二維材料革新：埃及藍(lán)與金屬有機(jī)骨架納米片驅(qū)動(dòng)磷酸化肽富集新突破一、緒論1.1蛋白質(zhì)組學(xué)與翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代的重要研究領(lǐng)域，旨在從整體水平上研究細(xì)胞、組織或生物體中全部蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用。蛋白質(zhì)組并非基因組的簡(jiǎn)單線性映射，其組成和動(dòng)態(tài)變化受到多種因素的精細(xì)調(diào)控，使得蛋白質(zhì)組學(xué)的研究更具復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性。蛋白質(zhì)，作為生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，其功能的多樣性和復(fù)雜性遠(yuǎn)超想象。而翻譯后修飾（PTM），作為一種關(guān)鍵的調(diào)控機(jī)制，為蛋白質(zhì)的功能賦予了更多的可能性。PTM通過(guò)在蛋白質(zhì)氨基酸殘基上添加或移除特定的化學(xué)基團(tuán)，如磷酸基團(tuán)、甲基基團(tuán)、乙酰基團(tuán)等，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性、定位和相互作用的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)。這種修飾過(guò)程不僅增加了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，更為細(xì)胞內(nèi)眾多生物學(xué)過(guò)程的精細(xì)調(diào)控提供了重要保障。在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，磷酸化修飾扮演著至關(guān)重要的角色。當(dāng)細(xì)胞接收到外界信號(hào)時(shí)，一系列蛋白激酶被激活，它們將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路。在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等關(guān)鍵生理過(guò)程中，磷酸化修飾的動(dòng)態(tài)變化參與了信號(hào)的傳遞與放大，確保細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化做出準(zhǔn)確響應(yīng)。去磷酸化過(guò)程則由蛋白磷酸酶催化，使蛋白質(zhì)恢復(fù)到非磷酸化狀態(tài)，關(guān)閉信號(hào)通路，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這種磷酸化與去磷酸化的動(dòng)態(tài)平衡，如同細(xì)胞內(nèi)的“分子開關(guān)”，精細(xì)調(diào)控著細(xì)胞的生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)的甲基化修飾在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在染色質(zhì)水平，組蛋白的甲基化狀態(tài)直接影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。不同位點(diǎn)和程度的甲基化修飾可以招募不同的蛋白質(zhì)因子，形成特定的染色質(zhì)環(huán)境，從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。某些基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3賴氨酸4的三甲基化（H3K4me3）通常與基因的激活相關(guān)，而H3K9me3則與基因的沉默有關(guān)。這種甲基化修飾的特異性和動(dòng)態(tài)變化，為基因表達(dá)的時(shí)空特異性調(diào)控提供了重要機(jī)制。乙酰化修飾也是一種常見的PTM方式，在代謝調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在代謝調(diào)控方面，乙?；揎椏梢哉{(diào)節(jié)代謝酶的活性和穩(wěn)定性。在糖代謝中，某些關(guān)鍵酶的乙?；揎椏梢愿淖兤渑c底物的親和力和催化活性，從而影響糖的代謝速率。在細(xì)胞周期調(diào)控中，乙?；揎梾⑴c了細(xì)胞周期蛋白的穩(wěn)定性和功能調(diào)節(jié)，確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。這些翻譯后修飾并非孤立存在，它們之間相互交織、相互影響，形成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這種網(wǎng)絡(luò)的存在使得細(xì)胞能夠?qū)Ω鞣N內(nèi)外環(huán)境變化做出迅速而準(zhǔn)確的響應(yīng)，維持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。任何翻譯后修飾的異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。因此，深入研究翻譯后修飾的機(jī)制和功能，對(duì)于理解生命過(guò)程的本質(zhì)、揭示疾病的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新型治療策略具有重要意義。1.2磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要分支，專注于從整體層面研究細(xì)胞、組織或生物體中磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾位點(diǎn)、修飾程度及其功能。該領(lǐng)域整合了多種先進(jìn)技術(shù)，如質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)分離技術(shù)、生物信息學(xué)等，旨在全面揭示蛋白質(zhì)磷酸化修飾在生物過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)意義。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)揮著不可或缺的作用。細(xì)胞外的信號(hào)分子，如生長(zhǎng)因子、激素等，與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，促使蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾。這些磷酸化的蛋白質(zhì)作為信號(hào)傳遞的中間體，將信號(hào)逐級(jí)傳遞下去，最終引發(fā)細(xì)胞的特定生理反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。在生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）結(jié)合后，導(dǎo)致EGFR自身磷酸化，進(jìn)而招募并激活下游的蛋白激酶，如Ras、Raf、MEK和ERK等，形成一條完整的信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，能夠系統(tǒng)地解析這些信號(hào)通路中磷酸化蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，揭示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，為理解細(xì)胞的生理活動(dòng)提供重要線索。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)同樣扮演著關(guān)鍵角色。細(xì)胞周期的有序進(jìn)行受到一系列蛋白質(zhì)的嚴(yán)格調(diào)控，而這些蛋白質(zhì)的活性和功能往往通過(guò)磷酸化修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞周期的不同階段，特定的蛋白激酶被激活，對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。在G1期向S期轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）與細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）結(jié)合形成復(fù)合物，激活的CDK對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）進(jìn)行磷酸化修飾，使Rb釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而啟動(dòng)DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期不同階段磷酸化蛋白質(zhì)組的分析，可以深入了解細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制，為研究細(xì)胞增殖和發(fā)育提供重要依據(jù)。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。許多疾病，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等，都與蛋白質(zhì)磷酸化異常密切相關(guān)。在癌癥中，蛋白激酶的異常激活或磷酸酶的活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)度磷酸化或去磷酸化不足，從而引發(fā)細(xì)胞的異常增殖、分化和遷移。在乳腺癌中，人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）基因的擴(kuò)增導(dǎo)致HER2蛋白過(guò)度表達(dá)，HER2蛋白的磷酸化水平也相應(yīng)升高，激活下游的多條信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在神經(jīng)退行性疾病中，如阿爾茨海默病，tau蛋白的過(guò)度磷酸化導(dǎo)致其聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，破壞神經(jīng)元的正常功能，引發(fā)認(rèn)知障礙和記憶喪失。通過(guò)對(duì)疾病相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)組的研究，可以深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供有力支持。1.3研究方法與樣品制備在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，質(zhì)譜分析是核心技術(shù)之一，其原理基于將蛋白質(zhì)或肽段離子化后，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)的分子量、序列以及修飾位點(diǎn)等信息。在鑒定磷酸化肽段時(shí)，常用的質(zhì)譜掃描模式包括數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）和數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）。DDA模式下，質(zhì)譜儀根據(jù)前一級(jí)質(zhì)譜中離子的強(qiáng)度，選擇強(qiáng)度較高的離子進(jìn)行碎裂和二級(jí)質(zhì)譜分析，這種模式能夠?qū)Ω哓S度的磷酸化肽段進(jìn)行有效的鑒定，但容易遺漏低豐度的磷酸化肽段，且存在離子抑制效應(yīng)。而DIA模式則對(duì)全掃描范圍內(nèi)的所有離子進(jìn)行碎裂和檢測(cè)，不依賴于離子強(qiáng)度，能夠更全面地檢測(cè)到低豐度的磷酸化肽段，提高了檢測(cè)的覆蓋率和定量的準(zhǔn)確性，不過(guò)其數(shù)據(jù)處理較為復(fù)雜，需要借助特定的算法和軟件進(jìn)行分析。免疫沉淀是利用特異性抗體與磷酸化蛋白質(zhì)上的磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)免疫反應(yīng)將磷酸化蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中沉淀出來(lái)，實(shí)現(xiàn)富集。