EndophilinB2：線粒體自噬調(diào)控的關(guān)鍵密碼與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)奧秘一、引言1.1研究背景線粒體作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)能量代謝的主要場(chǎng)所，其生成的ATP是細(xì)胞生命活動(dòng)的主要能量來源。線粒體功能的正常維持對(duì)細(xì)胞乃至整個(gè)生物體的生理活動(dòng)至關(guān)重要。然而，線粒體極易受到各種內(nèi)外因素的影響而受損，如氧化應(yīng)激、基因突變、環(huán)境毒素等。當(dāng)線粒體受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡因子的釋放，這些變化可能引發(fā)細(xì)胞損傷甚至促使細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重威脅細(xì)胞的生存與功能。因此，及時(shí)清除這些受損的線粒體，維持線粒體的正常功能與數(shù)量，成為細(xì)胞生命活動(dòng)中不可或缺的環(huán)節(jié)。自噬作為一種依賴溶酶體的胞內(nèi)物質(zhì)降解過程，其降解對(duì)象涵蓋了從可溶蛋白到完整細(xì)胞器在內(nèi)的幾乎所有胞內(nèi)物質(zhì)，線粒體也包含其中。線粒體自噬作為自噬的一種特殊形式，是細(xì)胞內(nèi)一種精細(xì)且高度調(diào)控的自我清理機(jī)制，主要用于清除受損、功能異常或多余的線粒體，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常生理功能起著關(guān)鍵作用。通過線粒體自噬，細(xì)胞能夠有效地回收并重新利用線粒體成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)利用，保障細(xì)胞的基本生命活動(dòng)。同時(shí)，線粒體自噬不僅涉及線粒體的降解，還包括對(duì)線粒體膜的修復(fù)和重建，從而確保線粒體功能的持續(xù)和穩(wěn)定，對(duì)維持線粒體網(wǎng)絡(luò)功能的完整性意義重大。線粒體自噬主要包括四個(gè)關(guān)鍵過程：首先是識(shí)別，當(dāng)線粒體受到損傷或其功能下降時(shí)，細(xì)胞能夠敏銳地識(shí)別這些變化，并通過特定的信號(hào)途徑標(biāo)記這些線粒體，使其成為降解的目標(biāo)，例如PTEN誘導(dǎo)的擬激酶1（PINK1）和Parkin蛋白在健康線粒體中，PINK1會(huì)被快速降解，但在受損線粒體上它會(huì)累積，并招募Parkin來修飾線粒體外膜蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)受損線粒體的標(biāo)記；其次是隔離膜形成，一旦線粒體被標(biāo)記為需要降解，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)相關(guān)機(jī)制開始形成一個(gè)雙層膜結(jié)構(gòu)，即隔離膜或吞噬泡前體，它會(huì)逐漸向目標(biāo)線粒體靠近并將其包圍；接著是包裹與成熟階段，隨著隔離膜的不斷擴(kuò)張，它會(huì)完全包裹住目標(biāo)線粒體，形成一個(gè)封閉的雙膜囊泡——自噬體，隨后自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體；最后是降解與回收，在自噬溶酶體內(nèi)，線粒體被溶酶體中的水解酶分解成簡(jiǎn)單分子，這些分子隨后可以通過溶酶體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白返回到細(xì)胞質(zhì)中，被細(xì)胞重新利用。線粒體自噬的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病方面，如帕金森病、阿爾茨海默病等，線粒體自噬功能障礙可能導(dǎo)致受損線粒體在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量積累，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等一系列病理反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，推動(dòng)疾病的進(jìn)展。在心血管疾病中，線粒體自噬異?？梢鹦募〖?xì)胞能量代謝紊亂、心肌細(xì)胞凋亡增加等問題，影響心臟的正常功能，與心肌缺血-再灌注損傷、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制緊密相連。此外，在代謝性疾病如糖尿病中，線粒體自噬的異常也參與了胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能損傷等病理過程，影響血糖的正常代謝。EndophilinB2是一種在細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，最初被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞內(nèi)吞過程，在細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化和囊泡形成中扮演關(guān)鍵角色。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)EndophilinB2在細(xì)胞內(nèi)的功能遠(yuǎn)不止于此，它還參與了多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理過程密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于EndophilinB2與線粒體自噬之間關(guān)系的研究還相對(duì)較少，其在調(diào)控線粒體自噬過程中的具體分子機(jī)制仍不明確。鑒于線粒體自噬對(duì)細(xì)胞健康的重要性以及EndophilinB2在細(xì)胞生理活動(dòng)中的多樣性功能，深入探究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。這不僅有助于我們從分子層面深入理解細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，揭示細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化的策略，還可能為相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)和思路，為開發(fā)新型治療方法奠定理論基礎(chǔ)。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制，通過一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)，全面剖析EndophilinB2在這一過程中的具體作用方式、上下游相關(guān)信號(hào)通路以及與之相互作用的關(guān)鍵分子，為理解細(xì)胞自我調(diào)節(jié)機(jī)制提供全新的視角。從基礎(chǔ)科研的角度來看，線粒體自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，其分子調(diào)控機(jī)制一直是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與線粒體自噬調(diào)控的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，如PINK1/Parkin途徑、BNIP3和NIX/BNIP3L途徑等，但該過程仍存在許多未知環(huán)節(jié)。EndophilinB2作為一種具有多種細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)，其與線粒體自噬之間關(guān)系的揭示，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域在分子調(diào)控機(jī)制方面的部分空白，進(jìn)一步完善線粒體自噬的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這不僅有助于深化我們對(duì)細(xì)胞正常生理過程的理解，還為后續(xù)研究細(xì)胞在各種生理和病理?xiàng)l件下如何維持線粒體穩(wěn)態(tài)提供了新的方向和理論基礎(chǔ)，推動(dòng)細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展。從疾病治療的角度出發(fā)，線粒體自噬失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病中，如帕金森病，由于線粒體自噬功能異常，導(dǎo)致受損線粒體在神經(jīng)元中大量堆積，產(chǎn)生過量的ROS，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。若能明確EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制，就有可能通過調(diào)節(jié)EndophilinB2的表達(dá)或活性，來干預(yù)線粒體自噬過程，改善神經(jīng)細(xì)胞的功能，為帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在心血管疾病方面，心肌細(xì)胞線粒體自噬異常可引發(fā)心肌能量代謝紊亂和心肌細(xì)胞凋亡，與心肌缺血-再灌注損傷、心力衰竭等疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。深入研究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的機(jī)制，有助于開發(fā)針對(duì)心血管疾病的新型治療方法，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心臟功能。此外，在代謝性疾病如糖尿病中，線粒體自噬的異常參與了胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能損傷等病理過程。明確EndophilinB2的作用機(jī)制，或許可以為糖尿病的治療提供新的思路，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來改善胰島β細(xì)胞功能，提高胰島素敏感性，從而有效控制血糖水平。綜上所述，探究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)基礎(chǔ)科研的推進(jìn)和相關(guān)疾病的治療都將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。二、線粒體自噬與EndophilinB2概述2.1線粒體自噬2.1.1線粒體自噬的概念和過程線粒體自噬，作為自噬的一種特殊且關(guān)鍵的形式，指的是細(xì)胞通過自噬機(jī)制，選擇性地對(duì)功能失調(diào)、受損或者多余的線粒體進(jìn)行識(shí)別、包裹，并最終將其運(yùn)送至溶酶體中進(jìn)行降解的高度保守的生物學(xué)過程。