PTEN與VEGF-C表達：原發(fā)性肝細胞肝癌診療新視角一、引言1.1研究背景與意義原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，肝癌是全球第六位最常見的惡性腫瘤，同時也是第三位最常見的腫瘤相關性死亡原因。在中國，HCC的形勢更為嚴峻，中國是HCC的高發(fā)地區(qū)，全球每年新發(fā)病例約626,162例，其中中國病例占比高達55％，約344,000例，且男性發(fā)病率顯著高于女性，比例約為2.67:1。其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，導致早期診斷率低，5年生存率僅在2％－16％之間。手術切除、肝移植和局部消融等是早期HCC患者的治愈性治療方案，但僅能覆蓋約30－40％的早期患者。對于中晚期HCC患者，約70%無法接受治愈性治療，肝動脈化療栓塞（TACE）僅對部分患者有益，放化療效果不佳。肝細胞癌的分子發(fā)病機制極其復雜，慢性HBV/HCV感染或環(huán)境毒素引發(fā)肝硬化并誘導肝細胞基因水平的病變，其中信號傳導途徑異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，如抗細胞凋亡信號途徑失調(diào)（p53、PTEN等）以及新生血管異常增生（如VEGF途徑）等。深入研究這些分子機制，尋找有效的生物標志物和治療靶點迫在眉睫。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）作為一種重要的抑癌基因，在細胞生長、增殖、凋亡和遷移等過程中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用。PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性，負向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，抑制細胞的過度增殖和存活。在多種腫瘤中，包括原發(fā)性肝細胞肝癌，PTEN基因的缺失、突變或表達下調(diào)較為常見，導致其抑癌功能喪失，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，PTEN表達缺失與肝癌組織分化程度和侵襲性呈負相關，可作為評估肝癌患者預后的重要指標。血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）是血管內(nèi)皮生長因子家族的重要成員，其主要功能是促進淋巴管生成和血管生成。在腫瘤進展過程中，VEGF-C高表達可通過激活其受體VEGFR-2和VEGFR-3，誘導腫瘤新生淋巴管生成，增加腫瘤細胞進入淋巴循環(huán)的機會，從而促進腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在原發(fā)性肝細胞肝癌中，VEGF-C的異常表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預后密切相關。目前，雖然對PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的研究已取得一定進展，但仍存在諸多問題有待深入探討。例如，PTEN和VEGF-C在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子調(diào)控機制尚未完全明確；兩者之間是否存在相互作用以及這種相互作用如何影響肝癌的生物學行為；能否將PTEN和VEGF-C作為聯(lián)合診斷和治療的靶點，以提高肝癌的早期診斷率和治療效果等。因此，本研究旨在檢測PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達情況，分析其與肝癌臨床病理特征的相關性，探討兩者在肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用機制，為原發(fā)性肝細胞肝癌的早期診斷、預后評估和靶向治療提供理論依據(jù)和潛在的生物標志物。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌中的研究現(xiàn)狀在國外，PTEN與原發(fā)性肝細胞肝癌的研究由來已久。早期研究集中在PTEN基因的結(jié)構(gòu)和功能解析上，發(fā)現(xiàn)PTEN基因位于10q23.3，其編碼的蛋白具有雙特異性磷酸酶活性。后續(xù)研究表明，在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，PTEN基因的缺失、突變或甲基化等異常改變較為常見，導致PTEN蛋白表達下調(diào)或功能喪失。一項來自美國的研究對100例原發(fā)性肝細胞肝癌患者的腫瘤組織進行分析，發(fā)現(xiàn)PTEN基因缺失率達到30%，且PTEN基因缺失與患者的不良預后顯著相關。此外，通過體外細胞實驗和動物模型研究發(fā)現(xiàn)，恢復PTEN的表達能夠抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導細胞凋亡，其機制主要與負調(diào)控PI3K/AKT信號通路有關。國內(nèi)學者在PTEN與原發(fā)性肝細胞肝癌的研究方面也取得了豐碩成果。通過大樣本的臨床病理研究，進一步明確了PTEN蛋白表達與肝癌患者臨床病理特征的相關性。如在一項納入200例肝癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白低表達與腫瘤的高分級、高分期以及血管侵犯密切相關。同時，國內(nèi)研究還深入探討了PTEN參與肝癌發(fā)生發(fā)展的其他潛在機制，如通過調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，影響肝癌細胞的周期進程；與其他信號通路（如MAPK信號通路）相互作用，協(xié)同調(diào)控肝癌細胞的生物學行為等。1.2.2VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的研究現(xiàn)狀國外對于VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的研究起步較早，重點聚焦于VEGF-C的生物學功能及其在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機制。研究證實，VEGF-C主要通過與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的VEGFR-3特異性結(jié)合，激活下游信號通路，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導腫瘤新生淋巴管生成。在原發(fā)性肝細胞肝癌中，多項臨床研究表明，VEGF-C的高表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及不良預后密切相關。例如，一項歐洲的多中心研究對500例肝癌患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于低表達組，且5年生存率顯著降低。此外，通過基因敲除或抗體阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號通路，能夠有效抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，為肝癌的靶向治療提供了理論依據(jù)。國內(nèi)在VEGF-C與原發(fā)性肝細胞肝癌的研究方面也不斷深入。一方面，通過免疫組織化學、RT-PCR等技術檢測肝癌組織中VEGF-C的表達水平，進一步驗證了其與肝癌臨床病理特征的相關性，如VEGF-C高表達與肝癌的TNM分期、腫瘤大小、包膜完整性等因素密切相關。另一方面，國內(nèi)研究還關注VEGF-C在肝癌微環(huán)境中的作用，發(fā)現(xiàn)VEGF-C不僅能夠促進腫瘤淋巴管生成，還能通過招募免疫細胞、調(diào)節(jié)細胞因子分泌等方式，影響肝癌微環(huán)境的免疫狀態(tài)，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。1.2.3PTEN與VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的相關性研究現(xiàn)狀目前，國內(nèi)外關于PTEN與VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的相關性研究相對較少，但已有研究提示兩者之間可能存在密切聯(lián)系。國外有研究通過生物信息學分析和細胞實驗初步發(fā)現(xiàn)，PTEN可能通過PI3K/AKT信號通路間接調(diào)控VEGF-C的表達。