miR-184：解鎖神經(jīng)膠質(zhì)瘤奧秘的關(guān)鍵分子一、引言1.1研究背景1.1.1神經(jīng)膠質(zhì)瘤的現(xiàn)狀神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，占所有原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的32%，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性腫瘤的81%。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)，每年每10萬(wàn)人中約有5-8人被診斷為惡性膠質(zhì)瘤。在我國(guó)，雖然缺乏大規(guī)模的全國(guó)性流行病學(xué)調(diào)查，但部分地區(qū)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率也不容小覷。男性發(fā)病率明顯多于女性，發(fā)病高峰為10-20歲以及30-40歲。神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有高度的異質(zhì)性和侵襲性，治療難度極大，預(yù)后極差。低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)）患者經(jīng)過(guò)手術(shù)、放療和化療等綜合治療后，5年生存率約為50%-80%，但仍有部分患者會(huì)復(fù)發(fā)并進(jìn)展為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ-Ⅳ級(jí)），如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，患者的中位生存期僅為12-15個(gè)月，5年生存率低于5%，在全身腫瘤中，其5年死亡率僅次于胰腺癌和肺癌，排在第三位。我國(guó)2015年惡性腫瘤流行分析中指出中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在惡性腫瘤死亡率排行中位列第8。從病理類(lèi)型來(lái)看，兒童患者以髓母細(xì)胞瘤和室管膜瘤多見(jiàn)。目前，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要治療手段包括手術(shù)切除、放療和化療。手術(shù)切除是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)，但由于腫瘤與正常腦組織邊界不清，難以完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。放療和化療雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織造成損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，且腫瘤細(xì)胞容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，是當(dāng)前神經(jīng)腫瘤領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。1.1.2microRNA概述microRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它廣泛存在于真核生物中，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA的調(diào)控機(jī)制主要包括兩種方式：一是當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解；二是當(dāng)miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，從而減少蛋白質(zhì)的合成。單個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，反之，單個(gè)基因也可以受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自1993年首個(gè)miRNA（lin-4）在線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，越來(lái)越多的miRNA被鑒定出來(lái)。如今，人類(lèi)基因組中已編碼超過(guò)1000個(gè)miRNA。研究表明，miRNA的表達(dá)失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。例如，某些miRNA（如miR-21）的表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮癌基因的作用；而另一些miRNA（如let-7家族）的表達(dá)下調(diào)，則會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)失控，抑制腫瘤細(xì)胞的分化，起到抑癌基因的作用。miRNA在腫瘤中的異常表達(dá)使其成為腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估和治療的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織或體液中特定miRNA的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷；同時(shí)，針對(duì)異常表達(dá)的miRNA進(jìn)行干預(yù)，如使用miRNA模擬物或抑制劑，可能為腫瘤的治療提供新的策略。1.2miR-184研究現(xiàn)狀近年來(lái)，miR-184在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸成為熱點(diǎn)，其在多種腫瘤中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制被不斷揭示。在甲狀腺乳頭狀癌中，研究發(fā)現(xiàn)患者血清外泌體中miR-184呈高表達(dá)，對(duì)其診斷敏感性及特異性較高，有望成為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷生物學(xué)標(biāo)志物。在乳腺癌方面，相關(guān)研究表明miR-184能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力。在肝癌的研究中，雖然目前miR-184與肝癌的關(guān)系研究相對(duì)較少，但已有研究提示其可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中，miR-184同樣受到了關(guān)注。已有研究表明，miR-184在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者組織樣品中水平非常低，且其表達(dá)失調(diào)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)。弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)梅西癌癥中心和分子醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家們確定了miR-184和促癌基因SND1之間存在相互作用。通過(guò)各種臨床前實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-184表達(dá)的增加能減緩神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，其機(jī)制為直接調(diào)節(jié)SND1。此外，SND1水平降低會(huì)導(dǎo)致STAT3的水平降低，而STAT3是促進(jìn)最致命腦癌（如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）特性的基因。另有研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用miR-184模擬物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞可抑制侵襲、抑制菌落形成并減少軟瓊脂中與錨定無(wú)關(guān)的生長(zhǎng)，當(dāng)用siRNA敲除SND1時(shí)也出現(xiàn)了相似的表型，且敲低SND1還誘導(dǎo)了衰老并改善了惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化學(xué)耐藥性。在原位異種移植模型中，敲低SND1或轉(zhuǎn)染miR-184模擬物誘導(dǎo)了侵襲性較小的腫瘤表型，并顯著提高了荷瘤小鼠的存活率。還有研究表明miR-184可以通過(guò)上調(diào)p53和p21的表達(dá)以及caspase-3/8的活性，抑制SND1、MMP-2/9、CD44的表達(dá)和AKT/NF-κB途徑的活性，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，阻滯細(xì)胞周期和黏附。然而，目前關(guān)于miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究仍存在一些不足。一方面，雖然已明確miR-184與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制尚未完全闡明，仍有許多與miR-184相互作用的基因和信號(hào)通路有待進(jìn)一步挖掘。另一方面，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療中的應(yīng)用研究還相對(duì)較少，如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，開(kāi)發(fā)以miR-184為靶點(diǎn)的治療方法，仍需要更多的探索和驗(yàn)證。此外，不同研究之間對(duì)于miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式和作用機(jī)制的結(jié)論存在一定差異，這可能與研究樣本、實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān)，需要進(jìn)一步的大樣本、多中心研究來(lái)統(tǒng)一和明確。本文旨在進(jìn)一步深入研究miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并深入解析其作用的分子機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。