的作用提供有力支持。三、MAPK-MrHog1通路對(duì)綠僵菌脅迫應(yīng)答的調(diào)控3.1高滲透壓脅迫應(yīng)答高滲透壓是綠僵菌在自然環(huán)境中常面臨的脅迫之一，土壤中鹽分含量過高或昆蟲體表的滲透壓變化等，都會(huì)影響綠僵菌的生長(zhǎng)和侵染能力。在高滲透壓條件下，綠僵菌細(xì)胞會(huì)面臨失水的風(fēng)險(xiǎn)，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌應(yīng)對(duì)高滲透壓脅迫中的作用，有助于揭示綠僵菌適應(yīng)高滲環(huán)境的分子機(jī)制。將野生型綠僵菌、MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株和回復(fù)菌株分別接種于含有不同濃度NaCl（0.5M、1.0M、1.5M）或山梨醇（0.8M、1.2M、1.6M）的PDA培養(yǎng)基平板上，以不含脅迫劑的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期測(cè)量菌落直徑，觀察菌落生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察7-10天，計(jì)算不同處理下綠僵菌的生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，野生型、敲除菌株和回復(fù)菌株的生長(zhǎng)速率無顯著差異，均能正常生長(zhǎng)并形成完整的菌落。隨著NaCl或山梨醇濃度的升高，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1.0M時(shí)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)速率明顯下降，菌落直徑增長(zhǎng)緩慢；在1.5MNaCl濃度下，生長(zhǎng)抑制更為顯著。山梨醇濃度為1.2M時(shí)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)也受到明顯抑制。對(duì)于MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株，在高滲透壓條件下，其生長(zhǎng)受到的抑制作用更為嚴(yán)重。在0.5MNaCl濃度下，敲除菌株的生長(zhǎng)速率就顯著低于野生型，菌落直徑明顯小于野生型菌株。隨著NaCl濃度的進(jìn)一步升高，敲除菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，難以形成明顯的菌落。在山梨醇脅迫條件下，敲除菌株同樣表現(xiàn)出對(duì)高滲透壓的高度敏感，生長(zhǎng)受到極大限制?；貜?fù)菌株在高滲透壓條件下的生長(zhǎng)情況則介于野生型和敲除菌株之間。在較低濃度的NaCl或山梨醇脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)與野生型接近，能夠較好地適應(yīng)高滲環(huán)境；但在較高濃度的脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)也會(huì)受到一定程度的抑制，不過其生長(zhǎng)狀況仍明顯優(yōu)于敲除菌株。通過顯微鏡觀察不同菌株在高滲透壓脅迫下的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在低濃度脅迫下，菌絲形態(tài)基本正常，僅出現(xiàn)輕微的皺縮；隨著脅迫濃度的增加，菌絲變得粗細(xì)不均，分支減少，部分菌絲出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。敲除菌株在較低濃度脅迫下，菌絲就出現(xiàn)明顯的扭曲、變形，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化；在高濃度脅迫下，菌絲嚴(yán)重受損，大量斷裂，難以維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。回復(fù)菌株在低濃度脅迫下，菌絲形態(tài)與野生型相似，能夠保持相對(duì)完整；在高濃度脅迫下，雖然菌絲也會(huì)出現(xiàn)一定程度的變形和斷裂，但程度較輕，仍能維持一定的生長(zhǎng)和形態(tài)。進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因在高滲透壓脅迫下的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在受到高滲透壓刺激后，MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因，如MrHog1、MAPKKK和MAPKK等基因的表達(dá)量迅速上調(diào)。在0.5MNaCl處理30min后，MrHog1基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約2倍；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量持續(xù)上升，在處理1h后達(dá)到峰值，為未處理組的3.5倍。MAPKKK和MAPKK基因的表達(dá)也呈現(xiàn)類似的上調(diào)趨勢(shì)。敲除菌株由于相關(guān)基因被敲除，無法檢測(cè)到MrHog1等基因的表達(dá)。回復(fù)菌株在高滲透壓脅迫下，MrHog1等基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平，在0.5MNaCl處理1h后，MrHog1基因的表達(dá)量為野生型的80%左右。