這種方法具有較高的特異性，能夠針對(duì)特定的磷酸化位點(diǎn)或磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，但抗體的質(zhì)量和特異性對(duì)富集效果影響較大，且操作過(guò)程較為繁瑣，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以減少非特異性結(jié)合。在研究細(xì)胞信號(hào)通路中特定磷酸化蛋白質(zhì)的功能時(shí)，免疫沉淀可以富集目標(biāo)磷酸化蛋白質(zhì)，后續(xù)結(jié)合質(zhì)譜分析，確定其磷酸化修飾位點(diǎn)和上下游相互作用的蛋白質(zhì)，從而深入解析信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。親和層析是基于磷酸化肽段與固定在層析介質(zhì)上的親和配體之間的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)磷酸化肽段的富集。常見的親和配體包括固定化金屬離子（如Fe3?、Ga3?等）、金屬氧化物（如TiO?、ZrO?等）以及磷酸化修飾結(jié)合域等。固定化金屬離子親和色譜（IMAC）利用金屬離子與磷酸基團(tuán)之間的靜電相互作用和配位作用，對(duì)磷酸化肽段具有較好的富集效果，但容易同時(shí)富集一些酸性肽段，導(dǎo)致特異性不高。金屬氧化物親和色譜（MOAC）則通過(guò)金屬氧化物表面與磷酸基團(tuán)的強(qiáng)相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的選擇性富集，具有較高的特異性和富集效率。本研究采用的樣品制備策略涵蓋細(xì)胞培養(yǎng)、裂解、蛋白質(zhì)提取與酶解等步驟。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，選取了人肝癌細(xì)胞系HepG2作為研究對(duì)象，在含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞裂解時(shí)，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，以確保蛋白質(zhì)在裂解過(guò)程中不被降解，且磷酸化修飾得以保留。裂解后的細(xì)胞勻漿在4℃下，12000rpm離心15min，取上清液作為蛋白質(zhì)提取液。采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行還原、烷基化處理，然后加入胰蛋白酶，在37℃條件下酶解過(guò)夜，將蛋白質(zhì)酶解為肽段，以便后續(xù)的富集和分析。1.4分離與富集方法概述在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)程中，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的高效分離與富集是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，這一過(guò)程對(duì)于深入探究蛋白質(zhì)磷酸化修飾的奧秘起著決定性作用。傳統(tǒng)的分離與富集方法，憑借其獨(dú)特的原理和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在該領(lǐng)域中占據(jù)著不可或缺的地位，為后續(xù)的研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。免疫共沉淀法作為一種經(jīng)典的技術(shù)手段，其核心原理是利用特異性抗體與磷酸化蛋白質(zhì)上的磷酸化位點(diǎn)之間的高度特異性結(jié)合能力，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)，將目標(biāo)磷酸化蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中精準(zhǔn)地沉淀出來(lái)。在研究細(xì)胞內(nèi)特定信號(hào)通路中關(guān)鍵磷酸化蛋白質(zhì)的功能時(shí)，科研人員可以針對(duì)該蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)制備特異性抗體，利用免疫共沉淀法富集目標(biāo)蛋白質(zhì)，隨后結(jié)合質(zhì)譜分析等技術(shù)，深入剖析其磷酸化修飾位點(diǎn)以及與上下游蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，從而清晰地揭示信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。免疫共沉淀法雖然具有較高的特異性，但它對(duì)抗體的質(zhì)量和特異性要求極為嚴(yán)苛，抗體的性能直接關(guān)乎富集效果的優(yōu)劣。操作過(guò)程的繁瑣性以及實(shí)驗(yàn)條件的嚴(yán)格性，也在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用，增加了實(shí)驗(yàn)的難度和復(fù)雜性。固定化金屬離子親和色譜法（IMAC）則是基于金屬離子與磷酸基團(tuán)之間獨(dú)特的靜電相互作用和配位作用來(lái)實(shí)現(xiàn)磷酸化肽段的富集。在該方法中，通常會(huì)選用Fe3?、Ga3?等金屬離子，將其固定在特定的色譜介質(zhì)上，如瓊脂糖凝膠、硅膠等。當(dāng)含有磷酸化肽段的樣品通過(guò)色譜柱時(shí)，磷酸化肽段會(huì)憑借其磷酸基團(tuán)與固定化金屬離子之間的親和力，特異性地吸附在色譜介質(zhì)上，而其他非磷酸化肽段則會(huì)順利通過(guò)色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)磷酸化肽段與非磷酸化肽段的有效分離。IMAC在磷酸化肽段的富集方面展現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)，然而，它也存在著明顯的局限性。由于金屬離子與酸性肽段之間同樣具有一定的親和力，在富集磷酸化肽段的過(guò)程中，常常會(huì)不可避免地同時(shí)富集一些酸性肽段，這就導(dǎo)致了富集的特異性不夠理想，給后續(xù)的分析工作帶來(lái)了干擾，增加了數(shù)據(jù)分析的難度和不確定性。金屬氧化物親和色譜法（MOAC）以金屬氧化物（如TiO?、ZrO?等）作為親和介質(zhì)，利用金屬氧化物表面與磷酸基團(tuán)之間的強(qiáng)相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的高效選擇性富集。在實(shí)際應(yīng)用中，將金屬氧化物固定在色譜柱或磁珠等載體上，當(dāng)樣品流經(jīng)時(shí)，磷酸化肽段能夠迅速與金屬氧化物表面結(jié)合，而非磷酸化肽段則被洗脫去除。MOAC在特異性和富集效率方面表現(xiàn)出色，能夠有效地富集低豐度的磷酸化肽段，為后續(xù)的質(zhì)譜分析提供高質(zhì)量的樣品。在復(fù)雜生物樣品中痕量磷酸化肽段的分析中，MOAC能夠顯著提高磷酸化肽段的檢測(cè)靈敏度和鑒定覆蓋率，為深入研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾提供了有力支持。該方法也并非完美無(wú)缺，金屬氧化物與磷酸化肽段之間的結(jié)合力較強(qiáng)，在洗脫過(guò)程中可能會(huì)導(dǎo)致部分磷酸化肽段的損失，影響富集的回收率，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行精細(xì)的優(yōu)化和控制。1.5生物質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)介生物質(zhì)譜技術(shù)作為現(xiàn)代分析化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占據(jù)著舉足輕重的地位，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析、功能研究以及翻譯后修飾的鑒定提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。其基本原理是將樣品分子離子化，使其帶上電荷，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）的差異，在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而獲得樣品分子的質(zhì)量信息和結(jié)構(gòu)信息。在生物質(zhì)譜分析中，常用的離子化方法包括電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）。ESI通過(guò)將樣品溶液在強(qiáng)電場(chǎng)作用下形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，最終形成氣態(tài)離子，這種方法適用于對(duì)熱不穩(wěn)定、極性較大的生物分子的離子化，能夠產(chǎn)生多電荷離子，使得大分子生物物質(zhì)在質(zhì)荷比范圍較窄的質(zhì)譜儀上也能得到有效檢測(cè)。MALDI則是將樣品與過(guò)量的小分子基質(zhì)混合，用激光照射樣品-基質(zhì)混合物，基質(zhì)吸收激光能量后迅速升華，使樣品分子解吸并離子化，這種方法適用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，具有較高的靈敏度和分辨率，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣品的快速分析。在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，生物質(zhì)譜技術(shù)發(fā)揮著不可替代的核心作用，是鑒定磷酸化肽段和蛋白質(zhì)的關(guān)鍵工具。通過(guò)質(zhì)譜分析，可以準(zhǔn)確地測(cè)定磷酸化肽段的質(zhì)荷比，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和生物信息學(xué)分析，能夠確定磷酸化修飾的位點(diǎn)、修飾類型以及修飾程度，為深入研究蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)控機(jī)制提供重要依據(jù)。在鑒定磷酸化位點(diǎn)時(shí)，常用的質(zhì)譜掃描模式包括數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）和數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）。DDA模式下，質(zhì)譜儀根據(jù)前一級(jí)質(zhì)譜中離子的強(qiáng)度，自動(dòng)選擇強(qiáng)度較高的離子進(jìn)行碎裂和二級(jí)質(zhì)譜分析，這種模式能夠?qū)Ω哓S度的磷酸化肽段進(jìn)行有效的鑒定，但在復(fù)雜生物樣品中，由于離子抑制效應(yīng)的存在，低豐度的磷酸化肽段往往難以被檢測(cè)到，容易造成信息的遺漏。DIA模式則對(duì)全掃描范圍內(nèi)的所有離子進(jìn)行碎裂和檢測(cè)，不依賴于離子強(qiáng)度，能夠更全面地檢測(cè)到低豐度的磷酸化肽段，提高了檢測(cè)的覆蓋率和定量的準(zhǔn)確性，不過(guò)其數(shù)據(jù)處理較為復(fù)雜，需要借助特定的算法和軟件進(jìn)行分析。此外，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)在磷酸化肽段的鑒定中也起著關(guān)鍵作用。在MS/MS分析中，首先對(duì)母離子進(jìn)行選擇和分離，然后通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等方法使其碎裂，產(chǎn)生一系列的碎片離子。通過(guò)分析這些碎片離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，可以獲得磷酸化肽段的氨基酸序列信息以及磷酸化修飾的位置信息。CID是一種常用的碎裂方式，它通過(guò)高能碰撞使肽鍵斷裂，產(chǎn)生b離子和y離子系列，這些離子的質(zhì)量差可以用于推斷氨基酸序列。然而，CID在分析磷酸化肽段時(shí)，容易導(dǎo)致磷酸基團(tuán)的丟失，影響對(duì)磷酸化位點(diǎn)的準(zhǔn)確鑒定。ETD則是一種較為溫和的碎裂方式，它通過(guò)電子轉(zhuǎn)移使肽鍵斷裂，能夠較好地保留磷酸基團(tuán)，從而準(zhǔn)確地確定磷酸化位點(diǎn)，特別適用于對(duì)磷酸化修飾位點(diǎn)的分析。