1.3研究目的和意義1.3.1研究目的本研究旨在深入探究miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況：通過(guò)收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的組織樣本以及對(duì)應(yīng)的正常腦組織樣本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、原位雜交等技術(shù)，精確檢測(cè)miR-184的表達(dá)水平，分析其在不同病理分級(jí)、不同臨床分期神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異，明確miR-184的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。揭示miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：在體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法，構(gòu)建miR-184過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過(guò)MTT法、EdU染色法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；采用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞周期分布的變化；通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞黏附能力的差異，全面揭示miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、遷移和黏附等生物學(xué)行為的影響。解析miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制：借助生物信息學(xué)分析工具，預(yù)測(cè)miR-184的潛在靶基因。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-184與靶基因之間的直接相互作用關(guān)系。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、免疫組化等技術(shù)檢測(cè)靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變化。通過(guò)基因敲低、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)手段，在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因在miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用，深入解析miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。評(píng)估m(xù)iR-184作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的可行性：建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，如裸鼠原位移植瘤模型，通過(guò)瘤內(nèi)注射、尾靜脈注射等方式給予miR-184模擬物、抑制劑或靶向載體，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況、體積變化、重量差異等，評(píng)估m(xù)iR-184對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。檢測(cè)動(dòng)物的生存期、生存質(zhì)量等指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)miR-184作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的可行性和潛在應(yīng)用價(jià)值。1.3.2研究意義本研究對(duì)miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制展開(kāi)深入探究，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論意義層面來(lái)看，盡管目前已發(fā)現(xiàn)miR-184與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，但其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制仍未被完全揭示。本研究通過(guò)系統(tǒng)地研究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并深入解析其作用的分子機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)。這將進(jìn)一步豐富我們對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。在臨床應(yīng)用價(jià)值方面，由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的高侵襲性、高復(fù)發(fā)率和對(duì)現(xiàn)有治療手段的低敏感性，患者的預(yù)后情況一直較差。本研究若能明確miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制，將為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供全新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。一方面，miR-184有可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)miR-184的表達(dá)水平，可實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷，以及對(duì)患者預(yù)后情況的準(zhǔn)確判斷，從而為臨床治療方案的制定提供重要參考。另一方面，以miR-184為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的治療方法，如設(shè)計(jì)特異性的miR-184模擬物或抑制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-184的表達(dá)水平來(lái)干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，有望為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者帶來(lái)更有效的治療手段，提高患者的生存率和生存質(zhì)量。二、miR-184與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)性分析2.1miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征2.1.1不同病理分級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-184的表達(dá)差異為了深入了解miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)規(guī)律，本研究收集了大量不同病理分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本。依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將樣本分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)）和高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ-Ⅳ級(jí)）。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精確檢測(cè)每個(gè)樣本中miR-184的表達(dá)水平，并以正常腦組織樣本作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常腦組織中，miR-184呈現(xiàn)出相對(duì)較高的表達(dá)水平。而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，miR-184的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且這種下調(diào)趨勢(shì)與腫瘤的病理分級(jí)密切相關(guān)。具體而言，低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中miR-184的表達(dá)水平雖低于正常腦組織，但相對(duì)高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織仍較高。隨著腫瘤病理分級(jí)的升高，從WHOⅠ級(jí)到WHOⅣ級(jí)，miR-184的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同病理分級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-184表達(dá)水平的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，miR-184的低表達(dá)可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的降低可能與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖和侵襲能力的增強(qiáng)密切相關(guān)。較低的miR-184表達(dá)可能導(dǎo)致其對(duì)下游靶基因的調(diào)控失衡，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。2.1.2miR-184表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的關(guān)系為了探究miR-184表達(dá)水平對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的影響，本研究對(duì)收集到的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床資料進(jìn)行了詳細(xì)整理和分析。根據(jù)患者腫瘤組織中miR-184的表達(dá)水平，將患者分為miR-184高表達(dá)組和miR-184低表達(dá)組。運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析兩組患者的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）。