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)蛋白在高滲透壓脅迫下的表達(dá)水平和磷酸化水平變化，結(jié)果顯示野生型綠僵菌在高滲透壓刺激下，MrHog1蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明MrHog1蛋白被激活。在1.0MNaCl處理1h后，磷酸化MrHog1蛋白的條帶明顯增強(qiáng)，灰度值分析顯示其磷酸化水平相較于未處理組增加了2.5倍。敲除菌株中無法檢測(cè)到磷酸化MrHog1蛋白，回復(fù)菌株在高滲透壓脅迫下，MrHog1蛋白的磷酸化水平能夠恢復(fù)，與野生型的磷酸化水平接近。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在高滲透壓脅迫下，綠僵菌細(xì)胞膜上的滲透壓感受器感知到外界滲透壓的變化，將信號(hào)傳遞給MAPK-MrHog1通路中的MAPKKK。MAPKKK被激活后，磷酸化并激活MAPKK，進(jìn)而使MrHog1蛋白磷酸化激活。激活后的MrHog1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)甘油等相容性溶質(zhì)的合成相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)甘油含量升高，提高細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，防止細(xì)胞失水。激活后的MrHog1蛋白還可能調(diào)控細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)離子的平衡，穩(wěn)定細(xì)胞的生理功能。MAPK-MrHog1通路通過這一系列的調(diào)控機(jī)制，使綠僵菌能夠適應(yīng)高滲透壓環(huán)境，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。而敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，無法正常激活該通路，導(dǎo)致其在高滲透壓脅迫下無法有效調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞的滲透壓調(diào)節(jié)和離子平衡維持能力受損，從而使生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，形態(tài)結(jié)構(gòu)也遭到破壞。回復(fù)菌株由于恢復(fù)了MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因的表達(dá)，能夠部分恢復(fù)對(duì)高滲透壓脅迫的應(yīng)答能力，生長(zhǎng)和形態(tài)受抑制程度相對(duì)較輕。3.2氧化應(yīng)激脅迫應(yīng)答氧化應(yīng)激是綠僵菌在生長(zhǎng)、侵染和傳播過程中面臨的常見脅迫之一。在自然環(huán)境中，綠僵菌會(huì)受到紫外線輻射、宿主免疫防御產(chǎn)生的活性氧等因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥基自由基（?OH）等，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，過多的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激脅迫中的作用，對(duì)于揭示綠僵菌的抗氧化防御機(jī)制具有重要意義。將野生型綠僵菌、MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株和回復(fù)菌株分別接種于含有不同濃度過氧化氫（H?O?，1mM、5mM、10mM）或甲基紫精（MV，0.1mM、0.5mM、1.0mM）的PDA培養(yǎng)基平板上，以不含氧化應(yīng)激劑的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期測(cè)量菌落直徑，觀察菌落生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察7-10天，計(jì)算不同處理下綠僵菌的生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，野生型、敲除菌株和回復(fù)菌株的生長(zhǎng)速率無顯著差異。隨著過氧化氫或甲基紫精濃度的升高，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到5mM時(shí)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)速率明顯下降，菌落直徑增長(zhǎng)緩慢；在10mM過氧化氫濃度下，生長(zhǎng)抑制更為顯著。甲基紫精濃度為0.5mM時(shí)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)也受到明顯抑制。MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株在氧化應(yīng)激條件下，生長(zhǎng)受到的抑制作用更為嚴(yán)重。在1mM過氧化氫濃度下，敲除菌株的生長(zhǎng)速率就顯著低于野生型，菌落直徑明顯小于野生型菌株。隨著過氧化氫濃度的進(jìn)一步升高，敲除菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，難以形成明顯的菌落。