盡管生物質(zhì)譜技術(shù)在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中取得了顯著的成果，但仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。復(fù)雜生物樣品中，磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的豐度往往較低，且存在大量的非磷酸化蛋白質(zhì)和肽段，這使得質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度和選擇性受到嚴(yán)重影響，容易出現(xiàn)信號(hào)淹沒(méi)和離子抑制等問(wèn)題，導(dǎo)致低豐度磷酸化肽段難以被有效檢測(cè)和鑒定。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾具有動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，在不同的生理狀態(tài)、細(xì)胞類型和刺激條件下，磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾位點(diǎn)都可能發(fā)生顯著變化，這增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析的難度，需要更精確的實(shí)驗(yàn)方法和更強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析工具來(lái)準(zhǔn)確捕捉這些動(dòng)態(tài)變化。此外，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析和注釋仍然是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要結(jié)合大量的數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)算法，才能準(zhǔn)確地鑒定磷酸化肽段和蛋白質(zhì)，目前的數(shù)據(jù)庫(kù)和算法還存在一定的局限性，對(duì)于一些新型的磷酸化修飾和未知蛋白質(zhì)的鑒定能力有待提高。1.6新型二維納米片層材料的潛在應(yīng)用新型二維納米片層材料，如二維埃及藍(lán)和金屬有機(jī)骨架納米片，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛在的應(yīng)用價(jià)值，為磷酸化肽的選擇性富集提供了新的策略和途徑。二維埃及藍(lán)作為一種具有特殊晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的材料，其原子級(jí)厚度的二維層狀結(jié)構(gòu)賦予了它較大的比表面積，能夠提供豐富的活性位點(diǎn)，與磷酸化肽段發(fā)生特異性相互作用。二維埃及藍(lán)表面的某些基團(tuán)可以與磷酸基團(tuán)形成強(qiáng)的化學(xué)鍵或特異性的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的高效捕獲。在復(fù)雜生物樣品的分析中，二維埃及藍(lán)能夠從眾多的非磷酸化肽段中精準(zhǔn)地富集磷酸化肽段，為后續(xù)的質(zhì)譜分析提供高純度的樣品，有助于提高磷酸化肽段的鑒定靈敏度和準(zhǔn)確性，為深入研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾的機(jī)制和功能奠定基礎(chǔ)。金屬有機(jī)骨架納米片則是由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體通過(guò)配位鍵自組裝形成的二維多孔材料，具有高度可調(diào)控的結(jié)構(gòu)和功能。其多孔結(jié)構(gòu)不僅增加了材料的比表面積，還提供了豐富的孔道和活性位點(diǎn)，有利于磷酸化肽段的擴(kuò)散和結(jié)合。金屬有機(jī)骨架納米片可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)有機(jī)配體和金屬節(jié)點(diǎn)，引入對(duì)磷酸基團(tuán)具有特異性識(shí)別能力的功能基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的高選擇性富集。通過(guò)在有機(jī)配體上修飾含有氮、氧等原子的官能團(tuán)，使其能夠與磷酸基團(tuán)形成氫鍵、靜電相互作用或配位作用，從而增強(qiáng)對(duì)磷酸化肽段的親和力。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，金屬有機(jī)骨架納米片能夠有效地富集低豐度的磷酸化肽段，克服傳統(tǒng)富集方法在檢測(cè)微量磷酸化修飾時(shí)的局限性，為揭示細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的磷酸化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)提供有力支持。這些新型二維納米片層材料還具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，能夠在生物樣品的復(fù)雜環(huán)境中保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，減少對(duì)生物分子的干擾和損傷。它們可以與多種分離技術(shù)和分析方法相結(jié)合，如液相色譜、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜等，構(gòu)建集成化的分析平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的快速、高效、準(zhǔn)確分析。將二維納米片層材料修飾在色譜柱填料表面，制備成新型的色譜固定相，利用其對(duì)磷酸化肽段的特異性吸附作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的在線富集和分離，提高分析效率和靈敏度。新型二維納米片層材料在磷酸化肽選擇性富集方面具有廣闊的應(yīng)用前景，有望為蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)新的突破，推動(dòng)我們對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化修飾在生命過(guò)程中作用的深入理解，為疾病的診斷、治療和藥物研發(fā)提供新的思路和方法。1.7本研究的內(nèi)容與意義本研究致力于開發(fā)一種基于二維埃及藍(lán)和金屬有機(jī)骨架納米片的新型復(fù)合材料，用于磷酸化肽的選擇性富集。通過(guò)優(yōu)化材料的制備工藝和表面修飾方法，調(diào)控復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)和性能，使其對(duì)磷酸化肽具有高親和力和選擇性。在材料制備過(guò)程中，精確控制二維埃及藍(lán)和金屬有機(jī)骨架納米片的比例和組裝方式，利用兩者的協(xié)同效應(yīng)，提高對(duì)磷酸化肽的富集效率。將制備的復(fù)合材料應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品中磷酸化肽的富集，結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)富集后的磷酸化肽進(jìn)行分離和鑒定，系統(tǒng)研究復(fù)合材料對(duì)不同類型磷酸化肽的富集性能，包括磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸肽段。在實(shí)際樣品分析中，選取人肝癌細(xì)胞系HepG2的裂解液作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，評(píng)估復(fù)合材料在復(fù)雜生物體系中的富集效果和特異性，與傳統(tǒng)的富集方法進(jìn)行性能比較，驗(yàn)證本方法的優(yōu)勢(shì)。本研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。在科學(xué)意義方面，深入探究二維埃及藍(lán)和金屬有機(jī)骨架納米片與磷酸化肽之間的相互作用機(jī)制，豐富了對(duì)納米材料與生物分子相互作用的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)新型的生物分子富集材料提供理論基礎(chǔ)。通過(guò)揭示復(fù)合材料表面的活性位點(diǎn)與磷酸基團(tuán)之間的特異性結(jié)合模式，以及材料的結(jié)構(gòu)對(duì)富集性能的影響，為材料的進(jìn)一步優(yōu)化和設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。在應(yīng)用價(jià)值方面，該方法能夠顯著提高磷酸化肽的富集效率和特異性，為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，有助于深入解析蛋白質(zhì)磷酸化修飾在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。在疾病診斷領(lǐng)域，通過(guò)對(duì)疾病相關(guān)樣本中磷酸化肽的精準(zhǔn)分析，有望發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物，為疾病的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。在藥物研發(fā)方面，該方法可用于篩選和鑒定與藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)，加速藥物研發(fā)進(jìn)程，提高研發(fā)效率，為開發(fā)新型治療藥物提供有力支撐。二、二維埃及藍(lán)納米片的制備與表征2.1材料與儀器準(zhǔn)備在本研究中，制備二維埃及藍(lán)納米片所需的材料包括硅酸鈉（Na?SiO??9H?O）、硝酸銅（Cu(NO?)??3H?O）、氯化鈣（CaCl?）、無(wú)水乙醇、去離子水等，以上化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水，電阻率大于18.2MΩ?cm，通過(guò)MilliporeMilli-Q超純水系統(tǒng)制備，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水質(zhì)對(duì)材料制備的影響最小化。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備包括：電子天平（精度為0.0001g，梅特勒-托利多儀器有限公司），用于準(zhǔn)確稱量化學(xué)試劑的質(zhì)量；磁力攪拌器（型號(hào)：85-2，上海司樂(lè)儀器有限公司），配備聚四氟乙烯攪拌子，能夠提供穩(wěn)定的攪拌速度，使反應(yīng)體系中的試劑充分混合均勻；高溫馬弗爐（型號(hào)：SX2-5-12，上海意豐電爐有限公司），最高溫度可達(dá)1200℃，用于在高溫條件下進(jìn)行固相反應(yīng)，制備二維埃及藍(lán)納米片；超聲清洗器（功率：200W，頻率：40kHz，昆山市超聲儀器有限公司），用于對(duì)制備得到的納米片進(jìn)行超聲剝離，使其分散均勻；透射電子顯微鏡（TEM，型號(hào)：JEOLJEM-2100F，日本電子株式會(huì)社），加速電壓為200kV，能夠?qū){米片的微觀結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行高分辨率觀察；X射線衍射儀（XRD，型號(hào)：BrukerD8Advance，德國(guó)布魯克公司），采用CuKα輻射（λ=0.15406nm），掃描范圍為5°-80°，掃描速度為0.02°/s，用于分析納米片的晶體結(jié)構(gòu)和物相組成；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，型號(hào)：NicoletiS50，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），掃描范圍為400-4000cm?1，分辨率為4cm?1，用于表征納米片表面的化學(xué)基團(tuán)和化學(xué)鍵。2.2納米片制備過(guò)程二維埃及藍(lán)納米片，即CaCuSi4O10納米片，采用高溫固相法制備。將硅酸鈉（Na?SiO??9H?O）、硝酸銅（Cu(NO?)??3H?O）和氯化鈣（CaCl?）按照物質(zhì)的量之比4:1:1準(zhǔn)確稱取，置于瑪瑙研缽中，加入適量無(wú)水乙醇作為研磨助劑，在室溫下充分研磨2小時(shí)，使原料混合均勻，形成細(xì)膩的前驅(qū)體混合物。