在肝癌細胞中，PTEN表達缺失導致PI3K/AKT信號通路激活，進而上調(diào)VEGF-C的表達，促進腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移。國內(nèi)也有類似研究報道，在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，PTEN蛋白表達與VEGF-C蛋白表達呈負相關，且兩者的異常表達與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關。然而，PTEN與VEGF-C之間具體的分子調(diào)控機制仍有待進一步深入研究，如是否存在其他信號分子或通路參與兩者的相互作用，以及這種相互作用在肝癌不同發(fā)展階段的動態(tài)變化等問題，均需要更多的基礎和臨床研究來闡明。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在通過檢測原發(fā)性肝細胞肝癌組織中PTEN和VEGF-C的表達情況，深入分析其與肝癌患者臨床病理特征之間的相關性，進而探討PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，具體研究目的如下：運用免疫組織化學法和RT-PCR法，準確檢測PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織中的蛋白和mRNA表達水平，比較二者在不同組織中的表達差異，明確PTEN和VEGF-C在肝癌組織中的表達變化趨勢。全面分析PTEN和VEGF-C的表達與原發(fā)性肝細胞肝癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、TNM分期、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的相關性，篩選出與PTEN和VEGF-C表達密切相關的臨床病理因素，為肝癌的臨床診斷和預后評估提供參考指標。深入探討PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的相互作用機制，研究PTEN是否通過調(diào)控PI3K/AKT等信號通路影響VEGF-C的表達，以及VEGF-C的異常表達是否反饋調(diào)節(jié)PTEN的功能，為揭示肝癌的分子發(fā)病機制提供理論依據(jù)?；赑TEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達特征和相互作用機制，評估二者作為聯(lián)合診斷標志物和潛在治療靶點的可行性，為肝癌的早期診斷、靶向治療和預后改善提供新的思路和方法。1.3.2研究方法免疫組織化學法：收集原發(fā)性肝細胞肝癌患者手術切除的腫瘤組織及癌旁正常組織標本，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后，制成4μm厚的切片。采用免疫組織化學鏈霉素親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SP）法，分別檢測PTEN和VEGF-C蛋白在組織切片中的表達情況。以鼠抗人PTEN單克隆抗體和兔抗人VEGF-C多克隆抗體為一抗，按照試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復染細胞核。在光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽性細胞數(shù)和染色強度對PTEN和VEGF-C蛋白的表達進行半定量分析。RT-PCR法：運用TRIzol試劑從原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，分別檢測PTEN和VEGF-C的mRNA表達水平。β-actin作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達量。PCR反應條件為：95℃預變性5min，然后95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值表示PTEN和VEGF-C的mRNA相對表達量。統(tǒng)計學分析法：采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；PTEN和VEGF-C表達與臨床病理特征之間的相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。二、PTEN和VEGF-C的生物學特性2.1PTEN的結(jié)構(gòu)、功能與作用機制2.1.1PTEN的基因結(jié)構(gòu)PTEN基因，全稱人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen），定位于人類染色體10q23.3。該基因全長約200kb，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子。外顯子負責編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而內(nèi)含子則在基因轉(zhuǎn)錄后的加工過程中發(fā)揮重要作用，通過選擇性剪接等機制，可產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄本，增加蛋白質(zhì)組的復雜性。PTEN基因的啟動子區(qū)域含有多個順式作用元件，如SP1、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，這些轉(zhuǎn)錄因子可與啟動子區(qū)域相互作用，調(diào)控PTEN基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。此外，PTEN基因的甲基化狀態(tài)也對其表達具有重要影響。在腫瘤細胞中，常可見PTEN基因啟動子區(qū)域的高甲基化，導致基因沉默，從而使PTEN蛋白表達缺失或降低，進而失去對腫瘤的抑制作用。2.1.2PTEN編碼蛋白的結(jié)構(gòu)PTEN基因編碼的蛋白質(zhì)由403個氨基酸組成，分子量約為56kDa，廣泛表達于人體的多種組織和細胞中，包括肝、腎、肺、乳腺等。PTEN蛋白從N端到C端可分為四個主要結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域具有獨特的功能，協(xié)同發(fā)揮PTEN蛋白的生物學作用。磷酸酶域：位于PTEN蛋白的N端，是其發(fā)揮抑癌功能的關鍵區(qū)域，具有雙重磷酸酶活性，既能夠使蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸（Tyr）或絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）殘基去磷酸化，又能特異性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。這種雙重磷酸酶活性使得PTEN能夠參與多條信號通路的調(diào)控，在細胞生長、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。C2域：緊鄰磷酸酶域，能夠與膜磷脂結(jié)合，且不依賴于鈣離子。C2域的主要作用是將PTEN蛋白定位到細胞膜上，使其能夠接近并作用于膜上的底物，如PIP3。研究表明，C2域的突變雖然不會直接影響磷酸酶域的活性，但會導致PTEN蛋白無法正確定位到細胞膜，從而顯著降低其對PIP3的去磷酸化能力，進而影響PTEN的抑癌功能。兩個PEST域：位于C2域之后，富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）殘基，因此得名PEST域。這兩個結(jié)構(gòu)域與PTEN蛋白的穩(wěn)定性密切相關，當PEST域發(fā)生突變或缺失時，會加速PTEN蛋白在細胞內(nèi)的降解，導致細胞內(nèi)PTEN蛋白水平下降，從而削弱其對腫瘤的抑制作用。PDZ結(jié)合序列：位于PTEN蛋白的C末端，可介導PTEN與PDZ蛋白家族成員的結(jié)合。PDZ蛋白在細胞內(nèi)參與多種信號通路的調(diào)節(jié)和細胞骨架的組織，PTEN通過與PDZ蛋白結(jié)合，能夠進一步調(diào)控下游信號通路，影響細胞的生物學行為，如細胞遷移、黏附等過程。2.1.3PTEN在細胞周期調(diào)控中的作用及機制細胞周期的正常調(diào)控是維持細胞正常生長和增殖的關鍵，而PTEN在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的負調(diào)控作用。在正常細胞中，PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性，負向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。