在甲基紫精脅迫條件下，敲除菌株同樣表現(xiàn)出對(duì)氧化應(yīng)激的高度敏感，生長(zhǎng)受到極大限制。回復(fù)菌株在氧化應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)情況介于野生型和敲除菌株之間。在較低濃度的過氧化氫或甲基紫精脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)與野生型接近，能夠較好地適應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境；但在較高濃度的脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)也會(huì)受到一定程度的抑制，不過其生長(zhǎng)狀況仍明顯優(yōu)于敲除菌株。通過顯微鏡觀察不同菌株在氧化應(yīng)激脅迫下的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在低濃度脅迫下，菌絲形態(tài)基本正常，僅出現(xiàn)輕微的扭曲；隨著脅迫濃度的增加，菌絲變得粗細(xì)不均，分支減少，部分菌絲出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，分生孢子的形態(tài)也發(fā)生改變，出現(xiàn)變形、皺縮等情況。敲除菌株在較低濃度脅迫下，菌絲就出現(xiàn)明顯的扭曲、變形，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，分生孢子大量變形、破裂；在高濃度脅迫下，菌絲嚴(yán)重受損，大量斷裂，難以維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。回復(fù)菌株在低濃度脅迫下，菌絲形態(tài)與野生型相似，能夠保持相對(duì)完整；在高濃度脅迫下，雖然菌絲也會(huì)出現(xiàn)一定程度的變形和斷裂，但程度較輕，仍能維持一定的生長(zhǎng)和形態(tài)。為了進(jìn)一步探究綠僵菌在氧化應(yīng)激脅迫下的生理變化，測(cè)定了綠僵菌細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等，以及丙二醛（MDA）含量。結(jié)果顯示，野生型綠僵菌在受到氧化應(yīng)激刺激后，SOD、CAT和POD的活性均顯著升高。在5mM過氧化氫處理1h后，SOD活性相較于未處理組增加了約1.5倍，CAT活性增加了1.2倍，POD活性增加了1.3倍。MDA含量則隨著氧化應(yīng)激程度的增加而升高，在10mM過氧化氫處理下，MDA含量為未處理組的2倍。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在氧化應(yīng)激條件下，SOD、CAT和POD的活性升高幅度明顯低于野生型。在5mM過氧化氫處理1h后，敲除菌株的SOD活性僅為野生型的60%，CAT活性為野生型的50%，POD活性為野生型的55%。MDA含量則顯著高于野生型，在10mM過氧化氫處理下，敲除菌株的MDA含量為野生型的1.5倍。回復(fù)菌株在氧化應(yīng)激脅迫下，SOD、CAT和POD的活性能夠恢復(fù)到接近野生型的水平。在5mM過氧化氫處理1h后，回復(fù)菌株的SOD活性為野生型的85%，CAT活性為野生型的80%，POD活性為野生型的82%。MDA含量也明顯低于敲除菌株，與野生型接近。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因在氧化應(yīng)激脅迫下的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在受到氧化應(yīng)激刺激后，MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因，如MrHog1、MAPKKK和MAPKK等基因的表達(dá)量迅速上調(diào)。在1mM過氧化氫處理30min后，MrHog1基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約1.8倍；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量持續(xù)上升，在處理1h后達(dá)到峰值，為未處理組的2.5倍。MAPKKK和MAPKK基因的表達(dá)也呈現(xiàn)類似的上調(diào)趨勢(shì)。敲除菌株由于相關(guān)基因被敲除，無法檢測(cè)到MrHog1等基因的表達(dá)?；貜?fù)菌株在氧化應(yīng)激脅迫下，MrHog1等基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平，在1mM過氧化氫處理1h后，MrHog1基因的表達(dá)量為野生型的80%左右。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)蛋白在氧化應(yīng)激脅迫下的表達(dá)水平和磷酸化水平變化，結(jié)果顯示野生型綠僵菌在氧化應(yīng)激刺激下，MrHog1蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明MrHog1蛋白被激活。在5mM過氧化氫處理1h后，磷酸化MrHog1蛋白的條帶明顯增強(qiáng)，灰度值分析顯示其磷酸化水平相較于未處理組增加了2.2倍。敲除菌株中無法檢測(cè)到磷酸化MrHog1蛋白，回復(fù)菌株在氧化應(yīng)激脅迫下，MrHog1蛋白的磷酸化水平能夠恢復(fù)，與野生型的磷酸化水平接近。