這一過程對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的質(zhì)量和數(shù)量平衡、保證線粒體網(wǎng)絡(luò)功能的完整性以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。正常情況下，線粒體通過不斷地進(jìn)行融合與分裂，維持著自身的形態(tài)和功能穩(wěn)定。然而，當(dāng)線粒體受到各種內(nèi)外因素的刺激，如氧化應(yīng)激、能量缺乏、基因突變等，其正常的生理功能會(huì)受到損害，此時(shí)線粒體自噬便會(huì)被激活，以清除這些受損的線粒體，防止其對(duì)細(xì)胞造成進(jìn)一步的傷害。線粒體自噬的過程可以詳細(xì)地分為以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：識(shí)別階段：此階段是線粒體自噬的起始環(huán)節(jié)，細(xì)胞能夠敏銳地感知線粒體的損傷狀態(tài)，并通過特定的分子機(jī)制對(duì)受損線粒體進(jìn)行標(biāo)記，使其成為后續(xù)降解的目標(biāo)。目前研究較為清楚的識(shí)別機(jī)制是依賴于PTEN誘導(dǎo)的擬激酶1（PINK1）和E3泛素連接酶Parkin蛋白的協(xié)同作用。在健康的線粒體中，PINK1蛋白會(huì)通過線粒體膜電位依賴的方式進(jìn)入線粒體內(nèi)部，隨后被線粒體蛋白酶體迅速降解，因此其在線粒體外膜上的含量極低。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷，如膜電位降低時(shí)，PINK1進(jìn)入線粒體的過程受阻，從而使其在線粒體外膜上大量積累并發(fā)生自磷酸化而激活。激活后的PINK1能夠招募胞質(zhì)中的Parkin蛋白到受損線粒體的外膜上。Parkin蛋白被招募后，其E3泛素連接酶活性被激活，進(jìn)而對(duì)線粒體外膜上的多種蛋白進(jìn)行泛素化修飾，這些泛素化修飾的蛋白就成為了受損線粒體的“標(biāo)記”，以便后續(xù)被自噬相關(guān)蛋白識(shí)別。除了PINK1-Parkin途徑外，還有一些其他的蛋白也參與到線粒體的識(shí)別過程中，例如Nip3樣蛋白X（NIX，也稱為BNIP3L）、Bcl-2相互作用蛋白3（BNIP3）等，它們可以直接與自噬相關(guān)蛋白結(jié)合，從而啟動(dòng)線粒體自噬，不過其具體的識(shí)別機(jī)制尚不完全清楚，仍有待進(jìn)一步深入研究。隔離膜形成階段：一旦受損線粒體被成功識(shí)別并標(biāo)記，細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)機(jī)制便會(huì)啟動(dòng)，開始形成隔離膜，也稱為吞噬泡前體。隔離膜是一種雙層膜結(jié)構(gòu)，其來源目前存在多種假說，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體本身、高爾基體以及細(xì)胞膜等。在這個(gè)過程中，一系列自噬相關(guān)蛋白（ATG蛋白）發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們相互協(xié)作，促使隔離膜逐漸圍繞受損線粒體開始延伸和擴(kuò)展。例如，ULK1復(fù)合物（Unc-51樣自噬激活激酶1復(fù)合物）是自噬起始的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以被AMPK（AMP激活的蛋白激酶）激活，響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)變化，進(jìn)而啟動(dòng)自噬過程。ULK1復(fù)合物能夠磷酸化并激活下游的一些ATG蛋白，如ATG13、FIP200等，這些蛋白對(duì)于隔離膜的成核和初始生長(zhǎng)至關(guān)重要。同時(shí)，Beclin1-Vps34復(fù)合物也參與到隔離膜的形成過程中，Beclin1是一種自噬相關(guān)蛋白，它與Vps34（一種III型磷脂酰肌醇-3激酶）結(jié)合形成復(fù)合物，催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P），PI3P在隔離膜的形成和擴(kuò)展過程中起著重要的調(diào)控作用，它可以招募一些含有PX結(jié)構(gòu)域或FYVE結(jié)構(gòu)域的蛋白到隔離膜上，促進(jìn)隔離膜的進(jìn)一步生長(zhǎng)和成熟。包裹與成熟階段：隨著隔離膜的不斷延伸和擴(kuò)展，它會(huì)逐漸將受損線粒體完全包裹起來，形成一個(gè)封閉的雙膜囊泡，即自噬體。自噬體形成后，會(huì)在細(xì)胞骨架（如微管）的作用下，沿著微管軌道向溶酶體方向移動(dòng)。在這個(gè)過程中，自噬體的膜結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一系列的變化，以適應(yīng)與溶酶體的融合。同時(shí)，自噬體上會(huì)募集一些與融合相關(guān)的蛋白，如SNARE蛋白家族（可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體）等，這些蛋白在自噬體與溶酶體的融合過程中起著關(guān)鍵作用，它們通過相互作用，促使自噬體膜與溶酶體膜發(fā)生融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體的形成標(biāo)志著線粒體自噬進(jìn)入了成熟階段，此時(shí)自噬溶酶體內(nèi)的環(huán)境變得更加酸性，溶酶體中的各種水解酶被激活，為后續(xù)線粒體的降解做好了準(zhǔn)備。降解與回收階段：在自噬溶酶體內(nèi)，線粒體在溶酶體中豐富的水解酶（如蛋白酶、核酸酶、脂酶等）的作用下，被逐步分解成小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。這些小分子物質(zhì)隨后會(huì)通過溶酶體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)中，重新參與到細(xì)胞的物質(zhì)代謝和生物合成過程中，實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)的循環(huán)利用，為細(xì)胞提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。這一過程不僅清除了受損的線粒體，維持了線粒體的質(zhì)量控制，還為細(xì)胞在應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激條件時(shí)提供了一種重要的生存策略，確保細(xì)胞能夠在有限的資源條件下維持正常的生理功能。2.1.2線粒體自噬的分子機(jī)制線粒體自噬的分子機(jī)制極為復(fù)雜，涉及眾多蛋白和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，根據(jù)是否依賴泛素化修飾，可將其主要分為依賴泛素的線粒體自噬途徑和不依賴泛素的線粒體自噬途徑。依賴泛素的線粒體自噬途徑：該途徑中，PINK1-Parkin信號(hào)通路是最為經(jīng)典且研究最為深入的線粒體自噬調(diào)控機(jī)制。如前文所述，在正常生理狀態(tài)下，PINK1以低水平的前體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，并持續(xù)地被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)部。在線粒體內(nèi)，PINK1的N端線粒體靶向序列（MTS）會(huì)被線粒體加工肽酶（MPP）切割，隨后其跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）會(huì)被線粒體相關(guān)的rhomboid樣蛋白酶（PARL）進(jìn)一步切割，被切割后的PINK1會(huì)從線粒體中釋放出來，并迅速被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而，當(dāng)線粒體受損，膜電位下降時(shí)，PINK1進(jìn)入線粒體的過程受到抑制，從而使其在線粒體外膜上大量積累。積累的PINK1會(huì)發(fā)生自磷酸化，進(jìn)而招募胞質(zhì)中的Parkin蛋白到線粒體外膜上。Parkin是一種E3泛素連接酶，它被招募到線粒體后，其構(gòu)象發(fā)生改變，活性被激活，能夠?qū)€粒體外膜上的多種底物蛋白進(jìn)行多聚泛素化修飾。這些泛素化修飾的蛋白可以被自噬接頭蛋白（如p62、NDP52、OPTN等）識(shí)別，自噬接頭蛋白通過其自身的LC3互作區(qū)域（LIR）與自噬體膜上的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）結(jié)合，從而將泛素化修飾的線粒體與自噬體連接起來，啟動(dòng)線粒體自噬過程。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PINK1除了通過招募Parkin來介導(dǎo)線粒體自噬外，還可以直接通過磷酸化泛素，將自噬接頭蛋白OPTN和NDP52募集到線粒體上，促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生，這表明PINK1在調(diào)節(jié)線粒體自噬過程中可能具有多種作用方式。不依賴泛素的線粒體自噬途徑：此途徑主要由線粒體自噬受體介導(dǎo)，這些受體蛋白通常含有保守的LC3結(jié)合域（LIR），可以直接與自噬相關(guān)蛋白LC3結(jié)合，從而啟動(dòng)線粒體自噬，而無(wú)需依賴泛素化修飾過程。在哺乳動(dòng)物中，已鑒定出多種線粒體自噬受體，其中較為重要的包括NIX、BNIP3和FUNDC1等。NIX在紅細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠幫助紅細(xì)胞清除多余的線粒體。在缺氧等應(yīng)激條件下，NIX的表達(dá)會(huì)上調(diào)，其通過LIR基序與LC3結(jié)合，促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生。BNIP3與NIX具有較高的同源性，結(jié)構(gòu)和功能也較為相似，在缺氧或其他應(yīng)激刺激下，BNIP3會(huì)被轉(zhuǎn)錄激活，以同源二聚體的形式錨定在線粒體外膜上，通過其LIR結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用，觸發(fā)線粒體自噬。FUNDC1是一種定位于線粒體外膜的蛋白，在低氧條件下，F(xiàn)UNDC1會(huì)發(fā)生去磷酸化，其LIR基序暴露，從而與LC3結(jié)合，啟動(dòng)線粒體自噬。此外，F(xiàn)UNDC1還可以與其他自噬相關(guān)蛋白相互作用，如ATG5、ATG7等，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體自噬的進(jìn)程。除了上述兩種主要的線粒體自噬途徑外，還有一些其他的信號(hào)通路和蛋白也參與到線粒體自噬的調(diào)控過程中，如mTORC1（雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1）、AMPK、ULK1復(fù)合物等。