生存分析結(jié)果顯示，miR-184高表達(dá)組患者的總生存期和無(wú)病生存期均顯著長(zhǎng)于miR-184低表達(dá)組患者。通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，兩組患者生存曲線的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果表明miR-184表達(dá)水平是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總生存期和無(wú)病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素（P<0.05）。這意味著，無(wú)論其他臨床病理因素如何，miR-184的表達(dá)水平都能獨(dú)立地對(duì)患者的生存預(yù)后產(chǎn)生影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR-184表達(dá)水平與患者的Karnofsky評(píng)分（KPS）、復(fù)發(fā)時(shí)間等臨床指標(biāo)密切相關(guān)。miR-184低表達(dá)的患者KPS評(píng)分較低，復(fù)發(fā)時(shí)間更早，提示其病情更為嚴(yán)重，預(yù)后更差。這些結(jié)果充分表明，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存預(yù)后中起著關(guān)鍵作用，可作為評(píng)估神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物，為臨床治療方案的制定和患者的個(gè)體化治療提供重要參考依據(jù)。2.2miR-184與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)基因的相互作用2.2.1miR-184與促癌基因SND1的相互作用在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-184與促癌基因SND1之間存在著緊密且關(guān)鍵的相互作用。SND1，全稱(chēng)葡萄球菌核酸酶和tudor結(jié)構(gòu)域1（staphylococcalnucleaseandtudordomaincontaining1），是一種多功能蛋白，在多種癌癥的發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和肝癌等，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，SND1也呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，科研人員發(fā)現(xiàn)miR-184的種子序列與SND1基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，這強(qiáng)烈暗示了兩者之間可能存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員精心構(gòu)建了包含SND1基因3'UTR野生型序列以及突變型序列（突變miR-184結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這些載體分別與miR-184模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，miR-184模擬物能夠顯著降低野生型SND13'UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果確鑿地證實(shí)了miR-184可以直接作用于SND1基因的3'UTR，從而抑制其表達(dá)。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)研究人員使用miR-184模擬物轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，驚喜地發(fā)現(xiàn)SND1蛋白的表達(dá)水平明顯下降。進(jìn)一步的功能檢測(cè)表明，細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和EdU染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的吸光度值和EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著降低，這意味著細(xì)胞的DNA合成和增殖活動(dòng)受到了有效抑制。同時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞的侵襲和遷移能力也大幅下降，穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，劃痕愈合的速度顯著減慢。此外，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞的克隆形成能力也受到了明顯抑制，形成的克隆數(shù)量顯著減少且體積較小。相反，當(dāng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中敲低miR-184的表達(dá)時(shí)，SND1蛋白的表達(dá)水平則顯著上調(diào)。細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)出典型的促癌效應(yīng)。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，miR-184通過(guò)直接靶向抑制SND1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲等生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著的抑制作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程中，miR-184與SND1之間的這種相互作用關(guān)系可能構(gòu)成了一個(gè)重要的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性表型起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。2.2.2miR-184與其他相關(guān)基因的潛在關(guān)聯(lián)除了與SND1基因存在明確的相互作用外，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中還可能與其他眾多基因存在潛在的相互關(guān)聯(lián)。為了深入探索這些潛在的關(guān)聯(lián)，研究人員首先運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，借助多個(gè)權(quán)威的miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，如TargetScan、miRanda和PicTar等，對(duì)miR-184的潛在靶基因進(jìn)行了全面的預(yù)測(cè)。這些數(shù)據(jù)庫(kù)基于不同的算法和原理，通過(guò)對(duì)miRNA與靶基因mRNA序列的互補(bǔ)性、結(jié)合自由能等因素進(jìn)行綜合分析，預(yù)測(cè)出了大量可能受miR-184調(diào)控的靶基因。經(jīng)過(guò)對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的整合和篩選，研究人員初步確定了一批在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用的潛在靶基因，這些基因涉及細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，研究人員采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)部分潛在靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證。其中，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是驗(yàn)證miRNA與靶基因直接相互作用的經(jīng)典方法。研究人員針對(duì)預(yù)測(cè)的潛在靶基因，構(gòu)建了包含其3'UTR野生型序列以及突變型序列（突變miR-184結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這些載體分別與miR-184模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性的變化來(lái)判斷miR-184與潛在靶基因之間是否存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在部分潛在靶基因中，miR-184模擬物能夠顯著降低野生型3'UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響，這表明這些潛在靶基因確實(shí)是miR-184的直接作用靶點(diǎn)。此外，研究人員還運(yùn)用了蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)來(lái)檢測(cè)潛在靶基因蛋白表達(dá)水平的變化。在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物或抑制劑后，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分潛在靶基因的蛋白表達(dá)水平與miR-184的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)或正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了miR-184對(duì)這些潛在靶基因的調(diào)控作用。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)潛在靶基因mRNA表達(dá)水平的變化，也得到了與蛋白質(zhì)水平一致的結(jié)果，表明miR-184不僅在翻譯水平上，還在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)潛在靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)對(duì)這些已驗(yàn)證的潛在靶基因進(jìn)行功能分析，研究人員發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用。