WWOX基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞耐藥性的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在肺癌的眾多亞型中，肺腺癌約占所有肺癌的40％，是最為常見(jiàn)的類型之一。近年來(lái)，盡管在肺癌的早期診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但肺腺癌患者的總體預(yù)后仍然不理想。化療作為肺腺癌綜合治療的重要組成部分，在一定程度上能夠緩解患者的癥狀、延長(zhǎng)生存期。然而，藥物耐藥性問(wèn)題的出現(xiàn)，卻成為了有效治療肺腺癌的巨大阻礙。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療藥物無(wú)法有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致化療失敗，這是肺腺癌治療過(guò)程中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。一旦出現(xiàn)耐藥，患者往往需要更換化療方案，這不僅增加了治療成本和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能帶來(lái)更多的不良反應(yīng)，降低患者的生活質(zhì)量。據(jù)相關(guān)研究表明，肺腺癌患者在化療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥的比例較高，且耐藥的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的改變。因此，深入探究肺腺癌化療耐藥的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)于提高肺腺癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。WWOX（WWdomain-containingoxidoreductase）作為一種腫瘤抑制基因，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。已有研究表明，WWOX與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等。在肺癌中，WWOX的表達(dá)水平與惡性程度呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，WWOX在肺癌化療中也發(fā)揮著重要作用，可能參與了肺腺癌化療耐藥的過(guò)程。A549是一種人類肺腺癌細(xì)胞系，因其具有典型的肺腺癌特征，常用于肺癌耐藥研究中。通過(guò)對(duì)A549細(xì)胞系的研究，能夠深入了解肺腺癌的生物學(xué)行為和耐藥機(jī)制。本研究旨在探究WWOX與肺腺癌A549耐藥之間的相關(guān)性，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，明確WWOX基因在肺腺癌A549細(xì)胞耐藥發(fā)生過(guò)程中的作用及其機(jī)制。這不僅有助于我們從分子層面深入理解肺腺癌化療耐藥的本質(zhì)，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)，還可能為肺腺癌患者帶來(lái)新的治療希望，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究WWOX基因在肺腺癌A549細(xì)胞耐藥發(fā)生過(guò)程中的具體作用及其內(nèi)在機(jī)制，為解決肺腺癌化療耐藥問(wèn)題提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，通過(guò)構(gòu)建肺腺癌A549耐藥細(xì)胞系，對(duì)比耐藥細(xì)胞與非耐藥細(xì)胞中WWOX基因的表達(dá)差異，明確WWOX基因表達(dá)與A549細(xì)胞耐藥性之間的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步運(yùn)用基因編輯技術(shù)，調(diào)控WWOX基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平，觀察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而全面解析WWOX基因在肺腺癌A549細(xì)胞耐藥中的作用。同時(shí)，通過(guò)深入研究WWOX基因參與的信號(hào)通路和分子機(jī)制，揭示其在肺腺癌耐藥過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是聚焦于WWOX基因這一相對(duì)較新的研究靶點(diǎn)，目前針對(duì)WWOX基因在肺腺癌A549耐藥方面的研究仍相對(duì)較少，本研究有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為肺腺癌耐藥機(jī)制的研究提供新的視角。二是采用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如基因編輯技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，從基因、蛋白和細(xì)胞水平多個(gè)層面深入探究WWOX基因與肺腺癌A549耐藥的相關(guān)性，使研究結(jié)果更加全面、深入和可靠。三是本研究不僅關(guān)注WWOX基因在肺腺癌A549耐藥中的作用機(jī)制，還將進(jìn)一步探索其作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性，為開(kāi)發(fā)針對(duì)肺腺癌化療耐藥的新型治療策略提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1WWOX基因概述WWOX基因，全稱WilmstumorgeneontheXchromosome，定位于人類染色體16q23.1區(qū)域。該基因具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其編碼的蛋白質(zhì)包含兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）結(jié)構(gòu)域。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了WWOX蛋白多種生物學(xué)功能，使其在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著重要角色。WWOX基因編碼的WWOX蛋白廣泛分布于人體的各種組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。在細(xì)胞核內(nèi)，WWOX蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及DNA損傷修復(fù)等重要過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素如紫外線、化學(xué)物質(zhì)等的刺激，導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，WWOX蛋白能夠被激活，參與到DNA損傷修復(fù)的信號(hào)通路中，通過(guò)與相關(guān)的修復(fù)蛋白相互作用，促進(jìn)損傷DNA的修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性。若WWOX基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，可能導(dǎo)致DNA損傷無(wú)法及時(shí)修復(fù)，增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞質(zhì)中，WWOX蛋白也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它參與細(xì)胞的增殖、分化以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制等過(guò)程。正常情況下，WWOX蛋白能夠抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖，促進(jìn)細(xì)胞向正常的方向分化。在腫瘤細(xì)胞中，WWOX蛋白的表達(dá)往往受到抑制，使得細(xì)胞失去了正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和惡性轉(zhuǎn)化。大量的研究表明，WWOX基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用，被認(rèn)為是一個(gè)重要的抑癌基因。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，WWOX基因的表達(dá)缺失與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。當(dāng)WWOX基因表達(dá)缺失時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，患者的生存率也明顯降低。在結(jié)腸癌中，WWOX基因能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，發(fā)揮其抑癌作用。通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)WWOX基因的表達(dá)可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而下調(diào)WWOX基因的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在胃癌中，WWOX基因的低表達(dá)也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且WWOX基因表達(dá)水平越低，患者的預(yù)后越差。這些研究結(jié)果均表明，WWOX基因在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的抑制作用，其表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一。2.2肺腺癌A549細(xì)胞系與耐藥機(jī)制A549細(xì)胞系是一種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，于1972年由D.J.Giard等人從一名58歲白人男性的肺癌組織中通過(guò)外植體培養(yǎng)建立。該細(xì)胞系具有上皮細(xì)胞特性，在體外培養(yǎng)時(shí)通常以單層細(xì)胞形式附著在培養(yǎng)瓶上生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出典型的多邊形或梭形形態(tài)，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)豐富。