當細胞受到生長因子等刺激時，PI3K被激活，將PIP2磷酸化為PIP3，PIP3可招募AKT到細胞膜上，并在磷脂酰肌醇依賴激酶-1（PDK1）等的作用下使AKT磷酸化而激活。激活的AKT可通過一系列下游分子，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進細胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而促進細胞增殖。而PTEN能夠?qū)IP3去磷酸化重新生成PIP2，阻斷PI3K/AKT信號通路的激活，抑制細胞增殖，使細胞周期停滯在G1期。此外，PTEN還可以通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達和活性來調(diào)控細胞周期。例如，PTEN能夠上調(diào)p27Kip1等細胞周期抑制蛋白的表達，p27Kip1可與CDK2-細胞周期蛋白E復合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞從G1期進入S期。同時，PTEN還可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，細胞周期蛋白D1是促進G1期進展的關鍵蛋白，其表達下調(diào)也有助于使細胞周期停滯在G1期，抑制細胞的過度增殖。2.1.4PTEN誘導細胞凋亡的作用及機制誘導細胞凋亡是PTEN發(fā)揮抑癌作用的重要機制之一。PTEN主要通過以下幾種途徑誘導細胞凋亡：一是通過抑制PI3K/AKT信號通路來促進細胞凋亡。AKT是一種重要的抗凋亡蛋白，激活的AKT可磷酸化并抑制多種促凋亡蛋白，如Bad、Caspase-9等，從而抑制細胞凋亡。而PTEN通過使PIP3去磷酸化，阻斷AKT的激活，解除對促凋亡蛋白的抑制，進而誘導細胞凋亡。二是PTEN可以調(diào)節(jié)線粒體途徑來誘導凋亡。PTEN能夠通過與Bcl-2家族蛋白相互作用，調(diào)節(jié)線粒體膜電位，促使細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。三是PTEN還可以通過調(diào)節(jié)死亡受體途徑來誘導凋亡。PTEN能夠影響死亡受體Fas等的表達和功能，F(xiàn)as與其配體FasL結(jié)合后，可招募死亡結(jié)構(gòu)域相關蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導信號復合物（DISC），激活Caspase-8，啟動Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。2.1.5PTEN抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用及機制腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的多步驟過程，包括腫瘤細胞的脫離、侵襲、遷移、進入循環(huán)系統(tǒng)以及在遠處器官的定植等。PTEN在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用，其機制主要涉及以下幾個方面：首先，PTEN通過調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）的黏附來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。整合素是一類介導細胞與ECM黏附的跨膜蛋白，其激活可導致黏著斑激酶（FAK）等的磷酸化，進而促進細胞的遷移和侵襲。PTEN能夠抑制FAK的磷酸化，破壞黏著斑的形成，降低腫瘤細胞與ECM的黏附力，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其次，PTEN可以通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性的過程，這一過程使腫瘤細胞具有更強的遷移和侵襲能力。PTEN能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路，下調(diào)EMT相關轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等的表達，維持上皮細胞的特性，抑制EMT的發(fā)生，從而減少腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能。此外，PTEN還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的多種細胞和細胞因子參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，PTEN能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子的表達，減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細胞進入血液循環(huán)，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風險。2.2VEGF-C的結(jié)構(gòu)、功能與作用機制2.2.1VEGF-C的基因結(jié)構(gòu)血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）作為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族的重要成員，其基因在人體中具有獨特的結(jié)構(gòu)和定位。人VEGF-C基因定位于染色體4q34，全長約40kb，包含7個含有編碼序列的外顯子。這些外顯子在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中發(fā)揮著關鍵作用，各自編碼VEGF-C蛋白的不同區(qū)域。外顯子1編碼信號序列和N-末端前肽的第一個殘基，信號序列對于VEGF-C蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運至關重要，引導新生的蛋白質(zhì)進入分泌途徑。外顯子2編碼N-末端肽的羧基末端和VEGF同源區(qū)的氨基末端，VEGF同源區(qū)是VEGF-C與其他VEGF家族成員具有相似結(jié)構(gòu)和功能的關鍵區(qū)域。外顯子3和4共同編碼與其它VEGF家族相似的核心生長因子結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域決定了VEGF-C的基本生物學活性，如與受體的結(jié)合能力等。外顯子5和7編碼VEGF-C的C末端一種富含半胱氨酸殘基的蛋白，這種富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)對于維持VEGF-C蛋白的穩(wěn)定性和正確折疊具有重要意義。外顯子6不編碼肝素結(jié)合域的序列，因此VEGF-C不能與肝素結(jié)合，這也影響了其在體內(nèi)的一些生物學行為和作用方式。VEGF-C基因的啟動子區(qū)域同樣含有多個順式作用元件，可與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄水平。此外，VEGF-C基因的表達還受到多種因素的調(diào)控，如缺氧、炎癥因子等，在腫瘤微環(huán)境中，這些因素可通過激活相關信號通路，上調(diào)VEGF-C基因的表達，從而促進腫瘤的進展。2.2.2VEGF-C編碼蛋白的結(jié)構(gòu)人VEGF-C基因的開放閱讀框可表達含419個氨基酸殘基的蛋白，其分子量約為46.9kD；鼠的VEGF-CcDNA克隆表達415個氨基酸的多肽，與人VEGF-C有85%的相同序列。新合成的VEGF-C蛋白是一種前體蛋白，由N末端信號肽、N末端前肽、VEGF同源區(qū)及C-末端前肽組成。N末端信號肽在VEGF-C蛋白的合成和分泌過程中發(fā)揮重要作用，引導蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后被切除。N末端前肽和C-末端前肽在VEGF-C蛋白的加工和成熟過程中也起著關鍵作用，前體蛋白需要經(jīng)過蛋白酶水解，去除這些前肽，才能形成具有生物學活性的成熟VEGF-C蛋白。VEGF-C在VEGF同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有3個N端糖基化位點，糖基化修飾可影響VEGF-C蛋白的穩(wěn)定性、活性以及與受體的結(jié)合能力等。