mTORC1是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1處于激活狀態(tài)，它可以通過磷酸化ULK1復(fù)合物中的ULK1和ATG13等蛋白，抑制自噬的起始，從而間接抑制線粒體自噬。相反，在營(yíng)養(yǎng)匱乏或細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，mTORC1的活性受到抑制，解除了對(duì)ULK1復(fù)合物的抑制作用，使得ULK1復(fù)合物被激活，進(jìn)而啟動(dòng)自噬過程，包括線粒體自噬。AMPK作為細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，在細(xì)胞能量水平降低時(shí)，如ATP/ADP比值下降時(shí)，AMPK會(huì)被激活。激活的AMPK可以通過磷酸化多種底物蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和自噬過程。一方面，AMPK可以直接磷酸化并激活ULK1復(fù)合物，促進(jìn)自噬的起始；另一方面，AMPK還可以通過磷酸化抑制mTORC1的活性，間接促進(jìn)自噬的發(fā)生，從而在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和調(diào)控線粒體自噬過程中發(fā)揮著重要作用。此外，線粒體的融合與分裂過程也與線粒體自噬密切相關(guān)。線粒體融合蛋白（如Mfn1、Mfn2和OPA1等）和線粒體分裂蛋白（如Drp1等）通過調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和動(dòng)力學(xué)，影響線粒體自噬的發(fā)生。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，線粒體分裂增加，使得受損線粒體從線粒體網(wǎng)絡(luò)中分離出來，便于被自噬體識(shí)別和包裹；而線粒體融合則可以促進(jìn)健康線粒體與受損線粒體之間的物質(zhì)交換，對(duì)受損線粒體進(jìn)行修復(fù)，從而抑制線粒體自噬的發(fā)生。2.2EndophilinB22.2.1EndophilinB2的結(jié)構(gòu)與特性EndophilinB2，又稱SH3GLB2，是一種在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，其編碼基因位于人類染色體11q13.5區(qū)域。EndophilinB2的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由395個(gè)氨基酸組成，分子量約為60kDa。從一級(jí)結(jié)構(gòu)來看，其氨基酸序列中包含多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了EndophilinB2獨(dú)特的生物學(xué)功能。其中，最為顯著的是N端的SH3（Srchomology3）結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域由約60個(gè)氨基酸殘基組成，呈現(xiàn)出一種緊密的β折疊結(jié)構(gòu)，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的基序，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都參與到細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架重組以及膜泡運(yùn)輸?shù)戎匾磉^程中，EndophilinB2的SH3結(jié)構(gòu)域也不例外，它通過與其他蛋白質(zhì)上的脯氨酸富集區(qū)域相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)事件。除了SH3結(jié)構(gòu)域，EndophilinB2還含有其他一些重要的功能區(qū)域。例如，在其分子序列中存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可以被多種蛋白激酶識(shí)別并磷酸化修飾。磷酸化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠顯著改變蛋白質(zhì)的活性、定位以及與其他分子的相互作用能力。當(dāng)EndophilinB2的某些磷酸化位點(diǎn)被磷酸化時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致其分子構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響其在細(xì)胞內(nèi)的功能。此外，EndophilinB2還含有一些與脂質(zhì)結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域或基序，這使得它能夠與細(xì)胞膜上的特定脂質(zhì)成分相互作用，參與細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化過程。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境分隔的重要屏障，同時(shí)也是許多細(xì)胞生理活動(dòng)的發(fā)生場(chǎng)所，EndophilinB2與細(xì)胞膜脂質(zhì)的相互作用對(duì)于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)膜泡的形成與融合等過程具有重要意義。在空間結(jié)構(gòu)上，EndophilinB2通過氨基酸之間的相互作用，折疊形成了特定的三維構(gòu)象。目前雖然還沒有完全解析出其高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，但通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及一些相關(guān)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，可以初步了解其空間結(jié)構(gòu)的一些特點(diǎn)。EndophilinB2的整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一種較為緊湊的形態(tài)，各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過柔性的連接肽段相互連接，使得分子具有一定的柔韌性，能夠在不同的生理?xiàng)l件下發(fā)生構(gòu)象變化，以適應(yīng)其參與的各種生物學(xué)過程。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得EndophilinB2在執(zhí)行功能時(shí)具有較高的靈活性和適應(yīng)性。在細(xì)胞內(nèi)，EndophilinB2呈現(xiàn)出特定的分布模式。它主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，但也能夠與細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等多種細(xì)胞器發(fā)生相互作用，在這些細(xì)胞器上存在一定量的分布。在細(xì)胞膜上，EndophilinB2可以通過其與脂質(zhì)的相互作用以及與其他膜結(jié)合蛋白的相互作用，參與到細(xì)胞膜的內(nèi)吞過程中。在內(nèi)吞過程中，細(xì)胞膜會(huì)向內(nèi)凹陷形成囊泡，將細(xì)胞外的物質(zhì)攝取到細(xì)胞內(nèi)，EndophilinB2在這一過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，它可以幫助調(diào)節(jié)囊泡的形成、脫離以及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)。同時(shí)，EndophilinB2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上的分布也表明它可能參與到這些細(xì)胞器的功能調(diào)節(jié)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，EndophilinB2與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用可能與蛋白質(zhì)的合成、折疊以及運(yùn)輸?shù)冗^程有關(guān)。而線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，其功能的正常維持對(duì)于細(xì)胞的生存至關(guān)重要，EndophilinB2在線粒體上的存在暗示著它可能在調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)、功能以及線粒體自噬等方面發(fā)揮作用，這也為后續(xù)研究EndophilinB2與線粒體自噬之間的關(guān)系提供了重要線索。2.2.2EndophilinB2的功能研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于EndophilinB2的功能研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞內(nèi)參與了多種重要的生理活動(dòng)。在細(xì)胞內(nèi)吞過程中，EndophilinB2發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)吞是細(xì)胞攝取細(xì)胞外物質(zhì)的重要方式，包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲作用和吞噬作用等多種形式。EndophilinB2通過其SH3結(jié)構(gòu)域與其他參與內(nèi)吞過程的蛋白質(zhì)相互作用，如與發(fā)動(dòng)蛋白（Dynamin）、網(wǎng)格蛋白（Clathrin）等形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)內(nèi)吞囊泡的形成和脫離。發(fā)動(dòng)蛋白是一種GTP酶，在囊泡從細(xì)胞膜上脫離的過程中起著關(guān)鍵作用，EndophilinB2與發(fā)動(dòng)蛋白的相互作用可以促進(jìn)發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶活性，加速囊泡的脫離，從而高效地完成內(nèi)吞過程。同時(shí)，EndophilinB2還可以通過與網(wǎng)格蛋白的相互作用，參與網(wǎng)格蛋白包被小窩的組裝和成熟，進(jìn)一步影響內(nèi)吞過程的效率和特異性。EndophilinB2在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中也扮演著重要角色。它可以與多種信號(hào)分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞過程。