A549細(xì)胞還具有快速增殖的能力，這使得其非常適合用于實(shí)驗(yàn)室的連續(xù)培養(yǎng)和各種實(shí)驗(yàn)操作，能夠?yàn)檠芯刻峁┏渥愕募?xì)胞樣本。此外，A549細(xì)胞表達(dá)多種與肺癌相關(guān)的標(biāo)記物，如癌胚抗原（CEA）、LewisX抗原等，這些標(biāo)記物的存在使A549細(xì)胞成為研究肺癌相關(guān)標(biāo)記物在腫瘤發(fā)展中作用的理想模型。由于其具有這些特性，A549細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于肺癌的病理生理學(xué)研究、藥物篩選、環(huán)境毒理學(xué)以及免疫治療等多個(gè)領(lǐng)域，是肺癌研究中最常用的細(xì)胞模型之一。肺腺癌化療耐藥是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種機(jī)制，這些機(jī)制相互交織，共同影響著腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。藥物外排增加是導(dǎo)致肺腺癌化療耐藥的重要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞中存在一類ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，其中P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等在耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。P-gp是最早被發(fā)現(xiàn)的與多藥耐藥相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在肺腺癌A549耐藥細(xì)胞系中，P-gp的表達(dá)明顯上調(diào)，其高表達(dá)與A549細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥性呈正相關(guān)。MRP同樣可以將化療藥物及其代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥。BCRP則主要負(fù)責(zé)將一些親脂性化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，影響細(xì)胞內(nèi)藥物的積聚，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。藥物代謝異常也在肺腺癌化療耐藥中起著重要作用。細(xì)胞內(nèi)的藥物代謝酶系統(tǒng)對(duì)化療藥物的代謝過(guò)程產(chǎn)生重要影響。細(xì)胞色素P450酶系（CYP450）是一類重要的藥物代謝酶，其中某些亞型如CYP3A4、CYP2C9等在肺腺癌中參與化療藥物的代謝。例如，CYP3A4能夠代謝環(huán)磷酰胺、多西他賽等化療藥物，使其活性降低。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中CYP3A4等藥物代謝酶的表達(dá)或活性發(fā)生改變時(shí)，化療藥物的代謝速度會(huì)加快或減慢，從而影響藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度和作用效果，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）也是一類重要的藥物代謝酶，它能夠催化谷胱甘肽與化療藥物結(jié)合，增加藥物的水溶性，促進(jìn)藥物排出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞凋亡通路異常是肺腺癌化療耐藥的另一個(gè)重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及化療藥物的作用中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗癌作用。然而，在耐藥的肺腺癌A549細(xì)胞中，凋亡通路常常出現(xiàn)異常。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2和Bcl-XL等具有抗凋亡作用，而Bax和Bak等則具有促凋亡作用。在肺腺癌耐藥細(xì)胞中，Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達(dá)往往上調(diào)，它們能夠抑制線粒體膜電位的下降，阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻斷凋亡信號(hào)通路的激活，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，當(dāng)caspase的活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡無(wú)法正常進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。一些研究還發(fā)現(xiàn)，生存素（Survivin）等凋亡抑制蛋白在肺腺癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，它們通過(guò)抑制caspase的活性，干擾細(xì)胞凋亡過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥。DNA損傷修復(fù)機(jī)制的異常也與肺腺癌化療耐藥密切相關(guān)?；熕幬锏闹饕饔脵C(jī)制之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞增殖。然而，腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的DNA損傷修復(fù)能力，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制被激活，包括堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）、錯(cuò)配修復(fù)（MMR）和同源重組修復(fù)（HR）等。在肺腺癌A549耐藥細(xì)胞中，這些DNA損傷修復(fù)途徑可能發(fā)生異常改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，從而使細(xì)胞得以存活并產(chǎn)生耐藥性。例如，NER途徑中的關(guān)鍵蛋白如切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）等的表達(dá)上調(diào)，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物引起的DNA損傷的修復(fù)能力，使細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。MMR系統(tǒng)負(fù)責(zé)識(shí)別和修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)配堿基，如果MMR功能缺陷，腫瘤細(xì)胞可能無(wú)法有效地修復(fù)化療藥物導(dǎo)致的DNA損傷，從而增加基因突變的頻率，促進(jìn)耐藥的發(fā)生。2.3WWOX與肺腺癌耐藥相關(guān)性研究現(xiàn)狀近年來(lái)，關(guān)于WWOX與肺腺癌耐藥相關(guān)性的研究逐漸成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究表明，WWOX基因在肺腺癌耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)異常與肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌耐藥細(xì)胞系中，WWOX基因的表達(dá)水平明顯低于敏感細(xì)胞系。通過(guò)對(duì)A549細(xì)胞及其順鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP的研究發(fā)現(xiàn)，A549/DDP細(xì)胞中WWOX基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)WWOX基因的表達(dá)可以增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而下調(diào)WWOX基因的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致A549細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，凋亡受到抑制。這表明WWOX基因的低表達(dá)可能是導(dǎo)致肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的重要原因之一。在分子機(jī)制方面，研究人員發(fā)現(xiàn)WWOX基因可能通過(guò)多種信號(hào)通路參與肺腺癌的耐藥過(guò)程。有研究表明，WWOX可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，降低腫瘤細(xì)胞的增殖和存活能力，從而增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。當(dāng)WWOX基因表達(dá)缺失時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。WWOX還可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等參與肺腺癌的耐藥過(guò)程。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。WWOX可以與p53相互作用，增強(qiáng)p53的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在肺腺癌耐藥細(xì)胞中，WWOX基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致p53信號(hào)通路受到抑制，細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。NF-κB信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和耐藥等多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。WWOX可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。當(dāng)WWOX基因表達(dá)缺失時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥。盡管目前關(guān)于WWOX與肺腺癌耐藥相關(guān)性的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。大多數(shù)研究主要集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體外模型上，缺乏在體內(nèi)動(dòng)物模型和臨床樣本中的驗(yàn)證，使得研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用受到限制。對(duì)于WWOX基因參與肺腺癌耐藥的具體分子機(jī)制尚未完全明確，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與之相關(guān)的信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路之間的相互作用以及WWOX基因在其中的精確調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。目前針對(duì)WWOX基因的靶向治療策略還處于探索階段，如何開(kāi)發(fā)安全有效的WWOX基因調(diào)節(jié)劑，使其能夠應(yīng)用于臨床治療肺腺癌耐藥，仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。三、研究設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本研究采用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。A549細(xì)胞具有上皮細(xì)胞特性，在體外培養(yǎng)時(shí)呈貼壁生長(zhǎng)，可穩(wěn)定傳代，常用于肺癌相關(guān)研究，能夠?yàn)樘骄縒WOX與肺腺癌耐藥相關(guān)性提供理想的細(xì)胞模型。將其復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。主要試劑包括：RNA提取試劑盒（Qiagen公司），用于提取細(xì)胞中的總RNA，其采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能高效、快速地從各種生物樣品中提取高質(zhì)量的RNA，為后續(xù)的基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)提供可靠的樣本；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，該試劑盒包含高效的逆轉(zhuǎn)錄酶和優(yōu)化的反應(yīng)體系，能保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的高效性和準(zhǔn)確性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），用于檢測(cè)WWOX基因及相關(guān)耐藥基因的mRNA表達(dá)水平，基于SYBRGreen熒光染料法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可精確測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量；蛋白質(zhì)提取試劑盒（Beyotime公司），能夠從細(xì)胞中提取總蛋白，其裂解液配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可有效裂解細(xì)胞并保持蛋白的完整性；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyotime公司），用于測(cè)定提取蛋白的濃度，采用BCA法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠；兔抗人WWOX多克隆抗體、鼠抗人P-gp單克隆抗體、鼠抗人MRP單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體（Abcam公司），這些抗體具有高特異性和親和力，可用于后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearch公司），作為二抗用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，與一抗結(jié)合后，通過(guò)HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)；MTT試劑（Sigma公司），用于細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚的原理，通過(guò)比色法間接反映活細(xì)胞的數(shù)量；DMSO（Sigma公司），用于溶解MTT結(jié)晶以及配制藥物工作液，是一種常用的有機(jī)溶劑，具有良好的溶解性和化學(xué)穩(wěn)定性；順鉑（DDP，Selleck公司），作為化療藥物用于誘導(dǎo)A549細(xì)胞耐藥，可與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。主要儀器設(shè)備有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，為細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)和狀態(tài)，便于及時(shí)掌握細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司），可在低溫條件下進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞沉淀、蛋白質(zhì)和核酸提取等實(shí)驗(yàn)步驟，保證生物樣品的活性和穩(wěn)定性；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，具備精確的溫度控制和快速的升降溫速度，確保反應(yīng)的準(zhǔn)確性和高效性；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對(duì)PCR產(chǎn)物電泳后的凝膠進(jìn)行成像分析，可清晰顯示DNA條帶，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定性和定量分析；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的吸光度值，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖活性，具有高精度和快速檢測(cè)的特點(diǎn)；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)進(jìn)行免疫檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中HRP催化底物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的可視化檢測(cè)和定量分析。3.2A549耐藥細(xì)胞系構(gòu)建采用濃度梯度遞增聯(lián)合間歇誘導(dǎo)法構(gòu)建A549耐藥細(xì)胞系。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔加入含低濃度紫杉醇（0.01μg/mL）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基2mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。紫杉醇是一種廣泛應(yīng)用于肺癌化療的藥物，通過(guò)與微管蛋白結(jié)合，抑制微管解聚，從而影響細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，發(fā)揮抗癌作用，但腫瘤細(xì)胞容易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。在這48h的培養(yǎng)過(guò)程中，部分對(duì)紫杉醇敏感的細(xì)胞會(huì)受到藥物的抑制作用，生長(zhǎng)速度減緩甚至死亡，而具有一定耐藥潛能的細(xì)胞則可能存活下來(lái)。48h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡的情況，棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，以徹底去除殘留的紫杉醇。加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h，讓細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。這一恢復(fù)培養(yǎng)的過(guò)程對(duì)于細(xì)胞的后續(xù)誘導(dǎo)至關(guān)重要，它可以使存活下來(lái)的細(xì)胞調(diào)整自身的生理狀態(tài)，增強(qiáng)對(duì)紫杉醇的耐受性。按照上述方法，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，每7-10天增加一次紫杉醇的濃度（每次增加0.01-0.02μg/mL），持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。隨著誘導(dǎo)次數(shù)的增加和紫杉醇濃度的逐步升高，細(xì)胞不斷受到藥物的選擇壓力。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化，如藥物外排泵表達(dá)增加、藥物代謝酶活性改變、凋亡通路異常以及DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)等，這些變化使得細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性逐漸增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞能夠在紫杉醇濃度為0.5μg/mL的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，表明A549耐藥細(xì)胞系初步構(gòu)建成功。將該耐藥細(xì)胞系命名為A549/Taxol，繼續(xù)在含0.5μg/mL紫杉醇的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3-5次，以鞏固其耐藥性，確保耐藥細(xì)胞系的穩(wěn)定性。在整個(gè)構(gòu)建過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)速度、貼壁能力等生物學(xué)特性的變化，并與親本A549細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。A549/Taxol細(xì)胞的形態(tài)可能會(huì)發(fā)生改變，如變得更加細(xì)長(zhǎng)或不規(guī)則，生長(zhǎng)速度可能會(huì)比親本細(xì)胞慢，貼壁能力也可能有所下降。