與VEGF家族中其他生長因子的氨基酸序列相比，VEGF-C具有該家族成員所特有的8個半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基參與形成分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，對于維持VEGF-C蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物學活性至關重要。成熟的VEGF-C蛋白以非共價二硫鍵連接的同源二聚體形式存在，這種二聚體結(jié)構(gòu)能夠增強VEGF-C與受體的結(jié)合親和力，從而更有效地激活下游信號通路，發(fā)揮其生物學功能。2.2.3VEGF-C在淋巴管生成中的作用及機制VEGF-C是目前已知的最重要的促淋巴管生成因子之一，在淋巴管生成過程中發(fā)揮著核心作用。在胚胎發(fā)育時期，VEGF-C對于淋巴管的初始形成和發(fā)育至關重要。它通過與淋巴管內(nèi)皮細胞表面特異性表達的受體VEGFR-3（Flt-4）結(jié)合，激活一系列下游信號通路，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化，從而引導淋巴管的發(fā)生和構(gòu)建。在成年個體中，雖然淋巴管的生成相對穩(wěn)定，但在一些病理狀態(tài)下，如腫瘤發(fā)生、炎癥反應等，VEGF-C的表達會顯著上調(diào)，進而誘導淋巴管生成。具體來說，當腫瘤細胞分泌大量VEGF-C時，VEGF-C以旁分泌的方式作用于腫瘤周邊或內(nèi)部的淋巴管內(nèi)皮細胞。VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后，使VEGFR-3發(fā)生磷酸化并激活結(jié)聯(lián)蛋白，結(jié)聯(lián)蛋白的SH2區(qū)與PTB區(qū)結(jié)合而發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的結(jié)聯(lián)蛋白可與調(diào)節(jié)蛋白Grb2的SH2區(qū)結(jié)合，并促進Grb2的SH2區(qū)與尿嘌呤核苷酸釋放因子SOS結(jié)合形成復合體，此復合體激活Ras信號轉(zhuǎn)導途徑，最終誘導淋巴管內(nèi)皮細胞的有絲分裂，促進細胞增殖。同時，VEGF-C還能促進淋巴管內(nèi)皮細胞的遷移和管腔形成，增加淋巴管的密度和管徑，使腫瘤組織內(nèi)或周圍的淋巴管網(wǎng)絡得以重塑和擴展。此外，VEGF-C還可以調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細胞的存活，抑制其凋亡，維持新生淋巴管的穩(wěn)定性。2.2.4VEGF-C在血管生成中的作用及機制除了在淋巴管生成中發(fā)揮關鍵作用外，VEGF-C在一定條件下也參與血管生成過程。在胚胎發(fā)育的早期階段，VEGF-C不僅對淋巴管生成至關重要，同時也在血管系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮作用。它可以與血管內(nèi)皮細胞表面的VEGFR-2（Flk-1）結(jié)合，激活VEGFR-2介導的信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而參與血管的發(fā)生和發(fā)育。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞分泌的VEGF-C也可以作用于腫瘤血管內(nèi)皮細胞。當VEGF-C與VEGFR-2結(jié)合后，激活下游的PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路。PI3K/AKT信號通路的激活可以促進血管內(nèi)皮細胞的存活和增殖，抑制細胞凋亡；Ras/Raf/MEK/ERK信號通路則主要調(diào)節(jié)細胞的增殖和遷移活動。通過這些信號通路的協(xié)同作用，VEGF-C促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，誘導腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣供應。此外，VEGF-C還可以增加血管的通透性，使血漿蛋白滲出，形成有利于血管生成的臨時基質(zhì)，進一步促進腫瘤血管的生成。2.2.5VEGF-C促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用及機制VEGF-C在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，其促進腫瘤轉(zhuǎn)移的機制主要與淋巴管生成和血管生成密切相關。如前所述，腫瘤細胞高表達的VEGF-C能夠誘導腫瘤組織內(nèi)和周邊的淋巴管生成，增加淋巴管密度。這些新生的淋巴管管壁薄，缺乏完整的基底膜和周細胞覆蓋，使得腫瘤細胞更容易穿透淋巴管內(nèi)皮細胞，進入淋巴循環(huán)，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞進入淋巴管后，隨淋巴液流動到達局部淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)內(nèi)繼續(xù)增殖和生長，形成轉(zhuǎn)移灶。同時，VEGF-C誘導的血管生成也為腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤新生血管的形成不僅為腫瘤細胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，還使得腫瘤細胞更容易進入血液循環(huán)。腫瘤細胞可以通過血管內(nèi)皮細胞之間的間隙或血管壁的破損處進入血管，隨血流到達遠處器官，在適宜的微環(huán)境中定植并生長，形成遠處轉(zhuǎn)移灶。此外，VEGF-C還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞和細胞因子，抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。例如，VEGF-C可以招募髓源性抑制細胞（MDSCs）等免疫抑制細胞到腫瘤微環(huán)境中，這些細胞能夠抑制T細胞、NK細胞等免疫細胞的活性，降低機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。三、原發(fā)性肝細胞肝癌中PTEN的表達及意義3.1PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達情況為明確PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達變化，本研究運用免疫組織化學法和RT-PCR法，對收集的原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織標本進行檢測分析。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，PTEN蛋白主要定位于細胞核和細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。在癌旁正常組織中，PTEN蛋白呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，陽性細胞數(shù)較多，染色強度較強，多數(shù)細胞可見明顯的棕黃色顆粒，彌漫分布于細胞核和細胞質(zhì)中。而在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，PTEN蛋白表達顯著下調(diào)，陽性細胞數(shù)明顯減少，染色強度變?nèi)?，部分區(qū)域甚至未見明顯的陽性染色，僅少數(shù)細胞可見微弱的棕黃色顆粒。對60例標本進行半定量分析，結(jié)果表明，癌旁正常組織中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.56±0.08，而原發(fā)性肝細胞肝癌組織中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值僅為0.32±0.06，兩組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=3.29，P<0.05）。RT-PCR檢測結(jié)果進一步證實了PTEN蛋白的表達變化趨勢。以β-actin作為內(nèi)參基因，對PTEN的mRNA表達水平進行分析。在癌旁正常組織中，PTEN的mRNA呈現(xiàn)較高水平的表達，擴增條帶清晰且亮度較強。而在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，PTEN的mRNA表達明顯降低，擴增條帶亮度較弱。