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在氧化應(yīng)激脅迫下，綠僵菌細(xì)胞膜上的氧化應(yīng)激感受器感知到細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，將信號(hào)傳遞給MAPK-MrHog1通路中的MAPKKK。MAPKKK被激活后，磷酸化并激活MAPKK，進(jìn)而使MrHog1蛋白磷酸化激活。激活后的MrHog1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。一方面，激活后的MrHog1蛋白促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，如SOD、CAT和POD等基因，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性升高，增強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，減少氧化損傷。另一方面，MrHog1蛋白可能調(diào)控其他抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，如參與谷胱甘肽代謝、硫氧還蛋白系統(tǒng)等抗氧化途徑的基因，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。MAPK-MrHog1通路通過這一系列的調(diào)控機(jī)制，使綠僵菌能夠有效應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激脅迫，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。而敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，無法正常激活該通路，導(dǎo)致其在氧化應(yīng)激脅迫下無法有效調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞的抗氧化防御能力受損，從而使生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，形態(tài)結(jié)構(gòu)也遭到破壞?；貜?fù)菌株由于恢復(fù)了MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因的表達(dá)，能夠部分恢復(fù)對(duì)氧化應(yīng)激脅迫的應(yīng)答能力，生長(zhǎng)和形態(tài)受抑制程度相對(duì)較輕。3.3熱激脅迫應(yīng)答在自然環(huán)境中，綠僵菌常面臨溫度波動(dòng)的挑戰(zhàn)，尤其是高溫脅迫，如夏季高溫時(shí)段或在陽光直射的環(huán)境下，溫度可能會(huì)超出綠僵菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍，對(duì)其生存和生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌應(yīng)對(duì)熱激脅迫中的作用，有助于揭示綠僵菌適應(yīng)高溫環(huán)境的分子機(jī)制，為提高綠僵菌在高溫條件下的生物防治效果提供理論依據(jù)。將野生型綠僵菌、MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株和回復(fù)菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，待菌落長(zhǎng)出后，將平板分別置于37℃、40℃、42℃的恒溫培養(yǎng)箱中處理不同時(shí)間（1h、2h、4h），然后轉(zhuǎn)移回28℃繼續(xù)培養(yǎng)，以未進(jìn)行熱激處理的平板為對(duì)照。定期測(cè)量菌落直徑，觀察菌落生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察7-10天，計(jì)算不同處理下綠僵菌的生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，野生型、敲除菌株和回復(fù)菌株的生長(zhǎng)速率無顯著差異。隨著熱激溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)熱激溫度達(dá)到40℃，處理2h后，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)速率明顯下降，菌落直徑增長(zhǎng)緩慢；在42℃熱激處理4h后，生長(zhǎng)抑制更為顯著。MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株在熱激脅迫下，生長(zhǎng)受到的抑制作用更為嚴(yán)重。在37℃熱激處理1h后，敲除菌株的生長(zhǎng)速率就顯著低于野生型，菌落直徑明顯小于野生型菌株。隨著熱激溫度的進(jìn)一步升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，敲除菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，難以形成明顯的菌落?；貜?fù)菌株在熱激脅迫下的生長(zhǎng)情況介于野生型和敲除菌株之間。在較低溫度（37℃）和較短時(shí)間（1h）的熱激處理下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)與野生型接近，能夠較好地適應(yīng)熱激環(huán)境；但在較高溫度（42℃）和較長(zhǎng)時(shí)間（4h）的脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)也會(huì)受到一定程度的抑制，不過其生長(zhǎng)狀況仍明顯優(yōu)于敲除菌株。