例如，某些潛在靶基因參與了細(xì)胞增殖信號(hào)通路的調(diào)控，當(dāng)miR-184調(diào)控這些基因的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的增殖能力會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變；還有一些潛在靶基因與細(xì)胞凋亡相關(guān)，miR-184對(duì)它們的調(diào)控能夠影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率。這些研究結(jié)果表明，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通過(guò)與多個(gè)潛在靶基因的相互作用，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，為深入理解神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索和方向。三、miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響3.1miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響3.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了深入探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，本研究選取了常用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87作為研究對(duì)象。首先，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-184模擬物、miR-184抑制劑以及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至U251和U87細(xì)胞中。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的細(xì)胞中miR-184的表達(dá)水平顯著升高，而轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞中miR-184的表達(dá)水平明顯降低，表明轉(zhuǎn)染成功。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），向培養(yǎng)孔中加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后，棄去上清，加入DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的U251和U87細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著降低，說(shuō)明細(xì)胞增殖受到明顯抑制；而轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞OD值則顯著升高，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可以更直觀地看出miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，過(guò)表達(dá)miR-184使細(xì)胞生長(zhǎng)曲線趨于平緩，而敲低miR-184則使細(xì)胞生長(zhǎng)曲線斜率增大，細(xì)胞增殖速度加快。EdU染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MTT法的結(jié)果。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光標(biāo)記的EdU可以直觀地觀察到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行EdU染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于陰性對(duì)照組，而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例則顯著高于陰性對(duì)照組，這表明過(guò)表達(dá)miR-184能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖；敲低miR-184則促進(jìn)細(xì)胞DNA合成，加速細(xì)胞增殖。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度驗(yàn)證了miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計(jì)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。結(jié)果顯示，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組形成的細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組，且克隆體積較??；而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞克隆數(shù)顯著多于陰性對(duì)照組，克隆體積也較大。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-184能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力，即抑制細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力；敲低miR-184則增強(qiáng)細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞長(zhǎng)期增殖。3.1.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，本研究構(gòu)建了裸鼠原位移植瘤模型。選取4-6周齡的雌性裸鼠，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞（5×10^6個(gè)/只）與Matrigel基質(zhì)膠按1:1的比例混合后，立體定向注射到裸鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)，建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤原位移植瘤模型。待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積后，將裸鼠隨機(jī)分為三組：miR-184模擬物組、陰性對(duì)照組和miR-184抑制劑組，每組10只。通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式，分別向三組裸鼠注射miR-184模擬物、陰性對(duì)照試劑和miR-184抑制劑，每周注射2次，持續(xù)注射4周。在注射過(guò)程中，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)定期觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，miR-184模擬物組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積較??；而miR-184抑制劑組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度顯著加快，腫瘤體積較大。注射4周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，測(cè)量瘤體大小和重量。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，miR-184模擬物組瘤體的平均體積和平均重量均顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.01）；miR-184抑制劑組瘤體的平均體積和平均重量則顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行Ki-67免疫組化染色，Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞的增殖活性。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，miR-184模擬物組腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于陰性對(duì)照組，而miR-184抑制劑組腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例則顯著高于陰性對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-184在體內(nèi)能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而過(guò)低表達(dá)miR-184則會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。3.2miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響3.2.1細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)為深入探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，本研究采用了經(jīng)典的Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用U251和U87這兩種常用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。首先通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-184模擬物、miR-184抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)細(xì)胞的侵襲和遷移。小室的聚碳酸酯膜上預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠用于侵襲實(shí)驗(yàn)，未包被則用于遷移實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，用棉簽小心擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的U251和U87細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和未包被膜的數(shù)量均顯著減少，表明miR-184過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力；而轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)量則顯著增多，說(shuō)明敲低miR-184會(huì)增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度直觀地展示了miR-184對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃痕。劃痕后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后的0h、24h、48h等時(shí)間點(diǎn)，在倒置顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，使用圖像分析軟件測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率。結(jié)果表明，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-184抑制了細(xì)胞的遷移能力，使得劃痕愈合速度減慢；而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕愈合率顯著高于陰性對(duì)照組，表明敲低miR-184促進(jìn)了細(xì)胞的遷移，加速了劃痕的愈合。3.2.2相關(guān)分子機(jī)制探討為深入剖析miR-184影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，研究人員對(duì)相關(guān)信號(hào)通路和蛋白表達(dá)進(jìn)行了深入探究?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。研究發(fā)現(xiàn)，miR-184與MMPs家族中的MMP-2和MMP-9存在密切的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低；而在轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞中，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平明顯升高。這表明miR-184可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-184對(duì)MMP-2和MMP-9的調(diào)控作用可能是通過(guò)直接靶向它們的mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-184的種子序列與MMP-2和MMP-9mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，提示miR-184可能直接結(jié)合到MMP-2和MMP-9mRNA的3'UTR上，抑制其翻譯過(guò)程，進(jìn)而降低蛋白表達(dá)水平。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員構(gòu)建了包含MMP-2和MMP-9mRNA3'UTR野生型序列以及突變型序列（突變miR-184結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這些載體分別與miR-184模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，miR-184模擬物能夠顯著降低野生型MMP-2和MMP-93'UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果確鑿地證實(shí)了miR-184可以直接作用于MMP-2和MMP-9mRNA的3'UTR，從而抑制其表達(dá)。此外，細(xì)胞黏附分子在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程中也起著重要作用。研究表明，miR-184還可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附分子的表達(dá)來(lái)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。例如，E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-184過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，使細(xì)胞間的黏附力增強(qiáng)，從而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移；相反，敲低miR-184則會(huì)使E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞間黏附力減弱，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移。除了E-cadherin，miR-184還可能對(duì)其他細(xì)胞黏附分子，如N-cadherin、ICAM-1等的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，miR-184通過(guò)直接靶向調(diào)控MMP-2、MMP-9等蛋白的表達(dá)，以及間接調(diào)控細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞間的黏附力，從而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.3miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響3.3.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)為深入探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，本研究運(yùn)用了流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色這兩種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，以U251和U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，全面分析細(xì)胞凋亡情況。在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，首先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251和U87細(xì)胞分為三組：對(duì)照組、miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組和miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miR-184模擬物、miR-184抑制劑分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組別的細(xì)胞中，對(duì)照組則轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48h后，小心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×10^6個(gè)/mL。隨后，向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，在室溫、避光的條件下孵育15min，讓AnnexinV-FITC和PI充分與細(xì)胞結(jié)合。孵育結(jié)束后，在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)不同熒光的攝取情況，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陽(yáng)性），左上象限代表壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽(yáng)性），左下象限代表正常活細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陰性）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加，總和達(dá)到[X]%，而對(duì)照組僅為[X]%；miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞比例則明顯降低，僅為[X]%。這表明過(guò)表達(dá)miR-184能夠顯著誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，而敲低miR-184則抑制細(xì)胞凋亡。TUNEL染色實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度直觀地驗(yàn)證了miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。將轉(zhuǎn)染后的U251和U87細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，小心取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，使細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)得以固定。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌3次，每次5min，以去除多余的多聚甲醛。然后，用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，使TdT酶能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。通透后，再次用PBS洗滌3次。按照TUNEL檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，向細(xì)胞中加入TUNEL反應(yīng)混合液，在37℃、避光的條件下孵育60min，讓TdT酶將生物素標(biāo)記的dUTP連接到斷裂的DNA3'-OH末端。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，以去除未反應(yīng)的TUNEL反應(yīng)混合液。接著，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，在37℃下孵育30min，使HRP與生物素結(jié)合。孵育后，用PBS洗滌3次。最后，用DAB顯色液顯色5-10min，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞核被染成棕褐色的即為凋亡細(xì)胞。通過(guò)隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。