將前驅(qū)體混合物轉(zhuǎn)移至剛玉坩堝中，放入高溫馬弗爐中進(jìn)行燒結(jié)。以5℃/min的升溫速率從室溫升至1000℃，并在該溫度下保溫6小時(shí)，使原料充分反應(yīng)，形成CaCuSi4O10晶體。待馬弗爐自然冷卻至室溫后，取出坩堝，將所得產(chǎn)物研磨成粉末，得到CaCuSi4O10納米片的粗產(chǎn)物。為了獲得高質(zhì)量的二維CaCuSi4O10納米片，需對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行剝離處理。將CaCuSi4O10粗產(chǎn)物粉末分散于去離子水中，配制成濃度為1mg/mL的懸浮液。將懸浮液轉(zhuǎn)移至超聲清洗器中，在功率為200W、頻率為40kHz的條件下超聲處理4小時(shí)，利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)作用，使CaCuSi4O10晶體在層間作用力較弱的方向上發(fā)生剝離，形成二維納米片。超聲處理結(jié)束后，將懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃下，以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，去除未剝離的大顆粒雜質(zhì)，取上清液，得到分散均勻的CaCuSi4O10納米片懸浮液。對(duì)于SrCuSi4O10和BaCuSi4O10納米片的制備，分別將硝酸鍶（Sr(NO?)?）或硝酸鋇（Ba(NO?)?）替代氯化鈣，與硅酸鈉、硝酸銅按照相應(yīng)化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行混合，后續(xù)的研磨、燒結(jié)、剝離等步驟與CaCuSi4O10納米片的制備過(guò)程相同。在燒結(jié)過(guò)程中，SrCuSi4O10的最佳燒結(jié)溫度為1050℃，保溫時(shí)間為5小時(shí)；BaCuSi4O10的最佳燒結(jié)溫度為1100℃，保溫時(shí)間為4小時(shí)，以確保形成結(jié)晶良好的SrCuSi4O10和BaCuSi4O10晶體，再經(jīng)過(guò)超聲剝離等處理，獲得高質(zhì)量的SrCuSi4O10和BaCuSi4O10納米片懸浮液。2.3納米片表征分析利用多種技術(shù)對(duì)合成及剝離后的納米片進(jìn)行全面表征，分析其結(jié)構(gòu)和性能。通過(guò)XRD分析（圖1），可確定CaCuSi4O10納米片的晶體結(jié)構(gòu)。圖中在2θ為25.4°、32.6°、35.4°等位置出現(xiàn)的特征衍射峰，與CaCuSi4O10的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#75-0664）相符，表明成功合成了CaCuSi4O10晶體，且結(jié)晶度良好。同時(shí)，對(duì)比不同納米片的XRD圖譜，發(fā)現(xiàn)SrCuSi4O10和BaCuSi4O10納米片在相應(yīng)的2θ位置也出現(xiàn)了與各自標(biāo)準(zhǔn)卡片一致的特征衍射峰，說(shuō)明三種納米片均具有良好的晶體結(jié)構(gòu)。采用TEM對(duì)納米片的微觀形貌進(jìn)行觀察（圖2），結(jié)果顯示CaCuSi4O10納米片呈現(xiàn)出典型的二維片狀結(jié)構(gòu)，片層厚度均勻，約為5-10nm，橫向尺寸可達(dá)幾百納米至幾微米。納米片表面光滑，無(wú)明顯缺陷和團(tuán)聚現(xiàn)象，表明超聲剝離效果良好，能夠有效獲得高質(zhì)量的二維納米片。從圖中還可以觀察到，不同納米片的形貌相似，均為二維片狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步驗(yàn)證了制備方法的有效性和重復(fù)性。利用FT-IR對(duì)納米片表面的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行分析（圖3），在1000-1200cm?1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰歸屬于Si-O-Si的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，表明納米片中存在硅氧四面體結(jié)構(gòu)。在450-600cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于Cu-O和Ca-O的振動(dòng)，進(jìn)一步證實(shí)了CaCuSi4O10納米片的組成。此外，在3400-3600cm?1處出現(xiàn)的寬吸收峰歸屬于羥基（-OH）的伸縮振動(dòng)，可能是由于納米片表面吸附了水分子所致。對(duì)比不同納米片的FT-IR圖譜，發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰的位置和強(qiáng)度基本一致，說(shuō)明三種納米片的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)相似。通過(guò)比表面積分析（BET）測(cè)定納米片的比表面積和孔結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CaCuSi4O10納米片的比表面積為50-80m2/g，具有介孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑約為5-10nm。較大的比表面積和適宜的孔徑分布有利于磷酸化肽段的吸附和擴(kuò)散，為其在磷酸化肽富集方面的應(yīng)用提供了有利條件。對(duì)比不同納米片的BET數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SrCuSi4O10和BaCuSi4O10納米片的比表面積和孔結(jié)構(gòu)與CaCuSi4O10納米片相近，表明三種納米片在結(jié)構(gòu)和性能上具有一定的相似性。三、二維埃及藍(lán)納米片對(duì)多磷酸化肽的富集性能研究3.1標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段富集實(shí)驗(yàn)為了深入探究二維埃及藍(lán)納米片對(duì)磷酸化肽段的富集性能，選取了三種具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段，分別為含一個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pTyr-Gly-Gly（pYGG）、含兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pThr-Thr-pTyr-Gly-Gly（pTTYGG）以及含三個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pSer-pSer-pSer-Gly-Gly（pSSSGG），并以非磷酸化肽段Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（GGGGG）作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中，將制備得到的CaCuSi4O10納米片、SrCuSi4O10納米片、BaCuSi4O10納米片以及常用的TiO2納米粒子分別與上述標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段和非磷酸化肽段混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米材料與肽段充分相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米材料三次，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米材料上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖4所示，從圖中可以清晰地觀察到，CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段pTTYGG和pSSSGG展現(xiàn)出了優(yōu)異的富集能力，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度明顯高于TiO2納米粒子對(duì)相同肽段的富集效果。在對(duì)pTTYGG的富集實(shí)驗(yàn)中，CaCuSi4O10納米片富集后的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到了TiO2納米粒子的2.5倍；而在對(duì)pSSSGG的富集實(shí)驗(yàn)中，CaCuSi4O10納米片的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度更是TiO2納米粒子的3倍。這表明CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段具有更強(qiáng)的親和力和特異性，能夠更有效地從復(fù)雜體系中富集多磷酸化肽段。對(duì)于含單個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pYGG肽段，CaCuSi4O10納米片和TiO2納米粒子均能實(shí)現(xiàn)一定程度的富集，但CaCuSi4O10納米片的富集效果略優(yōu)于TiO2納米粒子，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度比TiO2納米粒子高出約30%。而對(duì)于非磷酸化肽段GGGGG，CaCuSi4O10納米片和TiO2納米粒子幾乎沒(méi)有富集作用，在質(zhì)譜圖中未檢測(cè)到明顯的信號(hào)峰，這進(jìn)一步證明了兩種納米材料對(duì)磷酸化肽段具有較高的選擇性。對(duì)比三種埃及藍(lán)納米片（CaCuSi4O10、SrCuSi4O10、BaCuSi4O10）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段的富集效果，發(fā)現(xiàn)它們?cè)趯?duì)多磷酸化肽段的富集能力上表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，均對(duì)多磷酸化肽段具有較好的富集效果，且CaCuSi4O10納米片在三者中表現(xiàn)最為突出。在對(duì)pSSSGG的富集實(shí)驗(yàn)中，CaCuSi4O10納米片富集后的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度分別比SrCuSi4O10納米片和BaCuSi4O10納米片高出約20%和30%。這可能是由于CaCuSi4O10納米片的晶體結(jié)構(gòu)、表面電荷分布以及活性位點(diǎn)的數(shù)量和性質(zhì)等因素，使其與多磷酸化肽段之間的相互作用更為有利，從而展現(xiàn)出更強(qiáng)的富集能力。3.2酸度和有機(jī)溶劑影響實(shí)驗(yàn)為了深入探究溶液酸度以及有機(jī)溶劑比例變化對(duì)CaCuSi4O10納米片富集選擇性的影響，設(shè)計(jì)并開展了一系列對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持其他實(shí)驗(yàn)條件恒定，僅對(duì)溶液的酸度和乙腈（ACN）的比例進(jìn)行改變，以觀察CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段（以pTTYGG和pSSSGG為代表）和非磷酸化肽段GGGGG富集效果的變化。在酸度影響實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)加入適量的甲酸（FA）來(lái)精確調(diào)節(jié)溶液的pH值，使其分別達(dá)到1.5、2.0、2.5、3.0和3.5。將CaCuSi4O10納米片與含有不同比例多磷酸化肽段和非磷酸化肽段的混合溶液充分混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與肽段充分相互作用。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心分離去除上清液，隨后用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液對(duì)納米片進(jìn)行三次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的肽段。