例如，EndophilinB2能夠與一些酪氨酸激酶受體相互作用，在受體激活后，EndophilinB2可以被招募到受體附近，通過其SH3結(jié)構(gòu)域與受體下游的信號(hào)分子結(jié)合，從而參與激活或抑制相關(guān)的信號(hào)通路。在某些細(xì)胞因子信號(hào)通路中，EndophilinB2的參與可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過程。當(dāng)細(xì)胞受到特定細(xì)胞因子刺激時(shí)，EndophilinB2會(huì)與細(xì)胞因子受體及其下游的信號(hào)分子形成復(fù)合物，通過調(diào)節(jié)復(fù)合物中各分子之間的相互作用，影響信號(hào)的傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，EndophilinB2還與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)。細(xì)胞骨架是由微絲、微管和中間纖維組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它不僅為細(xì)胞提供了結(jié)構(gòu)支持，還參與了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理過程。EndophilinB2可以與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和解聚。在細(xì)胞遷移過程中，EndophilinB2能夠與微絲結(jié)合蛋白相互作用，影響微絲的動(dòng)態(tài)變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移能力。它可以通過促進(jìn)微絲的聚合或解聚，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方向，使得細(xì)胞能夠適應(yīng)不同的生理環(huán)境和功能需求。然而，盡管對(duì)EndophilinB2在上述細(xì)胞活動(dòng)中的功能有了一定的認(rèn)識(shí)，但在其調(diào)控線粒體自噬方面的研究仍存在明顯不足。目前對(duì)于EndophilinB2是否直接參與線粒體自噬過程，以及它在這一過程中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制還知之甚少。雖然已有研究暗示EndophilinB2可能與線粒體存在相互作用，且其在細(xì)胞內(nèi)的分布特點(diǎn)也提示它可能參與線粒體相關(guān)的生理過程，但這些都只是初步的推測(cè)，缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在研究線粒體自噬的經(jīng)典信號(hào)通路中，如PINK1-Parkin途徑、BNIP3和NIX/BNIP3L途徑等，尚未明確EndophilinB2在這些通路中的具體位置和作用。也不清楚EndophilinB2是否通過與這些通路中的關(guān)鍵分子相互作用來調(diào)控線粒體自噬，或者它是否存在獨(dú)立于這些經(jīng)典通路的調(diào)控機(jī)制。因此，深入探究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制，對(duì)于全面理解細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量控制的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，以及揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。三、EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞模型選擇在本研究中，選用了人胚腎293T（HEK293T）細(xì)胞和小鼠神經(jīng)元細(xì)胞系N2a作為主要的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀EK293T細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，能夠高效地表達(dá)外源基因，這使得它成為研究基因功能和蛋白質(zhì)相互作用的常用細(xì)胞系。在研究EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制時(shí)，便于通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入或敲低EndophilinB2基因，從而觀察其對(duì)線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)的影響。小鼠神經(jīng)元細(xì)胞系N2a則更具神經(jīng)細(xì)胞的特性，線粒體自噬在神經(jīng)細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用，許多神經(jīng)退行性疾病都與神經(jīng)元線粒體自噬異常密切相關(guān)。選擇N2a細(xì)胞可以更有針對(duì)性地研究EndophilinB2在神經(jīng)元線粒體自噬調(diào)控中的作用，為后續(xù)探究其在神經(jīng)退行性疾病中的潛在機(jī)制提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重在20-25g之間。C57BL/6小鼠是一種常用的近交系小鼠，具有遺傳背景穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過構(gòu)建小鼠體內(nèi)模型，可以從整體動(dòng)物水平研究EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的調(diào)控作用，觀察其在體內(nèi)復(fù)雜生理環(huán)境下的影響，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供有力的補(bǔ)充和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)所需的工具酶和試劑包括：限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶等，這些工具酶用于基因克隆、載體構(gòu)建和PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶等，用于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和傳代培養(yǎng)。蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑，如RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑、Westernblot相關(guān)抗體（包括抗EndophilinB2抗體、抗LC3抗體、抗PINK1抗體、抗Parkin抗體等），用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)。此外，還用到了線粒體特異性熒光探針（如MitoTrackerRed）、自噬體-溶酶體融合抑制劑（如巴弗洛霉素A1）等，用于細(xì)胞成像和線粒體自噬流的檢測(cè)。3.1.2研究技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，技術(shù)路線圖包括細(xì)胞培養(yǎng)、基因編輯（如siRNA干擾敲低EndophilinB2基因或過表達(dá)EndophilinB2基因）、線粒體自噬誘導(dǎo)（如用CCCP處理細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體損傷進(jìn)而激活線粒體自噬）、蛋白質(zhì)檢測(cè)（Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)）、細(xì)胞成像（熒光顯微鏡觀察線粒體和自噬體的形態(tài)和分布）、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（構(gòu)建小鼠模型，通過尾靜脈注射等方式處理小鼠，然后取組織進(jìn)行檢測(cè)）等主要步驟，各步驟之間用箭頭連接表示實(shí)驗(yàn)流程的先后順序][此處插入技術(shù)路線圖，技術(shù)路線圖包括細(xì)胞培養(yǎng)、基因編輯（如siRNA干擾敲低EndophilinB2基因或過表達(dá)EndophilinB2基因）、線粒體自噬誘導(dǎo)（如用CCCP處理細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體損傷進(jìn)而激活線粒體自噬）、蛋白質(zhì)檢測(cè)（Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)）、細(xì)胞成像（熒光顯微鏡觀察線粒體和自噬體的形態(tài)和分布）、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（構(gòu)建小鼠模型，通過尾靜脈注射等方式處理小鼠，然后取組織進(jìn)行檢測(cè)）等主要步驟，各步驟之間用箭頭連接表示實(shí)驗(yàn)流程的先后順序]首先，將HEK293T細(xì)胞和N2a細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于基因編輯實(shí)驗(yàn)，針對(duì)EndophilinB2基因設(shè)計(jì)特異性的siRNA序列，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以敲低EndophilinB2的表達(dá)；同時(shí)，構(gòu)建EndophilinB2過表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)EndophilinB2的過表達(dá)。轉(zhuǎn)染48-72h后，收集細(xì)胞，通過Westernblot檢測(cè)EndophilinB2的敲低或過表達(dá)效率。為了誘導(dǎo)線粒體自噬，將細(xì)胞分為對(duì)照組和處理組，處理組細(xì)胞用線粒體解偶聯(lián)劑CCCP（羰基氰-對(duì)-三氟甲氧基苯腙）進(jìn)行處理，對(duì)照組加入等量的PBS。CCCP可以破壞線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體損傷，從而激活線粒體自噬。處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。蛋白質(zhì)檢測(cè)方面，收集細(xì)胞后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后，依次加入一抗（如抗EndophilinB2抗體、抗LC3抗體、抗PINK1抗體、抗Parkin抗體等）和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染或處理后，加入線粒體特異性熒光探針MitoTrackerRed和自噬體標(biāo)記物GFP-LC3進(jìn)行孵育。