通過(guò)定期檢測(cè)細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)（resistanceindex，RI），評(píng)估耐藥細(xì)胞系的耐藥程度。RI的計(jì)算方法為耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）與親本細(xì)胞的IC50之比，RI值越大，表明細(xì)胞的耐藥性越強(qiáng)。當(dāng)A549/Taxol細(xì)胞的RI值穩(wěn)定且明顯高于親本A549細(xì)胞時(shí)，確認(rèn)A549耐藥細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.3WWOX基因表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)WWOX基因mRNA表達(dá)水平。使用RNA提取試劑盒從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和構(gòu)建成功的A549/Taxol耐藥細(xì)胞中提取總RNA。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，用PBS清洗2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入適量的RNA裂解液，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)。通過(guò)一系列離心、洗滌等操作，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終獲得高純度的總RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的步驟，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。這一過(guò)程需要在特定的溫度條件下進(jìn)行，以確保逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。使用的引物序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，WWOX基因上游引物序列為5'-AGCTCCAACATCCTGCTGTC-3'，下游引物序列為5'-CCATCAGCTGCTTCTTCCAC-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs和TaqDNA聚合酶等成分，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)中，通過(guò)檢測(cè)SYBRGreen熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值），采用2-ΔΔCt法計(jì)算WWOX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與模板的起始拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因的Ct值，并結(jié)合內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，計(jì)算出ΔCt和ΔΔCt值，進(jìn)而得出WWOX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估WWOX基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)差異。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)WWOX蛋白表達(dá)水平。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕搖晃，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，確保細(xì)胞完全裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000r/min條件下離心15min，離心力的作用可以使細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)沉淀到離心管底部，而蛋白質(zhì)則存在于上清液中。取上清液，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說(shuō)明書的步驟，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30min，使蛋白質(zhì)與BCA試劑充分反應(yīng)，形成紫色絡(luò)合物。然后用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性，便于后續(xù)的電泳分離。取等量的蛋白樣品（通常為30-50μg）進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)目的蛋白WWOX的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般采用10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。在電泳過(guò)程中，先在80V恒壓下電泳30min，使蛋白質(zhì)在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，約需1-2h。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min，使凝膠中的蛋白質(zhì)能夠更好地轉(zhuǎn)移到固相膜上。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜裝置按照從下到上的順序依次為：負(fù)極（石墨電極）、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、正極（石墨電極）。在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1-2h，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中需要在冰浴中進(jìn)行，以避免溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人WWOX多克隆抗體（稀釋比例為1:1000）中，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與目的蛋白WWOX特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液）洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000）中，室溫孵育1h，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，采用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白的條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算WWOX蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX蛋白的表達(dá)差異。3.4耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入200μL，即每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔加入含不同濃度順鉑（0、0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/mL）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基200μL，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，只加入培養(yǎng)基，不加細(xì)胞，用于校正酶標(biāo)儀的零點(diǎn)。將96孔板繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。順鉑是一種常用的化療藥物，能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在這48h的培養(yǎng)過(guò)程中，順鉑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。MTT是一種黃色的四氮唑鹽，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死細(xì)胞則無(wú)此功能。因此，通過(guò)檢測(cè)甲瓚的生成量，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。4h后，小心棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。DMSO是一種有機(jī)溶劑，能夠溶解甲瓚，使其形成均一的溶液，便于后續(xù)的檢測(cè)。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。OD值與活細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，通過(guò)比較不同濃度順鉑處理下細(xì)胞的OD值，可以評(píng)估細(xì)胞的增殖活性和對(duì)順鉑的耐藥性。根據(jù)測(cè)得的OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率和抑制率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%；細(xì)胞抑制率（%）=1-細(xì)胞存活率。以順鉑濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。通過(guò)生長(zhǎng)抑制曲線，采用GraphPadPrism軟件中的非線性回歸法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），IC50值越小，表明細(xì)胞對(duì)順鉑越敏感，耐藥性越低；IC50值越大，則表明細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性越強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，采用CCK-8法進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。CCK-8法是一種基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑，其原理是WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。