通過顯微鏡觀察不同菌株在熱激脅迫下的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在低強(qiáng)度熱激（37℃，1h）下，菌絲形態(tài)基本正常，僅出現(xiàn)輕微的扭曲；隨著熱激強(qiáng)度的增加，菌絲變得粗細(xì)不均，分支減少，部分菌絲出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，分生孢子的形態(tài)也發(fā)生改變，出現(xiàn)變形、皺縮等情況。敲除菌株在較低強(qiáng)度熱激下，菌絲就出現(xiàn)明顯的扭曲、變形，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，分生孢子大量變形、破裂；在高強(qiáng)度熱激下，菌絲嚴(yán)重受損，大量斷裂，難以維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)?；貜?fù)菌株在低強(qiáng)度熱激下，菌絲形態(tài)與野生型相似，能夠保持相對(duì)完整；在高強(qiáng)度熱激下，雖然菌絲也會(huì)出現(xiàn)一定程度的變形和斷裂，但程度較輕，仍能維持一定的生長(zhǎng)和形態(tài)。為了進(jìn)一步探究綠僵菌在熱激脅迫下的生理變化，檢測(cè)了綠僵菌分生孢子的萌發(fā)率。結(jié)果顯示，野生型綠僵菌在受到熱激脅迫后，分生孢子萌發(fā)率隨熱激強(qiáng)度的增加而降低。在40℃熱激處理2h后，分生孢子萌發(fā)率相較于未處理組降低了約30%；在42℃熱激處理4h后，分生孢子萌發(fā)率僅為未處理組的20%。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在熱激脅迫下，分生孢子萌發(fā)率降低幅度明顯高于野生型。在40℃熱激處理2h后，敲除菌株的分生孢子萌發(fā)率僅為野生型的40%；在42℃熱激處理4h后，敲除菌株的分生孢子萌發(fā)率幾乎為0。回復(fù)菌株在熱激脅迫下，分生孢子萌發(fā)率能夠恢復(fù)到接近野生型的水平。在40℃熱激處理2h后，回復(fù)菌株的分生孢子萌發(fā)率為野生型的85%；在42℃熱激處理4h后，回復(fù)菌株的分生孢子萌發(fā)率為野生型的30%，明顯高于敲除菌株。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因在熱激脅迫下的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在受到熱激刺激后，MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因，如MrHog1、MAPKKK和MAPKK等基因的表達(dá)量迅速上調(diào)。在40℃熱激處理30min后，MrHog1基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約2.2倍；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量持續(xù)上升，在處理1h后達(dá)到峰值，為未處理組的3倍。MAPKKK和MAPKK基因的表達(dá)也呈現(xiàn)類似的上調(diào)趨勢(shì)。敲除菌株由于相關(guān)基因被敲除，無法檢測(cè)到MrHog1等基因的表達(dá)?；貜?fù)菌株在熱激脅迫下，MrHog1等基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平，在40℃熱激處理1h后，MrHog1基因的表達(dá)量為野生型的80%左右。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)蛋白在熱激脅迫下的表達(dá)水平和磷酸化水平變化，結(jié)果顯示野生型綠僵菌在熱激刺激下，MrHog1蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明MrHog1蛋白被激活。在40℃熱激處理1h后，磷酸化MrHog1蛋白的條帶明顯增強(qiáng)，灰度值分析顯示其磷酸化水平相較于未處理組增加了2.3倍。敲除菌株中無法檢測(cè)到磷酸化MrHog1蛋白，回復(fù)菌株在熱激脅迫下，MrHog1蛋白的磷酸化水平能夠恢復(fù)，與野生型的磷酸化水平接近。熱激蛋白（HeatShockProtein，HSP）在細(xì)胞應(yīng)對(duì)熱激脅迫中發(fā)揮著重要作用，它們能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊、防止蛋白質(zhì)聚集，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。進(jìn)一步通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)熱激蛋白基因在熱激脅迫下的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在受到熱激刺激后，熱激蛋白基因HSP70、HSP90等的表達(dá)量顯著上調(diào)。在40℃熱激處理1h后，HSP70基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約2.5倍，HSP90基因的表達(dá)量增加了2.2倍。