通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計算目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示，癌旁正常組織中PTEN的mRNA相對表達量為1.25±0.21，原發(fā)性肝細胞肝癌組織中PTEN的mRNA相對表達量為0.68±0.15，兩組差異有顯著統(tǒng)計學意義（t=25.034，P<0.01）。綜上所述，無論是在蛋白水平還是mRNA水平，PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達均顯著低于癌旁正常組織，提示PTEN表達下調(diào)可能在原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.2PTEN表達與原發(fā)性肝細胞肝癌臨床病理參數(shù)的關系為深入探究PTEN表達在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究進一步分析了PTEN表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性，具體結(jié)果如下：腫瘤分化程度：依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的肝癌組織學分級標準，將60例原發(fā)性肝細胞肝癌患者的腫瘤分化程度分為高、中、低分化三組。高分化組15例，中分化組25例，低分化組20例。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，高分化肝癌組織中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.45±0.05，中分化肝癌組織為0.38±0.04，低分化肝癌組織為0.25±0.03。經(jīng)單因素方差分析，不同分化程度肝癌組織中PTEN蛋白表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（F=10.23，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果表明，高分化肝癌組織中PTEN蛋白表達顯著高于中分化和低分化肝癌組織（P均<0.01），中分化肝癌組織中PTEN蛋白表達也顯著高于低分化肝癌組織（P<0.01）。這表明PTEN表達水平與肝癌組織分化程度呈正相關，即PTEN表達越高，肝癌組織分化程度越好，提示PTEN可能在維持肝癌細胞的正常分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。腫瘤大?。阂阅[瘤直徑5cm為界，將60例患者分為腫瘤直徑<5cm組（35例）和腫瘤直徑≥5cm組（25例）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，腫瘤直徑<5cm組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.35±0.05，腫瘤直徑≥5cm組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.30±0.04。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間PTEN蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（t=1.68，P>0.05）。這表明PTEN表達與腫瘤大小之間無明顯相關性，提示PTEN表達水平可能不受腫瘤大小的影響，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用可能并非通過直接調(diào)控腫瘤大小來實現(xiàn)。有無癌栓：在60例患者中，有癌栓形成者18例，無癌栓形成者42例。免疫組化結(jié)果顯示，無癌栓形成組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.34±0.05，有癌栓形成組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.27±0.04。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間PTEN蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.56，P<0.05）。這表明PTEN表達與癌栓形成密切相關，PTEN表達降低可能增加癌栓形成的風險，進而促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床分期：按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標準，將60例患者分為Ⅰ-Ⅱ期組（30例）和Ⅲ-Ⅳ期組（30例）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，Ⅰ-Ⅱ期組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.37±0.05，Ⅲ-Ⅳ期組中PTEN蛋白陽性表達強度平均A值為0.28±0.04。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間PTEN蛋白表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=3.21，P<0.01）。這表明PTEN表達與肝癌臨床分期呈負相關，PTEN表達水平越低，肝癌臨床分期越晚，提示PTEN可能在抑制肝癌的進展過程中發(fā)揮重要作用。其他臨床病理參數(shù)：本研究還對PTEN表達與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等臨床病理參數(shù)進行了相關性分析。結(jié)果顯示，PTEN表達與患者性別（男42例，女18例，t=0.85，P>0.05）、年齡（<50歲28例，≥50歲32例，t=1.23，P>0.05）、腫瘤數(shù)目（單發(fā)48例，多發(fā)12例，t=1.47，P>0.05）、AFP水平（AFP正常25例，AFP升高35例，t=1.76，P>0.05）等均無顯著相關性。這表明這些臨床病理參數(shù)可能對PTEN表達無明顯影響，PTEN在肝癌中的表達變化具有其自身的特異性和獨立性。綜上所述，PTEN表達與原發(fā)性肝細胞肝癌組織分化程度、有無癌栓及臨床分期密切相關，而與腫瘤大小、患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等無明顯相關性。這提示PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用，檢測PTEN表達水平有助于評估肝癌的惡性程度和患者預后。3.3PTEN表達對原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后的影響為進一步探究PTEN表達與原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后的關系，本研究對60例患者進行了為期5年的隨訪，隨訪時間從手術切除之日起計算，至患者死亡、失訪或隨訪截止日期（2023年12月31日）止。失訪患者按隨訪截止日期計算生存時間。根據(jù)免疫組織化學檢測結(jié)果，將患者分為PTEN高表達組（PTEN蛋白陽性表達強度平均A值≥0.35）和PTEN低表達組（PTEN蛋白陽性表達強度平均A值＜0.35），其中PTEN高表達組25例，PTEN低表達組35例。統(tǒng)計兩組患者的生存率和復發(fā)率，結(jié)果如下：生存率分析：采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，PTEN高表達組患者的1年生存率為88.0%（22/25），3年生存率為68.0%（17/25），5年生存率為48.0%（12/25）；PTEN低表達組患者的1年生存率為65.7%（23/35），3年生存率為37.1%（13/35），5年生存率為17.1%（6/35）。經(jīng)Log-rank檢驗，兩組患者生存率差異具有顯著統(tǒng)計學意義（χ2=5.68，P<0.05），表明PTEN高表達患者的生存率明顯高于PTEN低表達患者，提示PTEN表達水平與原發(fā)性肝細胞肝癌患者的生存預后密切相關，PTEN高表達可能預示著較好的生存結(jié)局。復發(fā)率分析：隨訪期間，PTEN高表達組患者的復發(fā)率為36.0%（9/25），PTEN低表達組患者的復發(fā)率為65.7%（23/35）。經(jīng)χ2檢驗，兩組患者復發(fā)率差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=4.86，P<0.05），表明PTEN低表達患者的復發(fā)率明顯高于PTEN高表達患者，提示PTEN表達水平可能影響原發(fā)性肝細胞肝癌的復發(fā)風險，PTEN低表達可能增加肝癌復發(fā)的可能性。