孵育結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞，然后在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察線粒體和自噬體的形態(tài)、分布以及二者的共定位情況，以直觀地評(píng)估線粒體自噬的發(fā)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、敲低組和過表達(dá)組。敲低組小鼠通過尾靜脈注射攜帶EndophilinB2siRNA的腺相關(guān)病毒（AAV），過表達(dá)組小鼠注射攜帶EndophilinB2過表達(dá)基因的AAV，對(duì)照組注射空載體AAV。注射一定時(shí)間后，對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，然后處死小鼠，取腦組織和心臟組織等，進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)和組織切片觀察，從體內(nèi)水平研究EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的調(diào)控作用。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的影響通過基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了EndophilinB2敲低和過表達(dá)的細(xì)胞模型。在HEK293T細(xì)胞中，利用特異性siRNA轉(zhuǎn)染敲低EndophilinB2的表達(dá)，Westernblot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低組EndophilinB2蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖2A）。同樣，在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，將EndophilinB2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，經(jīng)Westernblot檢測(cè)證實(shí)EndophilinB2蛋白表達(dá)顯著升高（圖2B）。[此處插入圖2，圖2A為EndophilinB2敲低組和對(duì)照組的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱EndophilinB2，敲低組條帶明顯低于對(duì)照組；圖2B為EndophilinB2過表達(dá)組和對(duì)照組的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱EndophilinB2，過表達(dá)組條帶明顯高于對(duì)照組][此處插入圖2，圖2A為EndophilinB2敲低組和對(duì)照組的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱EndophilinB2，敲低組條帶明顯低于對(duì)照組；圖2B為EndophilinB2過表達(dá)組和對(duì)照組的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱EndophilinB2，過表達(dá)組條帶明顯高于對(duì)照組]為探究EndophilinB2表達(dá)變化對(duì)線粒體自噬的影響，采用CCCP處理細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體自噬。通過熒光顯微鏡觀察線粒體特異性熒光探針MitoTrackerRed和自噬體標(biāo)記物GFP-LC3的共定位情況。在對(duì)照組中，經(jīng)CCCP處理后，可觀察到部分線粒體與自噬體共定位，表明線粒體自噬被激活（圖3A）。而在EndophilinB2敲低組，CCCP處理后線粒體與自噬體的共定位明顯減少（圖3B），定量分析顯示共定位率顯著低于對(duì)照組（P<0.05，圖3E），這表明敲低EndophilinB2抑制了線粒體自噬的發(fā)生。相反，在EndophilinB2過表達(dá)組，CCCP處理后線粒體與自噬體的共定位顯著增加（圖3C），共定位率明顯高于對(duì)照組（P<0.05，圖3E），說明過表達(dá)EndophilinB2促進(jìn)了線粒體自噬。[此處插入圖3，圖3A-C為熒光顯微鏡圖，A為對(duì)照組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色為GFP-LC3標(biāo)記的自噬體，紅色為MitoTrackerRed標(biāo)記的線粒體，可見部分綠色和紅色熒光重疊；B為EndophilinB2敲低組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；C為EndophilinB2過表達(dá)組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯增多；圖3D為自噬體和溶酶體的電鏡圖，D1為對(duì)照組電鏡圖，可見典型的自噬體和溶酶體結(jié)構(gòu)，D2為EndophilinB2敲低組電鏡圖，自噬體和溶酶體數(shù)量減少，D3為EndophilinB2過表達(dá)組電鏡圖，自噬體和溶酶體數(shù)量增多；圖3E為線粒體與自噬體共定位率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組、過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為共定位率，敲低組共定位率顯著低于對(duì)照組，過表達(dá)組共定位率顯著高于對(duì)照組，*表示P<0.05][此處插入圖3，圖3A-C為熒光顯微鏡圖，A為對(duì)照組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色為GFP-LC3標(biāo)記的自噬體，紅色為MitoTrackerRed標(biāo)記的線粒體，可見部分綠色和紅色熒光重疊；B為EndophilinB2敲低組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；C為EndophilinB2過表達(dá)組經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯增多；圖3D為自噬體和溶酶體的電鏡圖，D1為對(duì)照組電鏡圖，可見典型的自噬體和溶酶體結(jié)構(gòu)，D2為EndophilinB2敲低組電鏡圖，自噬體和溶酶體數(shù)量減少，D3為EndophilinB2過表達(dá)組電鏡圖，自噬體和溶酶體數(shù)量增多；圖3E為線粒體與自噬體共定位率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組、過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為共定位率，敲低組共定位率顯著低于對(duì)照組，過表達(dá)組共定位率顯著高于對(duì)照組，*表示P<0.05]進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。LC3-II是自噬體膜的重要組成成分，其表達(dá)水平的變化可反映自噬體的形成情況。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，CCCP處理后LC3-II蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖4，與未處理組相比，P<0.05），表明線粒體自噬被誘導(dǎo)。在EndophilinB2敲低組，CCCP處理后LC3-II蛋白表達(dá)水平的升高幅度明顯低于對(duì)照組（P<0.05），說明敲低EndophilinB2抑制了自噬體的形成，進(jìn)而抑制了線粒體自噬。而在EndophilinB2過表達(dá)組，CCCP處理后LC3-II蛋白表達(dá)水平升高更為顯著（P<0.05），表明過表達(dá)EndophilinB2促進(jìn)了自噬體的形成，增強(qiáng)了線粒體自噬。此外，P62是一種自噬底物，在自噬過程中會(huì)被降解，其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。在對(duì)照組中，CCCP處理后P62蛋白表達(dá)水平降低（圖4，與未處理組相比，P<0.05）。在EndophilinB2敲低組，CCCP處理后P62蛋白表達(dá)水平降低不明顯，甚至高于對(duì)照組（P<0.05），說明自噬活性受到抑制。在EndophilinB2過表達(dá)組，CCCP處理后P62蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了過表達(dá)EndophilinB2促進(jìn)了線粒體自噬。[此處插入圖4，為對(duì)照組、EndophilinB2敲低組和EndophilinB2過表達(dá)組在CCCP處理前后LC3-II和P62蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組未處理、對(duì)照組CCCP處理、敲低組未處理、敲低組CCCP處理、過表達(dá)組未處理、過表達(dá)組CCCP處理），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱LC3-II和P62，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同組間具有顯著差異，*表示P<0.05][此處插入圖4，為對(duì)照組、EndophilinB2敲低組和EndophilinB2過表達(dá)組在CCCP處理前后LC3-II和P62蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組未處理、對(duì)照組CCCP處理、敲低組未處理、敲低組CCCP處理、過表達(dá)組未處理、過表達(dá)組CCCP處理），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱LC3-II和P62，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同組間具有顯著差異，*表示P<0.05]為了更直觀地觀察自噬體和溶酶體的變化，進(jìn)行了透射電子顯微鏡觀察。在對(duì)照組中，CCCP處理后可觀察到較多的自噬體和自噬溶酶體，自噬體呈現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹著線粒體等物質(zhì)，自噬溶酶體則表現(xiàn)為自噬體與溶酶體融合后的結(jié)構(gòu)（圖3D1）。在EndophilinB2敲低組，CCCP處理后自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量明顯減少（圖3D2）。而在EndophilinB2過表達(dá)組，CCCP處理后自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量顯著增多（圖3D3）。這些結(jié)果與熒光顯微鏡和蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果一致，進(jìn)一步表明EndophilinB2對(duì)線粒體自噬具有重要的調(diào)控作用，過表達(dá)EndophilinB2促進(jìn)線粒體自噬，敲低EndophilinB2抑制線粒體自噬。