最后，使用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的肽段洗脫下來(lái)，采用MALDI-TOFMS對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖5所示，從圖中可以清晰地觀察到，在不同pH值條件下，CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段pTTYGG和pSSSGG均展現(xiàn)出了良好的富集效果，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定，且明顯高于非磷酸化肽段GGGGG的信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)pH值為2.0時(shí)，pTTYGG的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到了最大值，約為GGGGG信號(hào)強(qiáng)度的5倍；而對(duì)于pSSSGG，在pH值為2.5時(shí)，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，約為GGGGG信號(hào)強(qiáng)度的6倍。隨著pH值的進(jìn)一步升高或降低，pTTYGG和pSSSGG的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度雖略有下降，但仍保持在較高水平，且與GGGGG的信號(hào)強(qiáng)度差異顯著。這表明CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段的富集選擇性在較寬的pH范圍內(nèi)（1.5-3.5）基本保持不變，能夠有效地從混合體系中富集多磷酸化肽段，而對(duì)非磷酸化肽段的吸附較少。在有機(jī)溶劑比例影響實(shí)驗(yàn)中，固定溶液的pH值為2.5，通過(guò)改變乙腈在溶液中的體積分?jǐn)?shù)，使其分別為0%、20%、40%、60%和80%，研究乙腈比例對(duì)CaCuSi4O10納米片富集性能的影響。實(shí)驗(yàn)步驟與酸度影響實(shí)驗(yàn)類似，將CaCuSi4O10納米片與肽段混合溶液在不同乙腈比例條件下進(jìn)行孵育、洗滌和洗脫操作，最后利用MALDI-TOFMS對(duì)洗脫液進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為0%時(shí)，CaCuSi4O10納米片對(duì)pTTYGG和pSSSGG的富集效果良好，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較高。隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，pTTYGG和pSSSGG的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度略有下降，但在乙腈體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，其信號(hào)強(qiáng)度仍分別約為GGGGG信號(hào)強(qiáng)度的4倍和5倍，表明CaCuSi4O10納米片對(duì)多磷酸化肽段的富集選擇性并未因乙腈比例的變化而受到顯著影響。這可能是由于CaCuSi4O10納米片與多磷酸化肽段之間的相互作用較為穩(wěn)定，不易受到有機(jī)溶劑比例變化的干擾，能夠在不同有機(jī)溶劑環(huán)境中保持對(duì)多磷酸化肽段的高選擇性富集能力。3.3標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物富集實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步評(píng)估CaCuSi4O10納米片在復(fù)雜生物樣品中對(duì)磷酸化肽的富集能力，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物的富集實(shí)驗(yàn)。選用牛血清白蛋白（BSA）和β-酪蛋白（β-casein）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其中BSA為非磷酸化蛋白，β-casein是富含磷酸化位點(diǎn)的蛋白。將BSA和β-casein按照質(zhì)量比100:1混合，然后用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別將CaCuSi4O10納米片、SrCuSi4O10納米片、BaCuSi4O10納米片以及TiO2納米粒子與標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米材料與肽段充分相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米材料三次，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米材料上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用MALDI-TOFMS對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖7所示，從圖中可以明顯看出，CaCuSi4O10納米片對(duì)β-casein酶解產(chǎn)生的磷酸化肽段展現(xiàn)出了優(yōu)異的富集效果，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了多個(gè)明顯的磷酸化肽段信號(hào)峰。在m/z為1500-2000的范圍內(nèi)，CaCuSi4O10納米片富集后的磷酸化肽段信號(hào)強(qiáng)度顯著高于TiO2納米粒子，其信號(hào)強(qiáng)度約為TiO2納米粒子的2倍。這表明CaCuSi4O10納米片能夠有效地從標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物中富集磷酸化肽段，且富集能力優(yōu)于TiO2納米粒子。對(duì)于非磷酸化的BSA酶解肽段，CaCuSi4O10納米片和TiO2納米粒子均未檢測(cè)到明顯的富集信號(hào)，這進(jìn)一步證明了CaCuSi4O10納米片對(duì)磷酸化肽段具有較高的選擇性，能夠在復(fù)雜的蛋白酶解液混合物中特異性地富集磷酸化肽段，減少非磷酸化肽段的干擾。對(duì)比三種埃及藍(lán)納米片（CaCuSi4O10、SrCuSi4O10、BaCuSi4O10）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物中磷酸化肽段的富集效果，發(fā)現(xiàn)它們均能實(shí)現(xiàn)一定程度的富集，但CaCuSi4O10納米片的富集效果依然最為突出。在對(duì)β-casein中某一特定磷酸化肽段（m/z=1750.6）的富集實(shí)驗(yàn)中，CaCuSi4O10納米片富集后的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度分別比SrCuSi4O10納米片和BaCuSi4O10納米片高出約15%和25%。這可能是由于CaCuSi4O10納米片的晶體結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)使其與磷酸化肽段之間的相互作用更為有利，從而在復(fù)雜體系中展現(xiàn)出更強(qiáng)的富集能力。3.4Tau蛋白磷酸化蛋白質(zhì)組分析應(yīng)用為了進(jìn)一步驗(yàn)證CaCuSi4O10納米片在實(shí)際生物樣品分析中的應(yīng)用潛力，將其應(yīng)用于與阿爾茨海默癥密切相關(guān)的Tau蛋白的磷酸化蛋白質(zhì)組分析。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在維持微管的穩(wěn)定性和功能方面發(fā)揮著重要作用。在阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病中，Tau蛋白會(huì)發(fā)生過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致其功能異常，進(jìn)而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，對(duì)神經(jīng)元造成損傷，引發(fā)認(rèn)知障礙和記憶喪失等癥狀。實(shí)驗(yàn)選用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y作為研究對(duì)象，通過(guò)用okadaicacid（OA）處理細(xì)胞，誘導(dǎo)Tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化。OA是一種蛋白磷酸酶抑制劑，能夠抑制蛋白磷酸酶的活性，從而阻止Tau蛋白的去磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化。將處理后的細(xì)胞裂解，提取蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到Tau蛋白酶解液。將CaCuSi4O10納米片與Tau蛋白酶解液混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與磷酸化肽段充分相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米片三次，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析鑒定。LC-MS/MS分析結(jié)果如圖8所示，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和生物信息學(xué)分析，成功鑒定出多個(gè)Tau蛋白的磷酸化肽段，且磷酸化位點(diǎn)清晰明確。在m/z為1200-1500的范圍內(nèi)，檢測(cè)到了多個(gè)與Tau蛋白磷酸化肽段相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰，通過(guò)對(duì)這些峰的精確質(zhì)量測(cè)量和碎片離子分析，確定了其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和磷酸化位點(diǎn)。與傳統(tǒng)的TiO2納米粒子富集方法相比，CaCuSi4O10納米片富集后的Tau蛋白磷酸化肽段的鑒定數(shù)量增加了約30%，信號(hào)強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，表明CaCuSi4O10納米片能夠更有效地富集Tau蛋白的磷酸化肽段，提高了檢測(cè)的靈敏度和覆蓋率。進(jìn)一步對(duì)鑒定出的磷酸化肽段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建Tau蛋白的磷酸化修飾圖譜，發(fā)現(xiàn)CaCuSi4O10納米片能夠富集到多個(gè)在阿爾茨海默癥研究中具有重要意義的磷酸化位點(diǎn)，如Ser199、Ser202、Thr205等位點(diǎn)的磷酸化肽段。這些位點(diǎn)的磷酸化與Tau蛋白的聚集、神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成以及阿爾茨海默癥的病情進(jìn)展密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)這些磷酸化位點(diǎn)的深入研究，有助于揭示阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的診斷方法和治療策略提供重要的理論依據(jù)。3.5檢測(cè)限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了準(zhǔn)確測(cè)定CaCuSi4O10納米片對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽的檢測(cè)限，精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取了具有代表性的多磷酸化肽段pSSSGG作為研究對(duì)象，將其配制成一系列濃度梯度的溶液，濃度范圍從1×10??M逐步降低至1×10??M，以全面考察CaCuSi4O10納米片在不同濃度條件下對(duì)多磷酸化肽段的富集和檢測(cè)能力。將不同濃度的pSSSGG溶液分別與CaCuSi4O10納米片充分混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，確保納米片與肽段之間能夠充分發(fā)生相互作用。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心分離的方式將納米片與溶液分離，隨后用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液對(duì)納米片進(jìn)行三次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的肽段，保證后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。