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在熱激脅迫下，熱激蛋白基因的表達(dá)上調(diào)幅度明顯低于野生型。在40℃熱激處理1h后，敲除菌株的HSP70基因表達(dá)量?jī)H為野生型的50%，HSP90基因表達(dá)量為野生型的45%。回復(fù)菌株在熱激脅迫下，熱激蛋白基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平。在40℃熱激處理1h后，回復(fù)菌株的HSP70基因表達(dá)量為野生型的80%，HSP90基因表達(dá)量為野生型的75%。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在熱激脅迫下，綠僵菌細(xì)胞膜上可能存在熱激感受器，感知到溫度的升高后，將信號(hào)傳遞給MAPK-MrHog1通路中的MAPKKK。MAPKKK被激活后，磷酸化并激活MAPKK，進(jìn)而使MrHog1蛋白磷酸化激活。激活后的MrHog1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。一方面，激活后的MrHog1蛋白促進(jìn)熱激蛋白基因的表達(dá)，如HSP70、HSP90等基因，使細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白含量升高，幫助蛋白質(zhì)正確折疊，防止蛋白質(zhì)聚集，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能，維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。另一方面，MrHog1蛋白可能調(diào)控其他與熱激脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，如參與能量代謝、抗氧化防御等途徑的基因，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)對(duì)熱激脅迫的能力。MAPK-MrHog1通路通過這一系列的調(diào)控機(jī)制，使綠僵菌能夠有效應(yīng)對(duì)熱激脅迫，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。而敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，無法正常激活該通路，導(dǎo)致其在熱激脅迫下無法有效調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞應(yīng)對(duì)熱激脅迫的能力受損，從而使生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，形態(tài)結(jié)構(gòu)也遭到破壞，分生孢子萌發(fā)率顯著降低。回復(fù)菌株由于恢復(fù)了MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因的表達(dá)，能夠部分恢復(fù)對(duì)熱激脅迫的應(yīng)答能力，生長(zhǎng)和形態(tài)受抑制程度相對(duì)較輕，分生孢子萌發(fā)率也能維持在相對(duì)較高的水平。3.4紫外線脅迫應(yīng)答紫外線是綠僵菌在自然環(huán)境中面臨的重要脅迫因素之一，尤其是在戶外應(yīng)用時(shí)，陽光中的紫外線輻射會(huì)對(duì)綠僵菌的活性和生存能力產(chǎn)生顯著影響。紫外線能夠直接作用于綠僵菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致DNA損傷、基因突變以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而影響綠僵菌的生長(zhǎng)、繁殖和侵染能力。研究MAPK-MrHog1通路在綠僵菌應(yīng)對(duì)紫外線脅迫中的作用，對(duì)于揭示綠僵菌的抗紫外線機(jī)制，提高其在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性和防治效果具有重要意義。將野生型綠僵菌、MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株和回復(fù)菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，待菌落長(zhǎng)出后，將平板置于紫外燈下，距離燈管30cm，分別照射不同時(shí)間（10min、20min、30min）。照射結(jié)束后，用錫箔紙包裹平板，避免再次受到光照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未進(jìn)行紫外線照射的平板為對(duì)照，定期測(cè)量菌落直徑，觀察菌落生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察7-10天，計(jì)算不同處理下綠僵菌的生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，野生型、敲除菌株和回復(fù)菌株的生長(zhǎng)速率無顯著差異。隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)紫外線照射時(shí)間達(dá)到20min時(shí)，野生型綠僵菌的生長(zhǎng)速率明顯下降，菌落直徑增長(zhǎng)緩慢；在照射30min后，生長(zhǎng)抑制更為顯著。MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因敲除菌株在紫外線脅迫下，生長(zhǎng)受到的抑制作用更為嚴(yán)重。