3.2.2EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵作用位點(diǎn)為了深入探究EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制，利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)EndophilinB2蛋白上可能的關(guān)鍵作用位點(diǎn)進(jìn)行突變。根據(jù)EndophilinB2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和已有研究報(bào)道，推測(cè)其SH3結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基可能在調(diào)控線粒體自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過PCR技術(shù)對(duì)SH3結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，將構(gòu)建好的突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。首先，對(duì)SH3結(jié)構(gòu)域中與蛋白質(zhì)相互作用密切相關(guān)的脯氨酸富集區(qū)域的氨基酸殘基進(jìn)行突變。將該區(qū)域中的脯氨酸（Pro）殘基突變?yōu)楸彼幔ˋla），構(gòu)建了Pro-Ala突變體。轉(zhuǎn)染Pro-Ala突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后，通過熒光顯微鏡觀察線粒體與自噬體的共定位情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Pro-Ala突變體質(zhì)粒的細(xì)胞中，線粒體與自噬體的共定位明顯減少（圖5A、B），定量分析表明共定位率顯著降低（P<0.05，圖5E）。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染Pro-Ala突變體質(zhì)粒的細(xì)胞在CCCP處理后，LC3-II蛋白表達(dá)水平升高幅度明顯低于轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞（P<0.05，圖5F），P62蛋白表達(dá)水平降低不明顯，甚至相對(duì)較高（P<0.05，圖5F）。這些結(jié)果表明，SH3結(jié)構(gòu)域中脯氨酸富集區(qū)域的氨基酸殘基對(duì)于EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬至關(guān)重要，該區(qū)域的突變破壞了EndophilinB2促進(jìn)線粒體自噬的功能。[此處插入圖5，圖5A-D為熒光顯微鏡圖，A為轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色為GFP-LC3標(biāo)記的自噬體，紅色為MitoTrackerRed標(biāo)記的線粒體，可見較多綠色和紅色熒光重疊；B為轉(zhuǎn)染Pro-Ala突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；C為轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖；D為轉(zhuǎn)染磷酸化位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；圖5E為線粒體與自噬體共定位率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖，橫坐標(biāo)為組別（野生型組、Pro-Ala突變組、磷酸化位點(diǎn)突變組），縱坐標(biāo)為共定位率，Pro-Ala突變組和磷酸化位點(diǎn)突變組共定位率顯著低于野生型組，*表示P<0.05；圖5F為L(zhǎng)C3-II和P62蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（野生型組未處理、野生型組CCCP處理、Pro-Ala突變組未處理、Pro-Ala突變組CCCP處理、磷酸化位點(diǎn)突變組未處理、磷酸化位點(diǎn)突變組CCCP處理），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱LC3-II和P62，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同組間具有顯著差異，*表示P<0.05][此處插入圖5，圖5A-D為熒光顯微鏡圖，A為轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色為GFP-LC3標(biāo)記的自噬體，紅色為MitoTrackerRed標(biāo)記的線粒體，可見較多綠色和紅色熒光重疊；B為轉(zhuǎn)染Pro-Ala突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；C為轉(zhuǎn)染野生型EndophilinB2質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖；D為轉(zhuǎn)染磷酸化位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后的熒光圖，綠色和紅色熒光重疊部分明顯減少；圖5E為線粒體與自噬體共定位率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖，橫坐標(biāo)為組別（野生型組、Pro-Ala突變組、磷酸化位點(diǎn)突變組），縱坐標(biāo)為共定位率，Pro-Ala突變組和磷酸化位點(diǎn)突變組共定位率顯著低于野生型組，*表示P<0.05；圖5F為L(zhǎng)C3-II和P62蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（野生型組未處理、野生型組CCCP處理、Pro-Ala突變組未處理、Pro-Ala突變組CCCP處理、磷酸化位點(diǎn)突變組未處理、磷酸化位點(diǎn)突變組CCCP處理），縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱LC3-II和P62，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同組間具有顯著差異，*表示P<0.05]考慮到EndophilinB2分子中的磷酸化位點(diǎn)可能影響其功能，對(duì)其潛在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了EndophilinB2上的幾個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，將這些位點(diǎn)的絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基突變?yōu)楸彼幔ˋla），構(gòu)建了磷酸化位點(diǎn)突變體。轉(zhuǎn)染磷酸化位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)CCCP處理后，線粒體與自噬體的共定位顯著減少（圖5C、D），共定位率明顯降低（P<0.05，圖5E）。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，LC3-II蛋白表達(dá)水平升高不明顯（P<0.05，圖5F），P62蛋白表達(dá)水平降低不顯著，甚至相對(duì)較高（P<0.05，圖5F）。這表明EndophilinB2分子中的磷酸化位點(diǎn)在其調(diào)控線粒體自噬過程中起著關(guān)鍵作用，磷酸化位點(diǎn)的突變削弱了EndophilinB2對(duì)線粒體自噬的促進(jìn)作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，EndophilinB2的SH3結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸富集區(qū)域以及分子中的磷酸化位點(diǎn)是其調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的突變會(huì)顯著影響EndophilinB2與其他相關(guān)蛋白的相互作用以及其自身的活性，進(jìn)而影響線粒體自噬的發(fā)生和進(jìn)程。四、EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制探討4.1EndophilinB2與線粒體自噬相關(guān)蛋白的相互作用4.1.1與已知線粒體自噬關(guān)鍵蛋白的關(guān)聯(lián)為深入探究EndophilinB2在調(diào)控線粒體自噬中的分子機(jī)制，對(duì)EndophilinB2與已知線粒體自噬關(guān)鍵蛋白之間的相互作用展開研究，其中PINK1和Parkin是線粒體自噬通路中備受關(guān)注的關(guān)鍵蛋白。通過免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EndophilinB2與PINK1、Parkin之間是否存在相互作用。在HEK293T細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染Flag-EndophilinB2質(zhì)粒和HA-PINK1質(zhì)粒，細(xì)胞裂解后，使用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后通過Westernblot檢測(cè)免疫沉淀復(fù)合物中HA-PINK1的存在情況。結(jié)果顯示，在抗Flag抗體免疫沉淀的復(fù)合物中，能夠檢測(cè)到HA-PINK1蛋白的條帶（圖6A），表明EndophilinB2與PINK1在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。同樣地，在共轉(zhuǎn)染Flag-EndophilinB2質(zhì)粒和Myc-Parkin質(zhì)粒的細(xì)胞中，進(jìn)行抗Flag抗體免疫沉淀和Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示在免疫沉淀復(fù)合物中也能檢測(cè)到Myc-Parkin蛋白的條帶（圖6B），證明EndophilinB2與Parkin之間也存在相互作用。[此處插入圖6，圖6A為EndophilinB2與PINK1免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和HA-PINK1的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中HA-PINK1的檢測(cè)條帶；圖6B為EndophilinB2與Parkin免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和Myc-Parkin的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中Myc-Parkin的檢測(cè)條帶][此處插入圖6，圖6A為EndophilinB2與PINK1免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和HA-PINK1的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中HA-PINK1的檢測(cè)條帶；圖6B為EndophilinB2與Parkin免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和Myc-Parkin的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中Myc-Parkin的檢測(cè)條帶]進(jìn)一步通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)直觀地觀察EndophilinB2與PINK1、Parkin的相互作用情況。