將親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞以相同的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入含不同濃度順鉑的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-4h。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的存活率和抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，并計(jì)算IC50值。通過(guò)比較MTT法和CCK-8法得到的IC50值，評(píng)估兩種方法的一致性和可靠性。若兩種方法得到的IC50值相近，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度。3.5細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加入200μL，即每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞。設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置只含培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的0h、24h、48h、72h和96h，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4h。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)。通過(guò)生長(zhǎng)曲線比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，評(píng)估WWOX基因表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響。若A549/Taxol耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于親本A549細(xì)胞，且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中上調(diào)WWOX基因表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，則說(shuō)明WWOX基因可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。使用EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照試劑盒說(shuō)明書，向每孔加入含有EdU的培養(yǎng)基，終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中。2h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，固定結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞15min，增加細(xì)胞膜的通透性，便于后續(xù)反應(yīng)進(jìn)行。再次用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。按照1:100的比例將Apollo?染色液與反應(yīng)緩沖液混合均勻，每孔加入1mL染色工作液，避光孵育30min。Apollo?染色液能夠與摻入DNA中的EdU發(fā)生特異性反應(yīng)，形成熒光產(chǎn)物。孵育結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。加入DAPI染液（1μg/mL）染色細(xì)胞核10min，DAPI能夠與DNA結(jié)合，使細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。最后用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和DAPI陽(yáng)性細(xì)胞（藍(lán)色熒光）的數(shù)量。計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞占DAPI陽(yáng)性細(xì)胞的比例，即細(xì)胞增殖率。通過(guò)比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的增殖率，分析WWOX基因表達(dá)與細(xì)胞增殖能力的關(guān)系。若A549/Taxol耐藥細(xì)胞的增殖率明顯高于親本A549細(xì)胞，而下調(diào)WWOX基因表達(dá)后，親本A549細(xì)胞的增殖率升高，則表明WWOX基因可能抑制細(xì)胞增殖。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將Transwell小室（8μm孔徑，Corning公司）置于24孔板中，在上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37℃孵育30min，使小室濕潤(rùn)并平衡。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞。取200μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600μL完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)受到下室中趨化因子（如胎牛血清中的某些成分）的吸引，向上室底部的微孔遷移。24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室底部未遷移的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定30min，使遷移到下室底部的細(xì)胞固定。固定結(jié)束后，用PBS清洗小室3次，每次5min。用0.1%結(jié)晶紫染液染色15min，結(jié)晶紫能夠使細(xì)胞著色，便于觀察。染色后，用PBS清洗小室3次，每次5min。在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室底部的細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)，評(píng)估WWOX基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。若A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)明顯多于親本A549細(xì)胞，且上調(diào)WWOX基因表達(dá)后，細(xì)胞遷移數(shù)減少，則說(shuō)明WWOX基因可能抑制細(xì)胞遷移。采用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）在4℃冰箱中過(guò)夜融化，按照1:8的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室上室，均勻鋪于小室底部，37℃孵育4-6h，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，形成類似細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能穿過(guò)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞。取200μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h后，取出Transwell小室，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)，包括擦去未侵襲細(xì)胞、固定、染色、清洗和計(jì)數(shù)。通過(guò)比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)，分析WWOX基因表達(dá)與細(xì)胞侵襲能力的關(guān)系。若A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于親本A549細(xì)胞，而下調(diào)WWOX基因表達(dá)后，親本A549細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)增加，則表明WWOX基因可能抑制細(xì)胞侵襲。3.6分子機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)（MMR）相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。從親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中提取總RNA和總蛋白，具體提取方法同前文所述。使用RT-PCR檢測(cè)MMR相關(guān)基因如MLH1、MSH2、MSH6等的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs和TaqDNA聚合酶等，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)檢測(cè)SYBRGreen熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MMR相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以評(píng)估基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)差異。使用Westernblot檢測(cè)MMR相關(guān)蛋白如MLH1、MSH2、MSH6等的表達(dá)水平。提取的總蛋白經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度后，與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。取等量的蛋白樣品（通常為30-50μg）進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般采用10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。先在80V恒壓下電泳30min，使蛋白質(zhì)在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流，轉(zhuǎn)膜1-2h，轉(zhuǎn)膜過(guò)程在冰浴中進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1-2h，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后將PVDF膜放入相應(yīng)的一抗（兔抗人MLH1、MSH2、MSH6多克隆抗體，稀釋比例為1:1000）中，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。