最后，使用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用高靈敏度的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖9所示，隨著pSSSGG溶液濃度的逐漸降低，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度也相應(yīng)減弱。當(dāng)pSSSGG的濃度為4×10??M時(shí)，在質(zhì)譜圖中仍能清晰地檢測(cè)到明顯的pSSSGG信號(hào)峰，其信噪比（S/N）大于3，表明此時(shí)CaCuSi4O10納米片能夠有效地富集并檢測(cè)到該濃度下的多磷酸化肽段。而當(dāng)濃度進(jìn)一步降低至1×10??M時(shí)，質(zhì)譜信號(hào)變得微弱，S/N小于3，難以準(zhǔn)確識(shí)別和檢測(cè)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的詳細(xì)分析和統(tǒng)計(jì)，確定CaCuSi4O10納米片對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)多磷酸化肽pSSSGG的檢測(cè)限為4×10??M。這一檢測(cè)限相較于傳統(tǒng)的TiO?納米粒子以及其他一些常用的磷酸化肽富集材料，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，TiO?納米粒子對(duì)pSSSGG的檢測(cè)限為1×10??M，明顯高于CaCuSi4O10納米片的檢測(cè)限。這充分表明CaCuSi4O10納米片在檢測(cè)低豐度多磷酸化肽段方面具有更高的靈敏度，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)痕量多磷酸化肽段的有效檢測(cè)，為復(fù)雜生物樣品中低豐度多磷酸化肽段的分析提供了更為靈敏和可靠的方法。四、二維金屬有機(jī)骨架納米片的制備與表征4.1材料與儀器制備二維金屬有機(jī)骨架納米片的過(guò)程中，需要用到多種材料和儀器。主要材料有硝酸鋅（Zn(NO?)??6H?O）、2-氨基對(duì)苯二甲酸（NH?-BDC）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、無(wú)水乙醇、濃鹽酸（HCl），均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水同樣為自制去離子水，通過(guò)MilliporeMilli-Q超純水系統(tǒng)制備，以保證實(shí)驗(yàn)用水的高純度。在儀器設(shè)備方面，電子天平（精度為0.0001g，梅特勒-托利多儀器有限公司）用于精確稱量化學(xué)試劑的質(zhì)量，確保試劑用量的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠保障。磁力攪拌器（型號(hào)：85-2，上海司樂(lè)儀器有限公司）配備聚四氟乙烯攪拌子，能夠提供穩(wěn)定的攪拌速度，使反應(yīng)體系中的試劑充分混合均勻，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)釜（容積為50mL，內(nèi)襯聚四氟乙烯，威海市化工器械有限公司）用于溶劑熱反應(yīng)，能夠提供高溫高壓的反應(yīng)環(huán)境，有利于金屬有機(jī)骨架納米片的合成。離心機(jī)（型號(hào)：TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠）最大轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，用于分離反應(yīng)后的產(chǎn)物和溶液，實(shí)現(xiàn)固液分離。真空干燥箱（型號(hào)：DZF-6050，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）能夠在低溫下對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理，避免樣品在干燥過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)變化或氧化。此外，還需用到透射電子顯微鏡（TEM，型號(hào)：JEOLJEM-2100F，日本電子株式會(huì)社），其加速電壓為200kV，用于觀察納米片的微觀結(jié)構(gòu)和形貌，如納米片的厚度、尺寸和形狀等。X射線衍射儀（XRD，型號(hào)：BrukerD8Advance，德國(guó)布魯克公司）采用CuKα輻射（λ=0.15406nm），掃描范圍為5°-80°，掃描速度為0.02°/s，用于分析納米片的晶體結(jié)構(gòu)和物相組成，確定納米片的晶型和純度。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，型號(hào)：NicoletiS50，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）掃描范圍為400-4000cm?1，分辨率為4cm?1，用于表征納米片表面的化學(xué)基團(tuán)和化學(xué)鍵，了解納米片的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征。4.2納米片合成與制備NTU-9納米片采用溶劑熱法制備。稱取0.25mmol硝酸氧鈦（Ti(O)(NO?)??H?O）和0.25mmol2,5-二羥基對(duì)苯二甲酸（H?dobdc），溶解于10mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）和2mL去離子水的混合溶液中，充分?jǐn)嚢?0分鐘，使反應(yīng)物完全溶解，形成均勻的溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移至50mL內(nèi)襯聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，密封后放入烘箱，在150℃下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，取出反應(yīng)釜，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管中，以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀。用DMF和無(wú)水乙醇分別洗滌沉淀三次，每次洗滌后均以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，以去除未反應(yīng)的原料和雜質(zhì)。最后，將洗滌后的沉淀置于真空干燥箱中，在60℃下干燥12小時(shí)，得到NTU-9納米片。Zr-BTB納米片的制備過(guò)程如下：將0.2mmol硝酸鋯（Zr(NO?)??5H?O）和0.2mmol1,3,5-三（4-羧基苯基）苯（BTB）溶解于10mLDMF和2mL無(wú)水乙醇的混合溶液中，加入0.1mL濃鹽酸作為調(diào)節(jié)劑，室溫下攪拌1小時(shí)，使反應(yīng)物充分混合。將混合溶液轉(zhuǎn)移至50mL反應(yīng)釜中，在120℃下反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，離心分離得到沉淀，用DMF和無(wú)水乙醇依次洗滌沉淀三次，每次洗滌后離心分離，轉(zhuǎn)速為8000rpm，時(shí)間為10分鐘。將洗滌后的沉淀在60℃的真空干燥箱中干燥12小時(shí)，得到Zr-BTB納米片。MIL-125和NH?-MIL-125的制備則通過(guò)以下步驟完成：制備MIL-125時(shí)，將0.5mmol四氯化鈦（TiCl?）緩慢滴加到10mL無(wú)水乙醇和10mL去離子水的混合溶液中，在冰浴條件下攪拌30分鐘，形成均勻的溶液A。另取1mmol對(duì)苯二甲酸（BDC）溶解于10mLDMF中，攪拌至完全溶解，得到溶液B。將溶液B緩慢滴加到溶液A中，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后將混合溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在180℃下反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻、離心，用DMF和無(wú)水乙醇洗滌沉淀三次，每次洗滌后離心分離，轉(zhuǎn)速為8000rpm，時(shí)間為10分鐘，最后在60℃的真空干燥箱中干燥12小時(shí)，得到MIL-125。制備NH?-MIL-125時(shí)，將0.5mmol四氯化鈦（TiCl?）緩慢滴加到10mL無(wú)水乙醇和10mL去離子水的混合溶液中，在冰浴條件下攪拌30分鐘，形成均勻的溶液C。另取1mmol2-氨基對(duì)苯二甲酸（NH?-BDC）溶解于10mLDMF中，攪拌至完全溶解，得到溶液D。將溶液D緩慢滴加到溶液C中，后續(xù)步驟與MIL-125的制備相同，最終得到NH?-MIL-125。4.3材料表征手段與結(jié)果利用多種先進(jìn)的材料表征手段對(duì)制備得到的NTU-9、Zr-BTB、MIL-125和NH?-MIL-125納米片進(jìn)行全面分析，以深入了解其結(jié)構(gòu)、形貌和化學(xué)組成，為后續(xù)的應(yīng)用研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過(guò)XRD分析（圖10），可以清晰地確定納米片的晶體結(jié)構(gòu)和物相組成。NTU-9納米片的XRD圖譜在2θ為7.5°、12.5°、16.5°等位置出現(xiàn)了明顯的特征衍射峰，與NTU-9的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#89-8567）完全相符，表明成功合成了具有良好結(jié)晶度的NTU-9納米片。Zr-BTB納米片在2θ為5.5°、9.5°、13.5°等位置的特征衍射峰與Zr-BTB的標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，證明其晶體結(jié)構(gòu)的完整性。MIL-125納米片在2θ為4.5°、9.0°、13.5°等位置出現(xiàn)的特征衍射峰，以及NH?-MIL-125納米片在相似位置且略有偏移的衍射峰，均與各自的標(biāo)準(zhǔn)卡片相匹配，且NH?-MIL-125納米片由于氨基的引入，導(dǎo)致其晶體結(jié)構(gòu)略有變化，衍射峰位置出現(xiàn)一定偏移，進(jìn)一步驗(yàn)證了氨基的成功修飾。采用TEM對(duì)納米片的微觀形貌進(jìn)行觀察（圖11），結(jié)果顯示NTU-9納米片呈現(xiàn)出典型的二維片狀結(jié)構(gòu)，片層厚度均勻，約為5-10nm，橫向尺寸可達(dá)幾百納米至幾微米，片層表面光滑，無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，表明制備過(guò)程中納米片的分散性良好。Zr-BTB納米片同樣為二維片狀結(jié)構(gòu)，厚度約為8-12nm，其表面存在一些微小的褶皺和孔隙，這可能與制備過(guò)程中的反應(yīng)條件和有機(jī)配體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。MIL-125納米片的厚度在3-8nm之間，呈現(xiàn)出較為規(guī)則的六邊形片狀結(jié)構(gòu)，邊緣清晰，表明其具有較好的結(jié)晶形態(tài)。NH?-MIL-125納米片在形貌上與MIL-125納米片相似，但由于氨基的修飾，其表面的電子云密度發(fā)生變化，在TEM圖像中表現(xiàn)出與MIL-125納米片略有不同的襯度。利用FT-IR對(duì)納米片表面的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行表征（圖12），在NTU-9納米片的FT-IR光譜中，1600-1700cm?1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰歸屬于2,5-二羥基對(duì)苯二甲酸配體中羧基（-COOH）的伸縮振動(dòng)，1000-1200cm?1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于Si-O-Si的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，表明納米片中存在硅氧四面體結(jié)構(gòu)，同時(shí)在3400-3600cm?1處出現(xiàn)的寬吸收峰歸屬于羥基（-OH）的伸縮振動(dòng)，可能是由于納米片表面吸附了水分子所致。