152022-07-29發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC1I牛輪狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了牛輪狀病毒腹瀉的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物BRV：牛輪狀病毒（Bovineratovirus）CPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEDMEM：達(dá)爾伯克改良依格爾培養(yǎng)基（DuLbeFBS：胎牛血清（FetalBovineSMA104細(xì)胞：恒河猴腎細(xì)胞（Rhesuskidneycell）PBS：磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferSaliPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactTCID50：半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量（MedianTissueCultureInfective樣品處理的生物安全措施符合GB19489的樣品采集的生物安全措施符合GB/T27401具有外、中、內(nèi)三層衣殼，每層均為20面體對(duì)稱?；蚪M為1不同年齡和品種牛均可感染BRV，3周齡內(nèi)牛最易感，多發(fā)生于病牛和帶毒牛是本病自然流行的傳染源，隱性感染牛和痊愈牛可持續(xù)7.3病理變化8.2主要試劑2漩渦振蕩器充分振蕩后，12000r/min4℃稱取1g樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS，混勻，8000r/min4℃離心5m室溫靜置30min，3000r/min～4000r/min離心5min～10min。分8.4樣品運(yùn)輸與保存采集的樣品應(yīng)低溫運(yùn)送，盡量12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)采集或處理后的樣品在2℃~8℃保存，一般不超過24h，若長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件保r/min離心30min，取上清，15000r/min離心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min離心3h～4h，棄上清，加1～2滴蒸餾水懸浮，滴加銅網(wǎng)，2%磷鎢酸染MA104細(xì)胞可用于牛輪狀病毒分離培養(yǎng)。細(xì)胞，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組。接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中液體，按細(xì)胞維持液終體積的10%加入處理好的樣品，37℃吸附1h，期間每隔20min搖晃一次，吸附完成后補(bǔ)加含0.5μg/mL～2μg/mL胰酶的細(xì)胞維持液。對(duì)照組不接種樣品，棄去培養(yǎng)液后加入等量細(xì)胞維持液。均置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培3將第1代無CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后混合，5000r/min4℃離心5min～8m8.5.2.2中和試驗(yàn)（固定血清-將采集的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理，按RN保存，若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件，避免反根據(jù)BRVVP6基因設(shè)計(jì)引物，采用常繼濤文章“牛輪狀病毒病原流行病學(xué)調(diào)查、基因重配毒株的構(gòu)建及二價(jià)減毒株的免疫原性評(píng)價(jià)”中BRV引物序列：BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：一步法：模板2μL，上、下游引物各1μL，One4于1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，凝膠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序分析，于NCBI中Blast分析是否為牛輪狀病毒VP6待檢糞便樣品按牛輪狀病毒抗原診斷ELISA試劑盒方），當(dāng)正常對(duì)照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長(zhǎng)良好，證明試驗(yàn)成立；可根據(jù)Reed-Muench法陽性對(duì)照、PCR產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（207bp同時(shí)陰性對(duì)照無條帶；即判定為陽性。測(cè)序分析Blast比對(duì)為牛輪狀病毒VP6基按ELISA試劑盒要求進(jìn)行判定，樣品結(jié)果符合陽性標(biāo)8.6血清學(xué)檢測(cè)每個(gè)不同稀釋度的血清內(nèi)加入100μLBRV病毒液，充分混勻，37℃水浴感5取200μL感作后的液體分別加至已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照各4孔及BRV病毒液回歸對(duì)照100～10將細(xì)胞板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察5d～7d，觀察并記錄中和效價(jià)，證明試驗(yàn)成立。記錄血清各稀釋度的4個(gè)孔中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench法（見附錄C）分別計(jì)算血清中和BRV的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:5時(shí)，即為中和試驗(yàn)結(jié)果陽性。發(fā)病初期和發(fā)病后2周中和試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，且發(fā)病后2周抗體效價(jià)達(dá)發(fā)病初期的4倍，即判定為6試劑配制蒸餾水定容至800mL，HCl調(diào)其pH至7.4左右，加蒸餾水定容至1000mLA.2細(xì)胞培養(yǎng)液：青鏈霉素(10000U/mL)A.3細(xì)胞維持液Tris和EDTA-