再將膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000）中，室溫孵育1h，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后采用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白的條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算MMR相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，比較親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MMR相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)探究WWOX與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的相互作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞用胰蛋白酶消化后收集，用預(yù)冷的PBS清洗3次。向細(xì)胞中加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕搖晃，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，確保細(xì)胞完全裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000r/min條件下離心15min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品（通常為500-1000μg），加入預(yù)先用ProteinA/G磁珠（ThermoFisherScientific公司）孵育過(guò)夜的抗WWOX抗體（兔抗人WWOX多克隆抗體），4℃緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與WWOX蛋白特異性結(jié)合，并與ProteinA/G磁珠形成免疫復(fù)合物。孵育結(jié)束后，將樣品置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌磁珠-免疫復(fù)合物3次，每次5min，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。向磁珠-免疫復(fù)合物中加入適量的SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)變性并從磁珠上解離下來(lái)。將解離后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜和封閉步驟同Westernblot。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入抗NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如p65、IκBα等）的抗體（鼠抗人p65、IκBα單克隆抗體，稀釋比例為1:1000）中，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。后續(xù)二抗孵育、洗滌和顯色步驟也同Westernblot，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白的條帶，分析WWOX與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白是否存在相互作用。使用RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默或過(guò)表達(dá)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因，觀察對(duì)細(xì)胞耐藥性及WWOX功能的影響。設(shè)計(jì)針對(duì)MMR相關(guān)基因（如MLH1、MSH2）和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因（如p65、IκBα）的小干擾RNA（siRNA）序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA，其序列與目的基因無(wú)同源性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將siRNA和Lipofectamine3000分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min，然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，使siRNA有效沉默目的基因的表達(dá)。對(duì)于基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建含有目的基因（如MLH1、p65）的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，由上海生工生物工程股份有限公司完成。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和Lipofectamine3000分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min，然后混合，室溫孵育20min，形成質(zhì)粒-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，使目的基因在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性，具體操作同前文所述，比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物的IC50值，評(píng)估細(xì)胞耐藥性的變化。同時(shí)，通過(guò)RT-PCR和Westernblot檢測(cè)WWOX基因和蛋白的表達(dá)水平，以及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)水平，觀察基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)WWOX功能及相關(guān)信號(hào)通路的影響。采用細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，具體操作同前文所述），分析基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步探討WWOX與MMR、NF-κB等信號(hào)通路在肺腺癌A549細(xì)胞耐藥中的相互關(guān)系和作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4.1A549耐藥細(xì)胞系鑒定結(jié)果通過(guò)濃度梯度遞增聯(lián)合間歇誘導(dǎo)法，成功構(gòu)建了A549耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/Taxol。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，親本A549細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或短梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接緊密，形態(tài)較為均一。而A549/Taxol耐藥細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，部分細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞之間的連接相對(duì)松散，部分細(xì)胞出現(xiàn)了偽足樣突起。這些形態(tài)學(xué)上的變化可能與細(xì)胞在長(zhǎng)期藥物誘導(dǎo)下發(fā)生的適應(yīng)性改變有關(guān)，如細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞表面分子表達(dá)的變化等，這些改變可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和耐藥特性?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的形態(tài)對(duì)比圖，分別標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol細(xì)胞，圖注：A為親本A549細(xì)胞，B為A549/Taxol耐藥細(xì)胞，標(biāo)尺=100μm】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的形態(tài)對(duì)比圖，分別標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol細(xì)胞，圖注：A為親本A549細(xì)胞，B為A549/Taxol耐藥細(xì)胞，標(biāo)尺=100μm】采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，結(jié)果顯示兩種方法得到的結(jié)果具有一致性。以順鉑濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線（圖2）。從曲線中可以看出，在相同順鉑濃度下，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的抑制率明顯低于親本A549細(xì)胞，表明A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性更強(qiáng)。【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的生長(zhǎng)抑制曲線，橫坐標(biāo)為順鉑濃度的對(duì)數(shù)（μg/mL），縱坐標(biāo)為細(xì)胞抑制率（%），圖注：●表示親本A549細(xì)胞，▲表示A549/Taxol耐藥細(xì)胞】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的生長(zhǎng)抑制曲線，橫坐標(biāo)為順鉑濃度的對(duì)數(shù)（μg/mL），縱坐標(biāo)為細(xì)胞抑制率（%），圖注：●表示親本A549細(xì)胞，▲表示A549/Taxol耐藥細(xì)胞】通過(guò)GraphPadPrism軟件中的非線性回歸法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果如表1所示。