在紫外線照射10min后，敲除菌株的生長(zhǎng)速率就顯著低于野生型，菌落直徑明顯小于野生型菌株。隨著照射時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，敲除菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，難以形成明顯的菌落?；貜?fù)菌株在紫外線脅迫下的生長(zhǎng)情況介于野生型和敲除菌株之間。在較短時(shí)間（10min）的紫外線照射下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)與野生型接近，能夠較好地適應(yīng)紫外線環(huán)境；但在較長(zhǎng)時(shí)間（30min）的脅迫下，回復(fù)菌株的生長(zhǎng)也會(huì)受到一定程度的抑制，不過其生長(zhǎng)狀況仍明顯優(yōu)于敲除菌株。通過顯微鏡觀察不同菌株在紫外線脅迫下的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在低強(qiáng)度紫外線照射（10min）下，菌絲形態(tài)基本正常，僅出現(xiàn)輕微的扭曲；隨著照射強(qiáng)度的增加，菌絲變得粗細(xì)不均，分支減少，部分菌絲出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，分生孢子的形態(tài)也發(fā)生改變，出現(xiàn)變形、皺縮等情況。敲除菌株在較低強(qiáng)度紫外線照射下，菌絲就出現(xiàn)明顯的扭曲、變形，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，分生孢子大量變形、破裂；在高強(qiáng)度紫外線照射下，菌絲嚴(yán)重受損，大量斷裂，難以維持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。回復(fù)菌株在低強(qiáng)度紫外線照射下，菌絲形態(tài)與野生型相似，能夠保持相對(duì)完整；在高強(qiáng)度紫外線照射下，雖然菌絲也會(huì)出現(xiàn)一定程度的變形和斷裂，但程度較輕，仍能維持一定的生長(zhǎng)和形態(tài)。為了進(jìn)一步探究綠僵菌在紫外線脅迫下的生理變化，檢測(cè)了綠僵菌分生孢子的萌發(fā)率。結(jié)果顯示，野生型綠僵菌在受到紫外線脅迫后，分生孢子萌發(fā)率隨紫外線照射時(shí)間的增加而降低。在紫外線照射20min后，分生孢子萌發(fā)率相較于未處理組降低了約40%；在照射30min后，分生孢子萌發(fā)率僅為未處理組的15%。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在紫外線脅迫下，分生孢子萌發(fā)率降低幅度明顯高于野生型。在紫外線照射20min后，敲除菌株的分生孢子萌發(fā)率僅為野生型的30%；在照射30min后，敲除菌株的分生孢子萌發(fā)率幾乎為0?；貜?fù)菌株在紫外線脅迫下，分生孢子萌發(fā)率能夠恢復(fù)到接近野生型的水平。在紫外線照射20min后，回復(fù)菌株的分生孢子萌發(fā)率為野生型的80%；在照射30min后，回復(fù)菌株的分生孢子萌發(fā)率為野生型的25%，明顯高于敲除菌株。紫外線照射會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，為了檢測(cè)綠僵菌在紫外線脅迫下的DNA損傷修復(fù)能力，采用彗星實(shí)驗(yàn)（Cometassay）對(duì)不同菌株的DNA損傷程度進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，野生型綠僵菌在紫外線照射后，DNA損傷程度隨照射時(shí)間的增加而加重，但在照射后一定時(shí)間內(nèi)，能夠啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使DNA損傷程度逐漸降低。在紫外線照射20min后，野生型綠僵菌的DNA損傷尾長(zhǎng)相較于未處理組增加了約2倍，但在修復(fù)2h后，尾長(zhǎng)縮短了約50%。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在紫外線照射后，DNA損傷程度明顯高于野生型，且修復(fù)能力較弱。在紫外線照射20min后，敲除菌株的DNA損傷尾長(zhǎng)為野生型的1.5倍，且在修復(fù)2h后，尾長(zhǎng)僅縮短了約20%?；貜?fù)菌株在紫外線脅迫下，DNA損傷程度和修復(fù)能力與野生型接近。在紫外線照射20min后，回復(fù)菌株的DNA損傷尾長(zhǎng)與野生型相似，在修復(fù)2h后，尾長(zhǎng)縮短程度也與野生型相近。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因在紫外線脅迫下的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)野生型綠僵菌在受到紫外線刺激后，MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因，如MrHog1、MAPKKK和MAPKK等基因的表達(dá)量迅速上調(diào)。在紫外線照射10min后，MrHog1基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約2倍；隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量持續(xù)上升，在照射30min后達(dá)到峰值，為未處理組的3.2倍。