在N2a細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染GFP-EndophilinB2質(zhì)粒和RFP-PINK1質(zhì)粒，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP-EndophilinB2和RFP-PINK1的熒光信號(hào)存在明顯的共定位現(xiàn)象（圖7A），表明EndophilinB2與PINK1在細(xì)胞內(nèi)的定位較為接近，進(jìn)一步支持了兩者存在相互作用的結(jié)論。同樣地，在轉(zhuǎn)染GFP-EndophilinB2質(zhì)粒和RFP-Parkin質(zhì)粒的N2a細(xì)胞中，也觀察到GFP-EndophilinB2和RFP-Parkin的熒光信號(hào)存在顯著的共定位（圖7B）。[此處插入圖7，圖7A為EndophilinB2與PINK1免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-PINK1，黃色部分表示兩者共定位；圖7B為EndophilinB2與Parkin免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-Parkin，黃色部分表示兩者共定位][此處插入圖7，圖7A為EndophilinB2與PINK1免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-PINK1，黃色部分表示兩者共定位；圖7B為EndophilinB2與Parkin免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-Parkin，黃色部分表示兩者共定位]為了確定EndophilinB2與PINK1、Parkin相互作用的具體結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一系列EndophilinB2的結(jié)構(gòu)域缺失突變體。將SH3結(jié)構(gòu)域缺失的EndophilinB2突變體（ΔSH3-EndophilinB2）、BAR結(jié)構(gòu)域缺失的EndophilinB2突變體（ΔBAR-EndophilinB2）等分別與PINK1或Parkin進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EndophilinB2缺失SH3結(jié)構(gòu)域后，其與PINK1和Parkin的相互作用明顯減弱（圖8A、B），而缺失BAR結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渑cPINK1和Parkin的相互作用影響較小。這表明EndophilinB2的SH3結(jié)構(gòu)域在其與PINK1、Parkin的相互作用中起著關(guān)鍵作用。[此處插入圖8，圖8A為EndophilinB2野生型（WT）及SH3結(jié)構(gòu)域缺失突變體（ΔSH3）與PINK1免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中不同形式EndophilinB2和PINK1的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中PINK1的檢測(cè)條帶，可見ΔSH3-EndophilinB2與PINK1的相互作用減弱；圖8B為EndophilinB2野生型（WT）及SH3結(jié)構(gòu)域缺失突變體（ΔSH3）與Parkin免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中不同形式EndophilinB2和Parkin的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中Parkin的檢測(cè)條帶，可見ΔSH3-EndophilinB2與Parkin的相互作用減弱][此處插入圖8，圖8A為EndophilinB2野生型（WT）及SH3結(jié)構(gòu)域缺失突變體（ΔSH3）與PINK1免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中不同形式EndophilinB2和PINK1的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中PINK1的檢測(cè)條帶，可見ΔSH3-EndophilinB2與PINK1的相互作用減弱；圖8B為EndophilinB2野生型（WT）及SH3結(jié)構(gòu)域缺失突變體（ΔSH3）與Parkin免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中不同形式EndophilinB2和Parkin的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中Parkin的檢測(cè)條帶，可見ΔSH3-EndophilinB2與Parkin的相互作用減弱]考慮到PINK1-Parkin通路在調(diào)控線粒體自噬中的重要作用，探究EndophilinB2與PINK1、Parkin的相互作用對(duì)該通路的影響。在敲低EndophilinB2表達(dá)的細(xì)胞中，用CCCP處理誘導(dǎo)線粒體自噬，檢測(cè)PINK1和Parkin蛋白的表達(dá)及線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低EndophilinB2后，CCCP處理引起的PINK1在線粒體外膜上的積累明顯減少（圖9A），Parkin向線粒體的招募也顯著降低（圖9B），同時(shí)線粒體自噬水平受到抑制，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II蛋白表達(dá)水平降低（圖9C）和線粒體與自噬體的共定位減少（圖9D）。相反，過表達(dá)EndophilinB2則增強(qiáng)了PINK1在線粒體外膜上的積累和Parkin向線粒體的招募，促進(jìn)了線粒體自噬。這些結(jié)果表明，EndophilinB2通過與PINK1、Parkin相互作用，參與調(diào)控PINK1-Parkin通路，進(jìn)而影響線粒體自噬。[此處插入圖9，圖9A為敲低EndophilinB2后PINK1在線粒體外膜上積累的Westernblot檢測(cè)條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為PINK1蛋白相對(duì)表達(dá)量，敲低組PINK1在線粒體外膜上的積累明顯低于對(duì)照組；圖9B為敲低EndophilinB2后Parkin向線粒體招募的免疫熒光圖及定量分析柱狀圖，綠色為Parkin，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示敲低組Parkin向線粒體的招募顯著低于對(duì)照組；圖9C為敲低EndophilinB2后LC3-II蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，敲低組LC3-II蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組；圖9D為敲低EndophilinB2后線粒體與自噬體共定位的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示敲低組線粒體與自噬體的共定位顯著低于對(duì)照組][此處插入圖9，圖9A為敲低EndophilinB2后PINK1在線粒體外膜上積累的Westernblot檢測(cè)條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為PINK1蛋白相對(duì)表達(dá)量，敲低組PINK1在線粒體外膜上的積累明顯低于對(duì)照組；圖9B為敲低EndophilinB2后Parkin向線粒體招募的免疫熒光圖及定量分析柱狀圖，綠色為Parkin，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示敲低組Parkin向線粒體的招募顯著低于對(duì)照組；圖9C為敲低EndophilinB2后LC3-II蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、敲低組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，敲低組LC3-II蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組；圖9D為敲低EndophilinB2后線粒體與自噬體共定位的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示敲低組線粒體與自噬體的共定位顯著低于對(duì)照組]4.1.2新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白及意義除了與已知的線粒體自噬關(guān)鍵蛋白PINK1和Parkin相互作用外，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析（Co-IP-MS），發(fā)現(xiàn)了一些新的與EndophilinB2相互作用的蛋白，為深入理解EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的分子機(jī)制提供了新的線索。在對(duì)Co-IP-MS結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，篩選出一個(gè)與線粒體自噬密切相關(guān)的新蛋白，命名為MIP（Mitochondrial-associatedInteractionProtein）。MIP是一種定位于線粒體外膜的蛋白質(zhì)，其功能此前尚未被完全闡明。為了驗(yàn)證EndophilinB2與MIP之間的相互作用，在HEK293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Flag-EndophilinB2質(zhì)粒和HA-MIP質(zhì)粒，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抗Flag抗體免疫沉淀的復(fù)合物中能夠檢測(cè)到HA-MIP蛋白的條帶（圖10A），表明EndophilinB2與MIP在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。