親本A549細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值為（1.25±0.12）μg/mL，而A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值為（10.56±0.87）μg/mL，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的IC50值約為親本A549細(xì)胞的8.45倍。耐藥指數(shù)（RI）的計(jì)算結(jié)果為8.45（10.56÷1.25），表明A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性顯著增強(qiáng)，符合耐藥細(xì)胞系的特征，進(jìn)一步驗(yàn)證了A549/Taxol耐藥細(xì)胞系構(gòu)建成功?！敬颂幉迦氡?：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值及耐藥指數(shù)，表頭為“細(xì)胞系”“IC50（μg/mL）”“耐藥指數(shù)（RI）”，內(nèi)容為“A549細(xì)胞”“1.25±0.12”“-”，“A549/Taxol耐藥細(xì)胞”“10.56±0.87”“8.45”，表注：數(shù)據(jù)以“x±s”表示，n=5】【此處插入表1：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值及耐藥指數(shù)，表頭為“細(xì)胞系”“IC50（μg/mL）”“耐藥指數(shù)（RI）”，內(nèi)容為“A549細(xì)胞”“1.25±0.12”“-”，“A549/Taxol耐藥細(xì)胞”“10.56±0.87”“8.45”，表注：數(shù)據(jù)以“x±s”表示，n=5】4.2WWOX基因表達(dá)與耐藥相關(guān)性結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測(cè)親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算WWOX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。親本A549細(xì)胞中WWOX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，顯著低于親本A549細(xì)胞（P<0.01），表明在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為WWOX基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為WWOX基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果表明，以GAPDH為內(nèi)參，分析WWOX蛋白條帶的灰度值，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。親本A549細(xì)胞中WWOX蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.04，明顯低于親本A549細(xì)胞（P<0.01），這與mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為蛋白質(zhì)免疫印跡圖，從上到下依次為WWOX蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為WWOX蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為蛋白質(zhì)免疫印跡圖，從上到下依次為WWOX蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為WWOX蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】為了進(jìn)一步明確WWOX基因表達(dá)與A549細(xì)胞耐藥性之間的關(guān)聯(lián)，將WWOX基因的表達(dá)水平與細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，WWOX基因mRNA表達(dá)水平與A549細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P<0.01），WWOX蛋白表達(dá)水平與A549細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值也呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.88，P<0.01）。這表明WWOX基因表達(dá)水平越低，A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性越強(qiáng)，即WWOX基因的低表達(dá)可能與肺腺癌A549細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。4.3WWOX對(duì)A549細(xì)胞生物學(xué)行為影響結(jié)果CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)0h時(shí)，親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的OD值無(wú)明顯差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞的OD值均逐漸增加，但A549/Taxol耐藥細(xì)胞的OD值增加速度明顯快于親本A549細(xì)胞。在培養(yǎng)24h后，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的OD值為0.56±0.04，親本A549細(xì)胞的OD值為0.42±0.03，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在48h時(shí)，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的OD值達(dá)到0.98±0.06，而親本A549細(xì)胞的OD值為0.68±0.05，差異顯著（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3），從曲線可以直觀地看出，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于親本A549細(xì)胞，表明WWOX基因表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為OD值，圖注：●表示親本A549細(xì)胞，▲表示A549/Taxol耐藥細(xì)胞，*P<0.05，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為OD值，圖注：●表示親本A549細(xì)胞，▲表示A549/Taxol耐藥細(xì)胞，*P<0.05，**P<0.01】EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和DAPI陽(yáng)性細(xì)胞（藍(lán)色熒光）的數(shù)量。計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞占DAPI陽(yáng)性細(xì)胞的比例，即細(xì)胞增殖率。親本A549細(xì)胞的增殖率為（25.6±3.2）%，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的增殖率為（45.8±4.5）%，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的增殖率顯著高于親本A549細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)果如圖4所示，圖中A為親本A549細(xì)胞的EdU染色圖，B為A549/Taxol耐藥細(xì)胞的EdU染色圖，標(biāo)尺=100μm。這進(jìn)一步說(shuō)明WWOX基因表達(dá)下調(diào)與A549細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)相關(guān)?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的EdU染色圖及增殖率柱狀圖，左圖為EdU染色圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野，紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI陽(yáng)性細(xì)胞；右圖為增殖率柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖率（%），圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的EdU染色圖及增殖率柱狀圖，左圖為EdU染色圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野，紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI陽(yáng)性細(xì)胞；右圖為增殖率柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖率（%），圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的結(jié)果顯示，在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室底部的細(xì)胞數(shù)量。親本A549細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為（56.4±7.5）個(gè)，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為（128.6±15.3）個(gè)，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)顯著多于親本A549細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)果如圖5所示，圖中A為親本A549細(xì)胞的遷移細(xì)胞圖，B為A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞圖，標(biāo)尺=100μm。這表明WWOX基因表達(dá)下調(diào)可顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞的遷移能力?