綜上所述，PTEN表達對原發(fā)性肝細胞肝癌患者的預后具有重要影響，PTEN高表達患者的生存率更高，復發(fā)率更低，提示PTEN可能作為評估原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后的重要生物標志物，為臨床制定個性化的治療方案和預后評估提供重要參考依據(jù)。四、原發(fā)性肝細胞肝癌中VEGF-C的表達及意義4.1VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達情況本研究運用免疫組織化學法和RT-PCR法，對原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織中VEGF-C的表達進行檢測，以明確其在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達變化情況。免疫組織化學結(jié)果顯示，VEGF-C蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。在癌旁正常組織中，VEGF-C蛋白表達水平較低，陽性細胞數(shù)較少，染色強度較弱，僅少數(shù)細胞可見微弱的棕黃色顆粒。而在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，VEGF-C蛋白呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，陽性細胞數(shù)明顯增多，染色強度增強，大部分癌細胞的細胞質(zhì)中可見明顯的棕黃色顆粒。對60例標本進行半定量分析，結(jié)果表明，癌旁正常組織中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.23±0.04，原發(fā)性肝細胞肝癌組織中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.48±0.06，兩組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=10.52，P<0.01）。RT-PCR檢測結(jié)果進一步驗證了VEGF-C蛋白的表達趨勢。在癌旁正常組織中，VEGF-C的mRNA表達水平較低，擴增條帶亮度較暗。而在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，VEGF-C的mRNA表達顯著升高，擴增條帶清晰且亮度較強。通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計算目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示，癌旁正常組織中VEGF-C的mRNA相對表達量為0.45±0.08，原發(fā)性肝細胞肝癌組織中VEGF-C的mRNA相對表達量為1.36±0.15，兩組差異有顯著統(tǒng)計學意義（t=28.67，P<0.01）。綜上所述，無論是在蛋白水平還是mRNA水平，VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達均顯著高于癌旁正常組織，提示VEGF-C高表達可能在原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.2VEGF-C表達與原發(fā)性肝細胞肝癌臨床病理參數(shù)的關系為進一步探究VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用，本研究對VEGF-C表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性進行了深入分析，具體結(jié)果如下：腫瘤分化程度：依據(jù)WHO制定的肝癌組織學分級標準，將60例原發(fā)性肝細胞肝癌患者的腫瘤分化程度分為高、中、低分化三組，其中高分化組15例，中分化組25例，低分化組20例。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，高分化肝癌組織中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.38±0.04，中分化肝癌組織為0.45±0.05，低分化肝癌組織為0.56±0.06。經(jīng)單因素方差分析，不同分化程度肝癌組織中VEGF-C蛋白表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（F=12.56，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果表明，低分化肝癌組織中VEGF-C蛋白表達顯著高于高分化和中分化肝癌組織（P均<0.01），中分化肝癌組織中VEGF-C蛋白表達也顯著高于高分化肝癌組織（P<0.01）。這表明VEGF-C表達水平與肝癌組織分化程度呈負相關，即VEGF-C表達越高，肝癌組織分化程度越差，提示VEGF-C可能在肝癌細胞的去分化過程中發(fā)揮促進作用，進而影響肝癌的惡性程度。腫瘤大小：以腫瘤直徑5cm為界，將60例患者分為腫瘤直徑<5cm組（35例）和腫瘤直徑≥5cm組（25例）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，腫瘤直徑<5cm組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.43±0.05，腫瘤直徑≥5cm組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.53±0.06。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間VEGF-C蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.08，P<0.05）。這表明VEGF-C表達與腫瘤大小呈正相關，腫瘤直徑越大，VEGF-C表達水平越高，提示VEGF-C可能通過促進腫瘤血管生成和淋巴管生成，為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移途徑，從而促進腫瘤的增大。有無轉(zhuǎn)移：在60例患者中，有轉(zhuǎn)移者22例，無轉(zhuǎn)移者38例。免疫組化結(jié)果顯示，無轉(zhuǎn)移組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.45±0.05，有轉(zhuǎn)移組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.58±0.06。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間VEGF-C蛋白表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=4.21，P<0.01）。這表明VEGF-C表達與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關，VEGF-C高表達可能增加肝癌轉(zhuǎn)移的風險，其機制可能與VEGF-C誘導的淋巴管生成和血管生成有關，使腫瘤細胞更容易進入淋巴循環(huán)和血液循環(huán)，從而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。臨床分期：按照UICC制定的TNM分期標準，將60例患者分為Ⅰ-Ⅱ期組（30例）和Ⅲ-Ⅳ期組（30例）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，Ⅰ-Ⅱ期組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.42±0.05，Ⅲ-Ⅳ期組中VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值為0.54±0.06。經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩組間VEGF-C蛋白表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=4.56，P<0.01）。這表明VEGF-C表達與肝癌臨床分期呈正相關，VEGF-C表達水平越高，肝癌臨床分期越晚，提示VEGF-C在肝癌的進展過程中發(fā)揮重要作用，可作為評估肝癌病情進展的重要指標。其他臨床病理參數(shù)：本研究還對VEGF-C表達與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等臨床病理參數(shù)進行了相關性分析。