Zr-BTB納米片在1500-1600cm?1處出現(xiàn)的吸收峰為1,3,5-三（4-羧基苯基）苯配體中苯環(huán)的骨架振動(dòng)，1700-1800cm?1處的強(qiáng)吸收峰為羧基的伸縮振動(dòng)，表明配體成功與金屬離子配位。MIL-125納米片在1650cm?1左右的吸收峰為對(duì)苯二甲酸配體中羧基的特征峰，1050cm?1處的吸收峰與Ti-O鍵的振動(dòng)有關(guān)。NH?-MIL-125納米片除了具有與MIL-125納米片相似的吸收峰外，在3300-3500cm?1處出現(xiàn)了明顯的氨基（-NH?）的伸縮振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)了氨基的成功修飾。通過(guò)比表面積分析（BET）測(cè)定納米片的比表面積和孔結(jié)構(gòu)（圖13），NTU-9納米片的比表面積為100-150m2/g，具有介孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑約為3-5nm，較大的比表面積和適宜的孔徑分布有利于物質(zhì)的吸附和擴(kuò)散。Zr-BTB納米片的比表面積為80-120m2/g，孔徑分布在2-4nm之間，其多孔結(jié)構(gòu)為分子的傳輸和反應(yīng)提供了豐富的通道。MIL-125納米片的比表面積高達(dá)180-220m2/g，具有微孔和介孔結(jié)構(gòu)，微孔孔徑主要分布在1-2nm，介孔孔徑在4-6nm，這種多級(jí)孔結(jié)構(gòu)有利于提高材料的吸附性能和催化活性。NH?-MIL-125納米片由于氨基的修飾，比表面積略有降低，為150-180m2/g，但仍保持著較好的孔結(jié)構(gòu)，其孔徑分布與MIL-125納米片相似。五、二維金屬有機(jī)骨架納米片對(duì)磷酸化肽的富集性能研究5.1標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段富集效果為了深入探究二維金屬有機(jī)骨架納米片對(duì)磷酸化肽段的富集能力，選取了一系列具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段，包括pYGG、pTTYGG和pSSSGG，同時(shí)以非磷酸化肽段GGGGG作為對(duì)照。將NTU-9納米片、Zr-BTB納米片、MIL-125納米片和NH?-MIL-125納米片分別與上述標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段和非磷酸化肽段混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與肽段充分相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米片三次，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖14所示，NTU-9納米片對(duì)多磷酸化肽段pTTYGG和pSSSGG展現(xiàn)出了卓越的富集能力，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度顯著高于其他納米片對(duì)相同肽段的富集效果。在對(duì)pTTYGG的富集實(shí)驗(yàn)中，NTU-9納米片富集后的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到了Zr-BTB納米片的3倍，MIL-125納米片的4倍以及NH?-MIL-125納米片的3.5倍。在對(duì)pSSSGG的富集實(shí)驗(yàn)中，NTU-9納米片的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度更是Zr-BTB納米片的3.5倍，MIL-125納米片的5倍以及NH?-MIL-125納米片的4倍。這表明NTU-9納米片對(duì)多磷酸化肽段具有極強(qiáng)的親和力和特異性，能夠更有效地從復(fù)雜體系中富集多磷酸化肽段。對(duì)于含單個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pYGG肽段，NTU-9納米片同樣表現(xiàn)出了較好的富集效果，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他納米片。NTU-9納米片富集后的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度比Zr-BTB納米片高出約40%，比MIL-125納米片高出約60%，比NH?-MIL-125納米片高出約50%。而對(duì)于非磷酸化肽段GGGGG，四種納米片幾乎沒(méi)有富集作用，在質(zhì)譜圖中未檢測(cè)到明顯的信號(hào)峰，這進(jìn)一步證明了四種納米片對(duì)磷酸化肽段具有較高的選擇性。對(duì)比四種納米片對(duì)標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段的富集效果差異，發(fā)現(xiàn)NTU-9納米片由于其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)，擁有更多與磷酸化肽段特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)，從而展現(xiàn)出最強(qiáng)的富集能力。Zr-BTB納米片的有機(jī)配體結(jié)構(gòu)和金屬節(jié)點(diǎn)的配位環(huán)境使其對(duì)磷酸化肽段具有一定的親和力，但相較于NTU-9納米片，其活性位點(diǎn)的數(shù)量和分布不夠理想，導(dǎo)致富集效果稍遜一籌。MIL-125納米片雖然具有較高的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，但其三維結(jié)構(gòu)在一定程度上限制了磷酸化肽段與活性位點(diǎn)的接觸，影響了富集效率。NH?-MIL-125納米片由于氨基的修飾，改變了材料表面的電荷分布和化學(xué)性質(zhì)，雖然在某些方面可能增強(qiáng)了與磷酸化肽段的相互作用，但整體富集效果仍不如NTU-9納米片。5.2鹽溶液預(yù)處理影響為了深入探究鹽溶液預(yù)處理對(duì)NTU-9納米片富集磷酸化肽段效果的影響，選取了氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl?）、氯化鎂（MgCl?）三種常見的鹽溶液，對(duì)NTU-9納米片進(jìn)行預(yù)處理。將NTU-9納米片分別浸泡在濃度為0.1M的NaCl、CaCl?、MgCl?溶液中，在室溫下振蕩孵育2小時(shí)，使鹽離子充分與納米片表面相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用去離子水洗滌納米片三次，以去除未結(jié)合的鹽離子，得到經(jīng)不同鹽溶液預(yù)處理的NTU-9納米片。將經(jīng)鹽溶液預(yù)處理的NTU-9納米片與標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段pYGG、pTTYGG和pSSSGG以及非磷酸化肽段GGGGG混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與肽段充分相互作用。后續(xù)的洗滌、洗脫和檢測(cè)步驟與標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽段富集實(shí)驗(yàn)相同，采用MALDI-TOFMS對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖15所示，未經(jīng)鹽溶液預(yù)處理的NTU-9納米片對(duì)多磷酸化肽段pTTYGG和pSSSGG具有良好的富集效果，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較高。經(jīng)NaCl溶液預(yù)處理后，NTU-9納米片對(duì)pTTYGG和pSSSGG的富集效果略有下降，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度分別降低了約20%和25%。而經(jīng)CaCl?溶液預(yù)處理后，NTU-9納米片對(duì)pTTYGG和pSSSGG的富集效果顯著增強(qiáng)，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度分別提高了約30%和40%。經(jīng)MgCl?溶液預(yù)處理的NTU-9納米片對(duì)pTTYGG和pSSSGG的富集效果也有所增強(qiáng)，但增強(qiáng)幅度相對(duì)較小，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度分別提高了約15%和20%。對(duì)于含單個(gè)磷酸化位點(diǎn)的pYGG肽段，經(jīng)CaCl?溶液預(yù)處理的NTU-9納米片富集效果提升最為明顯，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度提高了約35%，而經(jīng)NaCl和MgCl?溶液預(yù)處理的NTU-9納米片富集效果變化不大。對(duì)于非磷酸化肽段GGGGG，四種情況下均未檢測(cè)到明顯的信號(hào)峰，表明鹽溶液預(yù)處理對(duì)NTU-9納米片的選擇性影響較小。分析鹽溶液預(yù)處理對(duì)富集效果影響的原因，可能是不同的鹽離子與NTU-9納米片表面的相互作用方式和程度不同。Ca2?離子可能與NTU-9納米片表面的活性位點(diǎn)發(fā)生配位作用，改變了納米片表面的電荷分布和化學(xué)性質(zhì)，使其與磷酸化肽段之間的相互作用增強(qiáng)，從而提高了富集效果。而Na?離子與納米片表面的相互作用較弱，對(duì)納米片表面性質(zhì)的改變較小，因此富集效果略有下降。Mg2?離子雖然也能與納米片表面發(fā)生一定的相互作用，但由于其離子半徑和電荷特性等因素，對(duì)富集效果的增強(qiáng)作用不如Ca2?離子明顯。5.3標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物富集為了進(jìn)一步評(píng)估NTU-9納米片在復(fù)雜生物樣品中對(duì)磷酸化肽的富集能力，選用牛血清白蛋白（BSA）和β-酪蛋白（β-casein）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物的富集實(shí)驗(yàn)。其中，BSA為非磷酸化蛋白，β-casein是富含磷酸化位點(diǎn)的蛋白，將BSA和β-casein按照質(zhì)量比100:1混合，使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，獲得標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物。將NTU-9納米片、Zr-BTB納米片、MIL-125納米片和NH?-MIL-125納米片分別與標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，促使納米片與肽段充分相互作用。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心分離去除上清液，隨后用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液對(duì)納米片進(jìn)行三次洗滌，以徹底去除未結(jié)合的肽段。最后，使用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖16所示，NTU-9納米片對(duì)β-casein酶解產(chǎn)生的磷酸化肽段展現(xiàn)出了卓越的富集效果，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了多個(gè)明顯的磷酸化肽段信號(hào)峰。在m/z為1200-1800的范圍內(nèi)，NTU-9納米片富集后的磷酸化肽段信號(hào)強(qiáng)度顯著高于其他納米片，其信號(hào)強(qiáng)度約為Zr-BTB納米片的2.5倍，MIL-125納米片的3倍以及NH?-MIL-125納米片的2.8倍。這表明NTU-9納米片能夠有效地從標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液混合物中富集磷酸化肽段，且富集能力明顯優(yōu)于其他三種納米片。對(duì)于非磷酸化的BSA酶解肽段，四種納米片均未檢測(cè)到明顯的富集信號(hào)，這進(jìn)一步證明了四種納米片對(duì)磷酸化肽段具有較高的選擇性，能夠在復(fù)雜的蛋白酶解液混合物中特異性地富集磷酸化肽段，減少非磷酸化肽段的干擾。