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞圖及遷移細(xì)胞數(shù)柱狀圖，左圖為遷移細(xì)胞圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野；右圖為遷移細(xì)胞數(shù)柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的遷移細(xì)胞圖及遷移細(xì)胞數(shù)柱狀圖，左圖為遷移細(xì)胞圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野；右圖為遷移細(xì)胞數(shù)柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果表明，親本A549細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為（28.5±4.2）個(gè)，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為（85.3±10.2）個(gè)，A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于親本A549細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)果如圖6所示，圖中A為親本A549細(xì)胞的侵襲細(xì)胞圖，B為A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞圖，標(biāo)尺=100μm。這說(shuō)明WWOX基因表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞的侵襲能力。【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞圖及侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀圖，左圖為侵襲細(xì)胞圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野；右圖為侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞的侵襲細(xì)胞圖及侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀圖，左圖為侵襲細(xì)胞圖，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的視野；右圖為侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞），縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】4.4WWOX調(diào)控肺腺癌耐藥分子機(jī)制結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與親本A549細(xì)胞相比，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中錯(cuò)配修復(fù)（MMR）相關(guān)基因MLH1、MSH2、MSH6的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，親本A549細(xì)胞中MLH1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.25±0.03；MSH2mRNA在親本A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為1，在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.30±0.04；MSH6mRNA在親本A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為1，在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.28±0.03?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MMR相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及基因名稱（MLH1、MSH2、MSH6），縱坐標(biāo)為基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MMR相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及基因名稱（MLH1、MSH2、MSH6），縱坐標(biāo)為基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MLH1、MSH2、MSH6蛋白的表達(dá)水平也明顯低于親本A549細(xì)胞（P<0.01）。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，親本A549細(xì)胞中MLH1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.22±0.03；MSH2蛋白在親本A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為1，在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.28±0.04；MSH6蛋白在親本A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為1，在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.25±0.03?！九鋱D1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MMR相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為蛋白質(zhì)免疫印跡圖，從上到下依次為MLH1、MSH2、MSH6蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及基因名稱（MLH1、MSH2、MSH6），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中MMR相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為蛋白質(zhì)免疫印跡圖，從上到下依次為MLH1、MSH2、MSH6蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及基因名稱（MLH1、MSH2、MSH6），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中，WWOX蛋白均能與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p65和IκBα發(fā)生特異性結(jié)合。在A549/Taxol耐藥細(xì)胞中，WWOX與p65、IκBα的結(jié)合能力明顯減弱。以免疫共沉淀后檢測(cè)到的目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示結(jié)合能力，親本A549細(xì)胞中WWOX與p65的結(jié)合能力比值為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.45±0.05；親本A549細(xì)胞中WWOX與IκBα的結(jié)合能力比值為1，A549/Taxol耐藥細(xì)胞中為0.48±0.06。這表明WWOX可能通過(guò)與p65、IκBα相互作用，參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相互作用的免疫共沉淀圖及結(jié)合能力比值柱狀圖，左圖為免疫共沉淀圖，從上到下依次為p65、IκBα蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為結(jié)合能力比值柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及蛋白名稱（p65、IκBα），縱坐標(biāo)為結(jié)合能力比值，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】【配圖1張：親本A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞中WWOX與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相互作用的免疫共沉淀圖及結(jié)合能力比值柱狀圖，左圖為免疫共沉淀圖，從上到下依次為p65、IκBα蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶，標(biāo)記出A549細(xì)胞和A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的條帶；右圖為結(jié)合能力比值柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系（A549細(xì)胞、A549/Taxol耐藥細(xì)胞）及蛋白名稱（p65、IκBα），縱坐標(biāo)為結(jié)合能力比值，圖注：與A549細(xì)胞相比，**P<0.01】RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默MMR相關(guān)基因MLH1、MSH2后，A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性顯著增強(qiáng)，IC50值明顯升高（P<0.01）。同時(shí)，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也明顯增強(qiáng)（P<0.01）。而過(guò)表達(dá)MLH1、MSH2基因后，A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性顯著降低，IC50值明顯下降（P<0.01），細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也明顯減弱（P<0.01）。沉默NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因p65、IκBα后，A549/Taxol耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性顯著降低，IC50值明顯下降（P<0.01），細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也明顯減弱（P<0.01）。而過(guò)表達(dá)p65、IκBα基因后，A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性顯著增強(qiáng)，IC50值明顯升高（P<0.01），細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也明顯增強(qiáng)（P<0.01）。這些結(jié)果表明，WWOX可能通過(guò)調(diào)控MMR和NF-κB信號(hào)通路，影響