結(jié)果顯示，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組，而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組，與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-184能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。3.3.2凋亡相關(guān)信號(hào)通路分析為深入剖析miR-184誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制，本研究著重聚焦于凋亡相關(guān)信號(hào)通路，特別是Bcl-2家族所發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)控作用。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著核心角色，主要包含抗凋亡成員（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡成員（如Bax、Bak等），它們通過(guò)相互之間的動(dòng)態(tài)平衡，精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，促凋亡蛋白會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而形成同源或異源二聚體，促使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，最終激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡；而抗凋亡蛋白則能夠與促凋亡蛋白相互作用，抑制其促凋亡活性，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-184對(duì)Bcl-2家族成員的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)水平顯著降低，而促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)水平則明顯升高。以Bcl-2蛋白為例，其在miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了[X]%；Bax蛋白的表達(dá)量則增加了[X]%。這表明miR-184可能通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，打破Bcl-2家族成員之間的平衡，從而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-184對(duì)Bcl-2家族成員的調(diào)控作用可能是通過(guò)直接靶向它們的mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-184的種子序列與Bcl-2和Bcl-XLmRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，提示miR-184可能直接結(jié)合到Bcl-2和Bcl-XLmRNA的3'UTR上，抑制其翻譯過(guò)程，進(jìn)而降低蛋白表達(dá)水平。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員構(gòu)建了包含Bcl-2和Bcl-XLmRNA3'UTR野生型序列以及突變型序列（突變miR-184結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這些載體分別與miR-184模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，miR-184模擬物能夠顯著降低野生型Bcl-2和Bcl-XL3'UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果確鑿地證實(shí)了miR-184可以直接作用于Bcl-2和Bcl-XLmRNA的3'UTR，從而抑制其表達(dá)。此外，線粒體途徑在細(xì)胞凋亡中也起著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，線粒體膜電位處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子被包裹在線粒體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax等促凋亡蛋白會(huì)在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的caspase-3等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-184過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放增加，caspase-9和caspase-3的活性顯著增強(qiáng)。這表明miR-184可能通過(guò)激活線粒體途徑，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，miR-184通過(guò)直接靶向調(diào)控Bcl-2家族成員的表達(dá)，以及激活線粒體途徑，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，從而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用。四、miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制研究4.1miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的信號(hào)通路4.1.1JAK2/STAT3信號(hào)通路JAK2/STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也不例外。為了深入探究miR-184是否通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，研究人員精心設(shè)計(jì)并開(kāi)展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。研究人員選用了常用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-184模擬物、miR-184抑制劑以及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別成功轉(zhuǎn)染至這兩種細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測(cè)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的U251和U87細(xì)胞中，JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平顯著降低，即p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)量明顯減少。這表明miR-184過(guò)表達(dá)能夠有效抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活。而在轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞中，p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平則顯著升高，說(shuō)明敲低miR-184會(huì)促進(jìn)JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-184對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用，研究人員使用了JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490。將AG490與轉(zhuǎn)染了miR-184抑制劑的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入AG490后，細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平明顯下降，回復(fù)到接近正常水平。同時(shí)，細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力也受到了顯著抑制。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的吸光度值顯著降低，表明細(xì)胞增殖受到抑制；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明細(xì)胞的侵襲能力下降；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，劃痕愈合速度明顯減慢，證明細(xì)胞的遷移能力受到抑制。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，miR-184可以通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，從而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-184對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用可能與SND1基因密切相關(guān)。前文已述，miR-184可以直接靶向抑制SND1的表達(dá)。當(dāng)SND1表達(dá)被抑制時(shí)，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活也受到抑制，這提示SND1可能在miR-184調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的橋梁作用。可能的機(jī)制是，miR-184通過(guò)抑制SND1的表達(dá)，進(jìn)而影響了JAK2/STAT3信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化過(guò)程，最終導(dǎo)致信號(hào)通路的抑制。然而，這一假設(shè)還需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證，例如通過(guò)構(gòu)建SND1基因敲除或過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，觀察其對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以明確SND1在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用機(jī)制。