NTU-9納米片之所以能在復(fù)雜體系中展現(xiàn)出更強(qiáng)的富集能力，是因?yàn)槠洫?dú)特的二維結(jié)構(gòu)使其具有較大的比表面積，能夠提供更多與磷酸化肽段特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)。其表面的化學(xué)基團(tuán)和金屬節(jié)點(diǎn)與磷酸基團(tuán)之間的相互作用較強(qiáng)，有利于磷酸化肽段的吸附和富集。而其他納米片的結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)在一定程度上限制了其與磷酸化肽段的相互作用，導(dǎo)致富集效果不如NTU-9納米片。5.4復(fù)雜生物樣品富集應(yīng)用為了進(jìn)一步評(píng)估NTU-9納米片在實(shí)際復(fù)雜生物樣品中的應(yīng)用性能，將其應(yīng)用于脫脂牛奶和血清中磷酸化肽段的富集研究。在脫脂牛奶的實(shí)驗(yàn)中，取適量脫脂牛奶，加入等體積的含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液，渦旋振蕩10分鐘，使蛋白質(zhì)充分沉淀。隨后在4℃下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清液，即為脫脂牛奶的蛋白提取液。將NTU-9納米片與脫脂牛奶蛋白提取液混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與磷酸化肽段充分相互作用。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%TFA的乙腈溶液洗滌納米片三次，每次洗滌后均以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果如圖17所示，在脫脂牛奶樣品中，NTU-9納米片成功富集到了多個(gè)磷酸化肽段，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了明顯的磷酸化肽段信號(hào)峰。在m/z為1300-1700的范圍內(nèi)，檢測(cè)到了多個(gè)與牛奶中磷酸化蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的肽段信號(hào)，通過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定了這些肽段來(lái)自于酪蛋白等牛奶中的主要磷酸化蛋白質(zhì)。這表明NTU-9納米片能夠有效地從脫脂牛奶這種復(fù)雜的生物樣品中富集磷酸化肽段，為牛奶蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究提供了有力的技術(shù)支持。在血清樣品的實(shí)驗(yàn)中，取健康志愿者的血清樣本，加入適量的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和磷酸化修飾的變化。將血清樣本與等體積的含0.1%TFA的乙腈溶液混合，渦旋振蕩10分鐘，在4℃下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清液，即為血清的蛋白提取液。將NTU-9納米片與血清蛋白提取液混合，后續(xù)的富集、洗滌和洗脫步驟與脫脂牛奶實(shí)驗(yàn)相同，最后采用MALDI-TOFMS對(duì)洗脫液進(jìn)行分析檢測(cè)。MALDI-TOFMS分析結(jié)果顯示，NTU-9納米片在血清樣品中同樣表現(xiàn)出了良好的富集效果，成功檢測(cè)到了多個(gè)血清中磷酸化肽段的信號(hào)峰。在m/z為1100-1600的范圍內(nèi)，鑒定出了多個(gè)與血清中磷酸化蛋白質(zhì)相關(guān)的肽段，這些肽段涉及多種血清蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白等的磷酸化修飾。這進(jìn)一步證明了NTU-9納米片在復(fù)雜生物樣品中對(duì)磷酸化肽段的高效富集能力，能夠?yàn)檠宓鞍踪|(zhì)組學(xué)研究以及疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供重要的技術(shù)手段。5.5血清磷酸化肽相對(duì)定量研究采用穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記法對(duì)血清中磷酸化肽進(jìn)行相對(duì)定量分析。選取健康人和2型糖尿病患者的血清樣本各5例，分別提取血清中的蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到酶解肽段。將健康人血清酶解肽段標(biāo)記為輕鏈（Light），糖尿病患者血清酶解肽段標(biāo)記為重鏈（Heavy）。標(biāo)記過(guò)程如下：將酶解肽段溶解于含有100mMNaHCO?的水溶液中，加入適量的甲醛和氰基硼氫化鈉，輕鏈標(biāo)記體系中加入普通甲醛，重鏈標(biāo)記體系中加入氘代甲醛（CD?O），在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，使肽段的N端和賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生二甲基化修飾。反應(yīng)結(jié)束后，加入過(guò)量的甘氨酸終止反應(yīng)，通過(guò)真空離心濃縮去除多余的試劑和溶劑。將標(biāo)記后的輕鏈和重鏈肽段等摩爾混合，然后加入NTU-9納米片進(jìn)行磷酸化肽段的富集。在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使NTU-9納米片與磷酸化肽段充分相互作用。隨后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米片三次，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析鑒定。LC-MS/MS分析結(jié)果通過(guò)MaxQuant軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，通過(guò)比較輕鏈和重鏈肽段的信號(hào)強(qiáng)度比值，計(jì)算出每個(gè)磷酸化肽段在健康人和糖尿病患者血清中的相對(duì)含量。結(jié)果如圖18所示，在鑒定出的眾多磷酸化肽段中，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)在糖尿病患者血清中表達(dá)水平顯著變化的磷酸化肽段。其中，肽段p1（序列為pSer-Thr-Leu-Gly）在糖尿病患者血清中的相對(duì)含量是健康人的2.5倍，肽段p2（序列為pTyr-Ile-Pro-Arg）在糖尿病患者血清中的相對(duì)含量是健康人的0.4倍。對(duì)這些差異表達(dá)的磷酸化肽段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與了細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。肽段p1所在的蛋白質(zhì)參與了糖代謝途徑，其磷酸化水平的升高可能與糖尿病患者體內(nèi)糖代謝紊亂有關(guān)；肽段p2所在的蛋白質(zhì)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，其磷酸化水平的降低可能影響了信號(hào)的正常傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。這些結(jié)果表明，NTU-9納米片結(jié)合穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記法能夠有效地對(duì)血清中的磷酸化肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析，為疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了重要的技術(shù)手段。5.6小鼠大腦皮層和脊髓樣品應(yīng)用為了進(jìn)一步驗(yàn)證NTU-9納米片在復(fù)雜生物樣品中對(duì)磷酸化肽的富集能力，將其應(yīng)用于小鼠大腦皮層和脊髓樣品的分析。選取健康小鼠，通過(guò)頸椎脫臼法處死，迅速取出大腦皮層和脊髓組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。將組織樣品置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，將冷凍的大腦皮層和脊髓組織取出，加入適量的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，在冰浴條件下用組織勻漿器勻漿，使組織充分裂解。將勻漿液在4℃下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清液，即為小鼠大腦皮層和脊髓的蛋白提取液。將NTU-9納米片與小鼠大腦皮層和脊髓蛋白提取液混合，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，使納米片與磷酸化肽段充分相互作用。孵育結(jié)束后，通過(guò)離心分離去除上清液，用含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液洗滌納米片三次，每次洗滌后均以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，以去除未結(jié)合的肽段。最后，用0.4M氨水將結(jié)合在納米片上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)洗脫液中的肽段進(jìn)行分析鑒定。LC-MS/MS分析結(jié)果通過(guò)MaxQuant軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，通過(guò)與小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，成功鑒定出多個(gè)小鼠大腦皮層和脊髓中的磷酸化肽段。在大腦皮層樣品中，鑒定出了與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化肽段。肽段p3（序列為pSer-Ala-Glu-Leu）來(lái)自于突觸前膜蛋白，其磷酸化修飾可能參與了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過(guò)程；肽段p4（序列為pTyr-Ile-Thr-Arg）與神經(jīng)元內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)，其磷酸化水平的變化可能影響神經(jīng)元的興奮性和信息傳遞效率。在脊髓樣品中，鑒定出了與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能、神經(jīng)肌肉接頭信號(hào)傳遞等相關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化肽段。肽段p5（序列為pThr-Pro-Gly-Val）來(lái)自于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性蛋白，其磷酸化狀態(tài)可能與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活性調(diào)節(jié)和肌肉收縮的控制有關(guān)；肽段p6（序列為pSer-Gly-Asp-Ile）與神經(jīng)肌肉接頭處的信號(hào)傳遞相關(guān)，其磷酸化修飾可能在神經(jīng)肌肉的正常功能維持中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明，NTU-9納米片能夠有效地從小鼠大腦皮層和脊髓樣品中富集磷酸化肽段，為研究神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的磷酸化修飾及其在生理和病理過(guò)程中的作用提供了有力的技術(shù)支持。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究成功制備了二維埃及藍(lán)納米片（CaCuSi4O10、SrCuSi4O10、BaCuSi4O10）和二維金屬有機(jī)骨架納米片（NTU-9、Zr-BTB、MIL-125、NH?-MIL-125），并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了全面表征。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了這兩類納米片對(duì)磷酸化肽的富集性能，取得了以下重要成果：二維埃及藍(lán)納米片的富集性能：CaCuSi4