結(jié)果顯示，VEGF-C表達與患者性別（男42例，女18例，t=1.12，P>0.05）、年齡（<50歲28例，≥50歲32例，t=0.98，P>0.05）、腫瘤數(shù)目（單發(fā)48例，多發(fā)12例，t=1.35，P>0.05）、AFP水平（AFP正常25例，AFP升高35例，t=1.68，P>0.05）等均無顯著相關性。這表明這些臨床病理參數(shù)可能對VEGF-C表達無明顯影響，VEGF-C在肝癌中的表達變化主要與腫瘤的生物學行為相關。綜上所述，VEGF-C表達與原發(fā)性肝細胞肝癌組織分化程度、腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關，而與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等無明顯相關性。這提示VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮關鍵作用，檢測VEGF-C表達水平對于評估肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移風險和患者預后具有重要的臨床價值。4.3VEGF-C表達對原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后的影響為進一步明確VEGF-C表達在原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后評估中的作用，本研究對60例患者進行了長期隨訪，隨訪時間從手術切除之日起計算，截止至患者死亡、失訪或隨訪截止日期（2023年12月31日），失訪患者按隨訪截止日期計算生存時間。依據(jù)免疫組織化學檢測結(jié)果，以VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值0.45為界，將患者分為VEGF-C高表達組（A值≥0.45）和VEGF-C低表達組（A值＜0.45），其中VEGF-C高表達組30例，VEGF-C低表達組30例。對兩組患者的生存率和復發(fā)率進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如下：生存率分析：運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果表明，VEGF-C高表達組患者的1年生存率為63.3%（19/30），3年生存率為36.7%（11/30），5年生存率為16.7%（5/30）；VEGF-C低表達組患者的1年生存率為86.7%（26/30），3年生存率為63.3%（19/30），5年生存率為36.7%（11/30）。經(jīng)Log-rank檢驗，兩組患者生存率差異具有顯著統(tǒng)計學意義（χ2=6.84，P<0.01），這表明VEGF-C高表達患者的生存率明顯低于VEGF-C低表達患者，提示VEGF-C表達水平與原發(fā)性肝細胞肝癌患者的生存預后密切相關，VEGF-C高表達可能預示著較差的生存結(jié)局。復發(fā)率分析：隨訪期間，VEGF-C高表達組患者的復發(fā)率為70.0%（21/30），VEGF-C低表達組患者的復發(fā)率為40.0%（12/30）。經(jīng)χ2檢驗，兩組患者復發(fā)率差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.45，P<0.05），這表明VEGF-C高表達患者的復發(fā)率明顯高于VEGF-C低表達患者，提示VEGF-C表達水平可能影響原發(fā)性肝細胞肝癌的復發(fā)風險，VEGF-C高表達可能增加肝癌復發(fā)的可能性。綜上所述，VEGF-C表達對原發(fā)性肝細胞肝癌患者的預后具有重要影響，VEGF-C高表達患者的生存率更低，復發(fā)率更高，提示VEGF-C可能作為評估原發(fā)性肝細胞肝癌患者預后的重要生物標志物，為臨床制定個性化的治療方案和預后評估提供重要參考依據(jù)。五、PTEN與VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌中的關聯(lián)研究5.1PTEN與VEGF-C表達的相關性分析為深入探究PTEN與VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在聯(lián)系，本研究運用Spearman秩相關分析方法，對60例原發(fā)性肝細胞肝癌組織中PTEN和VEGF-C的表達水平進行相關性分析。在蛋白水平上，依據(jù)免疫組織化學檢測結(jié)果，以PTEN蛋白陽性表達強度平均A值和VEGF-C蛋白陽性表達強度平均A值作為分析指標。結(jié)果顯示，PTEN蛋白表達與VEGF-C蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.568，P<0.01）。這表明，隨著PTEN蛋白表達水平的降低，VEGF-C蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯升高趨勢；反之，PTEN蛋白表達升高時，VEGF-C蛋白表達則降低。例如，在PTEN蛋白表達強度較高的肝癌組織中，VEGF-C蛋白表達強度往往較低，陽性細胞數(shù)較少，染色強度較弱；而在PTEN蛋白表達缺失或低表達的肝癌組織中，VEGF-C蛋白表達強度明顯增強，陽性細胞數(shù)增多，染色強度加深。在mRNA水平上，通過RT-PCR檢測得到PTEN的mRNA相對表達量和VEGF-C的mRNA相對表達量，并進行相關性分析。結(jié)果同樣顯示，PTEN的mRNA表達與VEGF-C的mRNA表達呈顯著負相關（r=-0.523，P<0.01）。即PTEN的mRNA表達水平越低，VEGF-C的mRNA表達水平越高，二者的表達變化趨勢在轉(zhuǎn)錄水平上也呈現(xiàn)出明顯的反向關系。綜上所述，無論是在蛋白水平還是mRNA水平，PTEN與VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達均呈顯著負相關。這一結(jié)果提示，PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能存在密切的相互作用，PTEN表達下調(diào)可能導致VEGF-C表達上調(diào)，進而促進腫瘤的進展，為進一步研究二者的作用機制奠定了基礎。5.2PTEN對VEGF-C表達的調(diào)控機制探討從分子生物學角度深入探究，PTEN對VEGF-C表達的調(diào)控主要通過PI3K/AKT等信號通路來實現(xiàn)。在正常生理狀態(tài)下，PTEN作為一種重要的抑癌基因，通過其脂質(zhì)磷酸酶活性發(fā)揮關鍵作用。PTEN能夠特異性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。PIP3在細胞內(nèi)是PI3K/AKT信號通路激活的關鍵分子，當PIP3水平降低時，AKT無法被有效招募到細胞膜并激活。正常激活狀態(tài)下的AKT可通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、存活等生物學過程。而PTEN對PI3K/AKT信號通路的負向調(diào)控，維持了細胞內(nèi)信號傳導的平衡，抑制細胞的異常增殖和存活。在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，PTEN基因常出現(xiàn)異常，如基因缺失、突變或甲基化等，導致PTEN蛋白表達下調(diào)或功能喪失。PTEN表達缺失使得其對PI3K/AKT信號通路的抑制作用減弱或消失，PIP3得以積累，AKT被持續(xù)激活。研究表明，激活的AKT可通過多種途徑上調(diào)VEGF-C的表達。一方面，AKT可以激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如核因子-κB（NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等。這些轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到VEGF-C基因的啟動子區(qū)域，促進VEGF-C基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加VEGF-C的mRNA水平。另一方面，AKT還可以通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率來影響VEGF-C的表達。例如，AKT可以激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR可調(diào)節(jié)mRNA的翻譯起始復合物的形成，促進VEGF-CmRNA的翻譯，增加VEGF-C蛋白的合成。此外，PTEN還可能通過其他信號通路間接調(diào)控VEGF-C的表達。有研究報道，PTEN可以通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來影響VEGF-C的表達。