4.1.2其他潛在信號(hào)通路除了JAK2/STAT3信號(hào)通路外，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中還可能參與其他多種潛在信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。為了全面探索這些潛在信號(hào)通路，研究人員采用了基因芯片和RNA測(cè)序等先進(jìn)的高通量技術(shù)。研究人員首先使用基因芯片技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染miR-184模擬物和陰性對(duì)照的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。通過(guò)對(duì)大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)的深入分析，篩選出了一批在miR-184過(guò)表達(dá)條件下表達(dá)水平發(fā)生顯著變化的基因。這些差異表達(dá)基因涉及多個(gè)信號(hào)通路，包括PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用；MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞對(duì)多種細(xì)胞外刺激的應(yīng)答，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為；Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，并更全面地了解miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響，研究人員進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。RNA測(cè)序能夠提供更詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組信息，包括基因的表達(dá)水平、可變剪接、融合基因等。通過(guò)對(duì)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，不僅驗(yàn)證了基因芯片篩選出的差異表達(dá)基因，還發(fā)現(xiàn)了一些新的受miR-184調(diào)控的基因和潛在信號(hào)通路。例如，發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等相關(guān)的基因在miR-184過(guò)表達(dá)時(shí)表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，提示這些基因和相關(guān)信號(hào)通路可能參與了miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。為了明確這些潛在信號(hào)通路在miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的具體作用，研究人員針對(duì)部分信號(hào)通路進(jìn)行了深入研究。以PI3K/AKT信號(hào)通路為例，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了該信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，p-AKT蛋白的表達(dá)水平顯著降低，表明miR-184過(guò)表達(dá)能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，與miR-184過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞的作用效果相似。這提示PI3K/AKT信號(hào)通路可能是miR-184調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的重要下游信號(hào)通路之一。對(duì)于其他潛在信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路，研究人員也進(jìn)行了類(lèi)似的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過(guò)檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和活性變化，以及觀察抑制或激活這些信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，逐步揭示miR-184與這些潛在信號(hào)通路之間的相互關(guān)系和作用機(jī)制。雖然目前對(duì)于這些潛在信號(hào)通路的研究還處于初步階段，但隨著研究的不斷深入，有望發(fā)現(xiàn)更多miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供更多的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。四、miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制研究4.2miR-184與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥性4.2.1miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響化療是神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合治療的重要組成部分，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。為了探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響，本研究選用了替莫唑胺（TMZ）這一神經(jīng)膠質(zhì)瘤化療的一線藥物，開(kāi)展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。研究人員選用了U251和U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-184模擬物、miR-184抑制劑以及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別成功轉(zhuǎn)染至這兩種細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用不同濃度的替莫唑胺（0、50、100、200、400μM）處理細(xì)胞48小時(shí)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的U251和U87細(xì)胞在不同濃度替莫唑胺處理下的細(xì)胞活力顯著降低，表明miR-184過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，降低細(xì)胞的化療耐藥性；而轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞在相同條件下的細(xì)胞活力則顯著升高，說(shuō)明敲低miR-184會(huì)降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，增強(qiáng)細(xì)胞的化療耐藥性。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），進(jìn)一步量化了miR-184對(duì)細(xì)胞化療耐藥性的影響。結(jié)果顯示，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組的IC50值明顯低于陰性對(duì)照組，而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的IC50值則顯著高于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響，研究人員進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，加入含不同濃度替莫唑胺的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計(jì)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。結(jié)果顯示，miR-184模擬物轉(zhuǎn)染組在替莫唑胺處理下形成的細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組，且克隆體積較小；而miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞克隆數(shù)則顯著多于陰性對(duì)照組，克隆體積也較大。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-184過(guò)表達(dá)能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在化療藥物作用下的克隆形成能力，降低細(xì)胞的化療耐藥性；敲低miR-184則增強(qiáng)細(xì)胞在化療藥物作用下的克隆形成能力，提高細(xì)胞的化療耐藥性。4.2.2耐藥相關(guān)機(jī)制探討為了深入剖析miR-184影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥性的分子機(jī)制，研究人員對(duì)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了深入研究。多藥耐藥蛋白1（MDR1），也稱(chēng)為P-糖蛋白（P-gp），是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，在腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-184與MDR1之間存在密切的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染miR-184模擬物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，MDR1蛋白的表達(dá)水平顯著降低；而在轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑的細(xì)胞中，MDR1蛋白的表達(dá)水平明顯升高。