MAPKKK和MAPKK基因的表達(dá)也呈現(xiàn)類似的上調(diào)趨勢(shì)。敲除菌株由于相關(guān)基因被敲除，無法檢測(cè)到MrHog1等基因的表達(dá)。回復(fù)菌株在紫外線脅迫下，MrHog1等基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平，在紫外線照射30min后，MrHog1基因的表達(dá)量為野生型的80%左右。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)MAPK-MrHog1通路相關(guān)蛋白在紫外線脅迫下的表達(dá)水平和磷酸化水平變化，結(jié)果顯示野生型綠僵菌在紫外線刺激下，MrHog1蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明MrHog1蛋白被激活。在紫外線照射30min后，磷酸化MrHog1蛋白的條帶明顯增強(qiáng)，灰度值分析顯示其磷酸化水平相較于未處理組增加了2.4倍。敲除菌株中無法檢測(cè)到磷酸化MrHog1蛋白，回復(fù)菌株在紫外線脅迫下，MrHog1蛋白的磷酸化水平能夠恢復(fù)，與野生型的磷酸化水平接近。DNA損傷修復(fù)基因在綠僵菌應(yīng)對(duì)紫外線脅迫中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)一步通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)DNA損傷修復(fù)基因，如Rad51、Rad52等在紫外線脅迫下的表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，野生型綠僵菌在受到紫外線刺激后，DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。在紫外線照射30min后，Rad51基因的表達(dá)量相較于未處理組增加了約2.8倍，Rad52基因的表達(dá)量增加了2.5倍。敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，在紫外線脅迫下，DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)上調(diào)幅度明顯低于野生型。在紫外線照射30min后，敲除菌株的Rad51基因表達(dá)量?jī)H為野生型的40%，Rad52基因表達(dá)量為野生型的35%?；貜?fù)菌株在紫外線脅迫下，DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)能夠恢復(fù)到接近野生型的水平。在紫外線照射30min后，回復(fù)菌株的Rad51基因表達(dá)量為野生型的85%，Rad52基因表達(dá)量為野生型的80%。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在紫外線脅迫下，綠僵菌細(xì)胞膜上可能存在紫外線感受器，感知到紫外線照射后，將信號(hào)傳遞給MAPK-MrHog1通路中的MAPKKK。MAPKKK被激活后，磷酸化并激活MAPKK，進(jìn)而使MrHog1蛋白磷酸化激活。激活后的MrHog1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。一方面，激活后的MrHog1蛋白促進(jìn)DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)，如Rad51、Rad52等基因，使細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)酶含量升高，增強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)受損DNA的能力，減少紫外線對(duì)DNA的損傷。另一方面，MrHog1蛋白可能調(diào)控其他與紫外線脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，如參與抗氧化防御、細(xì)胞周期調(diào)控等途徑的基因，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)對(duì)紫外線脅迫的能力。MAPK-MrHog1通路通過這一系列的調(diào)控機(jī)制，使綠僵菌能夠有效應(yīng)對(duì)紫外線脅迫，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。而敲除菌株由于MAPK-MrHog1通路被破壞，無法正常激活該通路，導(dǎo)致其在紫外線脅迫下無法有效調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞應(yīng)對(duì)紫外線脅迫的能力受損，從而使生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，形態(tài)結(jié)構(gòu)也遭到破壞，分生孢子萌發(fā)率顯著降低，DNA損傷修復(fù)能力減弱?；貜?fù)菌株由于恢復(fù)了MAPK-MrHog1通路相關(guān)基因的表達(dá)，能夠部分恢復(fù)對(duì)紫外線脅迫的應(yīng)答能力，生長(zhǎng)和形態(tài)受抑制程度相對(duì)較輕，分生孢子萌發(fā)率也能維持在相對(duì)較高的水平，DNA損傷修復(fù)能力也能恢復(fù)到接近野生型的水平。四、MAPK-MrHog1通路對(duì)綠僵菌毒力的影響4.1體壁穿透階段體壁穿透是綠僵菌侵染昆蟲的關(guān)鍵起始步驟，其過程受到多種因素的精