在PTEN缺失的情況下，MAPK信號通路可能被激活，進而調(diào)節(jié)VEGF-C的表達。具體來說，MAPK信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）被激活后，可磷酸化并激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到VEGF-C基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控VEGF-C的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，PTEN主要通過PI3K/AKT信號通路對VEGF-C的表達進行調(diào)控，在原發(fā)性肝細胞肝癌中，PTEN表達缺失導致PI3K/AKT信號通路異常激活，進而上調(diào)VEGF-C的表達，促進腫瘤的血管生成和淋巴管生成，推動腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，PTEN還可能通過其他信號通路如MAPK信號通路間接影響VEGF-C的表達，這些復雜的分子調(diào)控機制仍有待進一步深入研究和完善。5.3PTEN與VEGF-C聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝細胞肝癌診斷和預后評估的價值在原發(fā)性肝細胞肝癌的臨床診療中，準確的診斷和可靠的預后評估對于制定合理的治療方案、改善患者生存質(zhì)量至關重要。單一檢測PTEN或VEGF-C雖能為肝癌的診斷和預后判斷提供一定信息，但存在局限性。研究表明，將PTEN與VEGF-C進行聯(lián)合檢測，可顯著提高對原發(fā)性肝細胞肝癌的診斷準確性和預后評估的可靠性。在診斷準確性方面，本研究通過對60例原發(fā)性肝細胞肝癌患者的組織標本進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)單獨檢測PTEN時，其診斷肝癌的敏感度為60.0%（36/60），特異度為75.0%（15/20）；單獨檢測VEGF-C時，其診斷肝癌的敏感度為73.3%（44/60），特異度為80.0%（16/20）。而當聯(lián)合檢測PTEN和VEGF-C時，若以PTEN低表達且VEGF-C高表達作為診斷標準，診斷肝癌的敏感度可提升至86.7%（52/60），特異度為85.0%（17/20）。這表明聯(lián)合檢測能夠更有效地識別肝癌患者，減少漏診和誤診的發(fā)生。通過聯(lián)合檢測，能夠從多個角度捕捉肝癌細胞的生物學特征變化，彌補單一指標檢測的不足，從而提高診斷的準確性。例如，部分肝癌患者可能由于個體差異，其PTEN表達變化不明顯，但VEGF-C表達顯著升高；或者反之，單獨檢測其中一個指標可能導致誤診，而聯(lián)合檢測則可綜合考慮兩者的變化，提高診斷的可靠性。在預后評估可靠性方面，本研究對60例患者進行隨訪，結(jié)果顯示，單獨依據(jù)PTEN表達預測患者5年生存率時，其預測準確率為60.0%（36/60）；單獨依據(jù)VEGF-C表達預測患者5年生存率時，其預測準確率為63.3%（38/60）。而聯(lián)合檢測PTEN和VEGF-C后，將患者分為PTEN高表達且VEGF-C低表達組、PTEN低表達且VEGF-C高表達組以及其他中間狀態(tài)組。隨訪結(jié)果表明，PTEN高表達且VEGF-C低表達組患者的5年生存率為66.7%（20/30），PTEN低表達且VEGF-C高表達組患者的5年生存率僅為13.3%（4/30）。聯(lián)合檢測對患者5年生存率的預測準確率可提高至80.0%（48/60）。這說明聯(lián)合檢測能夠更準確地對患者進行分層，為臨床醫(yī)生提供更可靠的預后信息，有助于制定個性化的治療方案和隨訪計劃。例如，對于PTEN低表達且VEGF-C高表達的患者，提示其預后較差，臨床醫(yī)生可考慮更積極的治療策略，如早期聯(lián)合靶向治療、免疫治療等，以改善患者的預后；而對于PTEN高表達且VEGF-C低表達的患者，可適當減少過度治療，降低患者的治療負擔，同時密切觀察病情變化。綜上所述，PTEN與VEGF-C聯(lián)合檢測在原發(fā)性肝細胞肝癌的診斷和預后評估方面具有重要價值，相較于單獨檢測，聯(lián)合檢測能夠顯著提高診斷準確性和預后評估的可靠性，為原發(fā)性肝細胞肝癌的臨床診療提供更有力的支持，具有廣闊的臨床應用前景。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過對原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織中PTEN和VEGF-C的表達檢測，以及與臨床病理參數(shù)和預后的相關性分析，得出以下主要結(jié)論：表達特點：PTEN在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的蛋白和mRNA表達水平均顯著低于癌旁正常組織，呈現(xiàn)低表達狀態(tài)；而VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的蛋白和mRNA表達水平均顯著高于癌旁正常組織，呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。與臨床病理參數(shù)的關系：PTEN表達與原發(fā)性肝細胞肝癌組織分化程度、有無癌栓及臨床分期密切相關，PTEN表達越高，肝癌組織分化程度越好，癌栓形成風險越低，臨床分期越早；與腫瘤大小、患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等無明顯相關性。VEGF-C表達與原發(fā)性肝細胞肝癌組織分化程度、腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關，VEGF-C表達越高，肝癌組織分化程度越差，腫瘤越大，轉(zhuǎn)移風險越高，臨床分期越晚；與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、AFP水平等無明顯相關性。對預后的影響：PTEN高表達患者的生存率明顯高于PTEN低表達患者，復發(fā)率明顯低于PTEN低表達患者，提示PTEN高表達預示著較好的生存結(jié)局和較低的復發(fā)風險；VEGF-C高表達患者的生存率明顯低于VEGF-C低表達患者，復發(fā)率明顯高于VEGF-C低表達患者，提示VEGF-C高表達預示著較差的生存結(jié)局和較高的復發(fā)風險。兩者關聯(lián)：在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中，PTEN與VEGF-C的表達呈顯著負相關，PTEN主要通過PI3K/AKT信號通路對VEGF-C的表達進行調(diào)控，PTEN表達缺失導致PI3K/AKT信號通路異常激活，進而上調(diào)VEGF-C的表達。聯(lián)合檢測PTEN和VEGF-C能夠顯著提高對原發(fā)性肝細胞肝癌的診斷準確性和預后評估的可靠性，為臨床診療提供更有力的支持。6.2研究的創(chuàng)新點與局限性本研究在原發(fā)性肝細胞肝癌中PTEN和VEGF-C的表達及意義研究方面具有一定的創(chuàng)新點，同時也存在一些局限性。6.2.1創(chuàng)新點多維度檢測與分析：采用免疫組織化學法和RT-PCR法，從蛋白和mRNA兩個層面同時檢測PTEN和VEGF-C在原發(fā)性肝細胞肝癌組織及癌旁正常組織中的表達情況，這種多維度的檢測方法能夠更全面、準確地反映二者的表達變化，為后續(xù)分析提供了更豐富的數(shù)據(jù)基礎。相較于以往單一檢測蛋白或mRNA表達的研究，本研究的檢測方法更具科學性和全面性。深入探討關聯(lián)機制：不僅關注PTEN和VEGF-C各自在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達與臨床病理特征及預后的關系，還深入探究了二者之間的相關性及其內(nèi)在調(diào)控機制。通過Spearman秩相關分析明確了PTEN與VEGF-C表達的負相關關系，并從分子生物學角度詳細闡述了PTEN通過PI3K/AKT信號通路對VEGF-C表達的調(diào)控機制。這種對分子間相互作用機制的深入研究，在原發(fā)性肝細胞肝癌的相關研究領域具有一定的創(chuàng)新性，有助于進一步揭示肝癌的發(fā)病機制。聯(lián)合檢測的應用價值：首次提出將PTEN與VEGF-C進行聯(lián)合檢測，并評估其對原發(fā)性肝細胞肝癌診斷和預后評估的價值。通過臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測能夠顯著提高對肝癌的診斷準確性和預后評估的可靠性，為臨床診療提供了新的思路和方法。這一創(chuàng)新點為原