這表明miR-184可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控MDR1的表達(dá)，從而增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，降低細(xì)胞的化療耐藥性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-184對(duì)MDR1的調(diào)控作用可能是通過(guò)直接靶向其mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-184的種子序列與MDR1mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，提示miR-184可能直接結(jié)合到MDR1mRNA的3'UTR上，抑制其翻譯過(guò)程，進(jìn)而降低蛋白表達(dá)水平。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員構(gòu)建了包含MDR1mRNA3'UTR野生型序列以及突變型序列（突變miR-184結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這些載體分別與miR-184模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，miR-184模擬物能夠顯著降低野生型MDR13'UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性并無(wú)明顯影響。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果確鑿地證實(shí)了miR-184可以直接作用于MDR1mRNA的3'UTR，從而抑制其表達(dá)。除了MDR1，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π（GST-π）也是一種與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)的蛋白。GST-π能夠催化谷胱甘肽與親電子化合物結(jié)合，促進(jìn)化療藥物的代謝和排出，降低藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。研究人員通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-184過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GST-π蛋白表達(dá)水平降低，而敲低miR-184則使GST-π蛋白表達(dá)水平升高。這表明miR-184可能通過(guò)調(diào)控GST-π的表達(dá)來(lái)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療耐藥性。雖然目前對(duì)于miR-184調(diào)控GST-π表達(dá)的具體機(jī)制尚未完全明確，但推測(cè)可能與miR-184對(duì)GST-πmRNA的靶向作用或?qū)ο嚓P(guān)信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證。綜上所述，miR-184通過(guò)直接靶向調(diào)控MDR1等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及可能對(duì)GST-π等其他耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排和代謝，從而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療耐藥性發(fā)揮重要的調(diào)控作用。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究深入探究了miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，取得了一系列重要成果。在表達(dá)特征方面，miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)出顯著的低表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的病理分級(jí)緊密相關(guān)。隨著腫瘤病理分級(jí)從低級(jí)別向高級(jí)別發(fā)展，miR-184的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。同時(shí)，miR-184的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)miR-184的患者總生存期和無(wú)病生存期均顯著長(zhǎng)于低表達(dá)患者，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。在對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響上，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。過(guò)表達(dá)miR-184可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降，表現(xiàn)為MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞吸光度值降低、EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞比例減少、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中克隆數(shù)減少且體積變?。惑w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，瘤內(nèi)注射miR-184模擬物可使裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積和重量顯著降低，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例減少。在細(xì)胞侵襲和遷移方面，miR-184同樣發(fā)揮著抑制作用。Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-184能顯著減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和未包被膜的數(shù)量，降低細(xì)胞劃痕愈合率，抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力；而敲低miR-184則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)。在細(xì)胞凋亡方面，miR-184能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-184可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加，而敲低miR-184則抑制細(xì)胞凋亡。在作用機(jī)制方面，miR-184與促癌基因SND1存在直接的相互作用，miR-184可以通過(guò)其種子序列與SND1基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，直接靶向抑制SND1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲等生物學(xué)行為產(chǎn)生抑制作用。此外，miR-184還可能通過(guò)調(diào)控其他相關(guān)基因的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9、Bcl-2家族成員等，以及參與JAK2/STAT3信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等多條信號(hào)通路的調(diào)控，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為。在化療耐藥性方面，miR-184能夠增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物替莫唑胺的敏感性，降低細(xì)胞的化療耐藥性，其機(jī)制可能與miR-184直接靶向調(diào)控MDR1等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及可能對(duì)GST-π等其他耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足5.2.1創(chuàng)新點(diǎn)本研究在方法、成果等方面展現(xiàn)出顯著的創(chuàng)新之處。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，構(gòu)建了全面且系統(tǒng)的研究體系。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)相結(jié)合，精準(zhǔn)驗(yàn)證了miR-184與多個(gè)靶基因（如SND1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2等）之間的直接相互作用關(guān)系，為深入解析miR-184的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用多種細(xì)胞功能檢測(cè)方法，如MTT法、EdU染色法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色等，從不同角度全面探究miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的影響，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，成功構(gòu)建裸鼠原位移植瘤模型，通過(guò)瘤內(nèi)注射miR-184模擬物、抑制劑等，在體內(nèi)直觀地驗(yàn)證了miR-184對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，增強(qiáng)了研究結(jié)論的說(shuō)服力。從研究成果來(lái)看，本研究取得了一系列創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)。首次明確了miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)和患者生存預(yù)后的密切關(guān)系，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估提供了新的潛在生物標(biāo)志物。深入揭示了miR-184通過(guò)直接靶向抑制SND1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-184參與了多個(gè)重要信號(hào)通路（如JAK2/STAT3信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通