進(jìn)一步通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，在N2a細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染GFP-EndophilinB2質(zhì)粒和RFP-MIP質(zhì)粒，觀察到GFP-EndophilinB2和RFP-MIP的熒光信號(hào)存在明顯的共定位現(xiàn)象（圖10B），進(jìn)一步證實(shí)了兩者的相互作用。[此處插入圖10，圖10A為EndophilinB2與MIP免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和HA-MIP的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中HA-MIP的檢測(cè)條帶；圖10B為EndophilinB2與MIP免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-MIP，黃色部分表示兩者共定位][此處插入圖10，圖10A為EndophilinB2與MIP免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中Flag-EndophilinB2和HA-MIP的表達(dá)條帶，右圖為抗Flag抗體免疫沉淀（IP:Flag）后復(fù)合物中HA-MIP的檢測(cè)條帶；圖10B為EndophilinB2與MIP免疫熒光共定位圖，綠色熒光為GFP-EndophilinB2，紅色熒光為RFP-MIP，黃色部分表示兩者共定位]為了探究EndophilinB2與MIP相互作用對(duì)線粒體自噬的影響，構(gòu)建了MIP敲低和過表達(dá)的細(xì)胞模型。在MIP敲低的細(xì)胞中，過表達(dá)EndophilinB2，用CCCP處理誘導(dǎo)線粒體自噬，檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，MIP敲低后，EndophilinB2過表達(dá)對(duì)線粒體自噬的促進(jìn)作用明顯減弱，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II蛋白表達(dá)水平升高不顯著（圖11A），線粒體與自噬體的共定位減少（圖11B）。相反，在過表達(dá)MIP的細(xì)胞中，敲低EndophilinB2，線粒體自噬受到的抑制作用也有所減輕。這些結(jié)果表明，EndophilinB2與MIP的相互作用在調(diào)控線粒體自噬過程中起著重要作用，兩者可能協(xié)同發(fā)揮作用來調(diào)節(jié)線粒體自噬。[此處插入圖11，圖11A為MIP敲低后EndophilinB2過表達(dá)對(duì)LC3-II蛋白表達(dá)影響的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、MIP敲低組、MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組LC3-II蛋白表達(dá)升高不顯著；圖11B為MIP敲低后EndophilinB2過表達(dá)對(duì)線粒體與自噬體共定位影響的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組線粒體與自噬體的共定位顯著低于EndophilinB2過表達(dá)組][此處插入圖11，圖11A為MIP敲低后EndophilinB2過表達(dá)對(duì)LC3-II蛋白表達(dá)影響的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、MIP敲低組、MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組LC3-II蛋白表達(dá)升高不顯著；圖11B為MIP敲低后EndophilinB2過表達(dá)對(duì)線粒體與自噬體共定位影響的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示MIP敲低+EndophilinB2過表達(dá)組線粒體與自噬體的共定位顯著低于EndophilinB2過表達(dá)組]進(jìn)一步對(duì)MIP的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MIP可以與線粒體自噬受體NIX相互作用。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MIP與NIX之間的相互作用（圖12A）。在MIP敲低的細(xì)胞中，NIX介導(dǎo)的線粒體自噬也受到抑制，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II蛋白表達(dá)水平降低（圖12B）和線粒體與自噬體的共定位減少（圖12C）。這表明MIP可能通過與NIX相互作用，參與NIX介導(dǎo)的線粒體自噬途徑。結(jié)合EndophilinB2與MIP的相互作用，推測(cè)EndophilinB2可能通過與MIP相互作用，間接影響NIX介導(dǎo)的線粒體自噬。[此處插入圖12，圖12A為MIP與NIX免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中MIP和NIX的表達(dá)條帶，右圖為抗MIP抗體免疫沉淀（IP:MIP）后復(fù)合物中NIX的檢測(cè)條帶；圖12B為MIP敲低對(duì)NIX介導(dǎo)的LC3-II蛋白表達(dá)影響的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、MIP敲低組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，MIP敲低組LC3-II蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組；圖12C為MIP敲低對(duì)NIX介導(dǎo)的線粒體與自噬體共定位影響的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示MIP敲低組線粒體與自噬體的共定位顯著低于對(duì)照組][此處插入圖12，圖12A為MIP與NIX免疫共沉淀的Westernblot條帶圖，左圖為全細(xì)胞裂解液（WCL）中MIP和NIX的表達(dá)條帶，右圖為抗MIP抗體免疫沉淀（IP:MIP）后復(fù)合物中NIX的檢測(cè)條帶；圖12B為MIP敲低對(duì)NIX介導(dǎo)的LC3-II蛋白表達(dá)影響的Westernblot檢測(cè)條帶圖及定量分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、MIP敲低組），縱坐標(biāo)為L(zhǎng)C3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量，MIP敲低組LC3-II蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組；圖12C為MIP敲低對(duì)NIX介導(dǎo)的線粒體與自噬體共定位影響的熒光顯微鏡圖及定量分析柱狀圖，綠色為自噬體標(biāo)記物，紅色為線粒體標(biāo)記物，定量分析顯示MIP敲低組線粒體與自噬體的共定位顯著低于對(duì)照組]EndophilinB2與新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白MIP的相互作用，為線粒體自噬調(diào)控機(jī)制的研究提供了新的視角。MIP可能作為一個(gè)橋梁分子，連接EndophilinB2與NIX介導(dǎo)的線粒體自噬途徑，共同參與線粒體自噬的調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)豐富了我們對(duì)線粒體自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步探究EndophilinB2在細(xì)胞生理和病理過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.2EndophilinB2調(diào)控線粒體自噬的信號(hào)通路4.2.1可能參與的經(jīng)典信號(hào)通路為了探究EndophilinB2是否參與經(jīng)典信號(hào)通路對(duì)線粒體自噬的調(diào)控，對(duì)P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路進(jìn)行深入研究。P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝以及自噬等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中mTOR作為該通路的核心節(jié)點(diǎn)，是細(xì)胞內(nèi)重要的能量和營(yíng)養(yǎng)感受器，對(duì)自噬的起始具有負(fù)調(diào)控作用。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)充足、能量水平較高時(shí)，P13K被激活，進(jìn)而磷酸化并激活下游的Akt。激活的Akt可以通過多種方式抑制自噬，其中重要的途徑之一就是激活mTOR。mTOR通過磷酸化自噬相關(guān)蛋白ULK1復(fù)合物中的ULK1和ATG13等蛋白，抑制ULK1復(fù)合物的活性，從而阻斷自噬的起始，包括線粒體自噬。當(dāng)細(xì)胞受到營(yíng)養(yǎng)缺乏、能量應(yīng)激等刺激時(shí)，P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路的活性受到抑制，mTOR的活性降低，解除了對(duì)ULK1復(fù)合物的抑制作用，使得ULK1復(fù)合物被激活，啟動(dòng)自噬過程。在研究EndophilinB2與P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路的關(guān)系時(shí)，通過Westernblot檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。在正常培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中，檢測(cè)到Akt和mTOR處于較高的磷酸化水平，表明P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路處于激活狀態(tài)（圖13A）。當(dāng)用CCCP處理細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體自噬時(shí)，發(fā)現(xiàn)Akt和mTOR的磷酸化水平有所下降（圖13B），說明CCCP處理抑制了P13K-Akt-mTOR信號(hào)通路的活性，這與已有研究中應(yīng)激條件下該信號(hào)通路的變化一致。[此處插入圖13，圖13A為正常培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中Akt和mTOR磷酸化水平的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組），縱坐標(biāo)為蛋白磷酸化水平，條帶下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的蛋白名稱p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR；圖13B為CCCP處理后的HEK293T細(xì)胞中Akt和mTOR磷酸化水平的Westernblot條帶圖，橫坐標(biāo)為組別（CCCP處