第五章蛋白質(zhì)鑒定

一．概述二.基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜分析三.

電噴霧電離質(zhì)譜分析四．MS/MS分析

五．用質(zhì)譜數(shù)據(jù)對肽段從頭測序(denovosequencing)六．氨基酸組成分析法

七．N端和C端氨基酸序列測定八．蛋白質(zhì)芯片(Proteinchips)技術(shù)一．

概述1、發(fā)展史

組成：4種不同的核苷酸20種氨基酸翻譯前修飾和聯(lián)合修飾，包括磷酸化、乙酸化、硫化、糖基化以及甲基化甚至與脂肪相連接等，同時蛋白質(zhì)也可能發(fā)生水解蛋白質(zhì)分析鑒定的發(fā)展歷史中部分具有里程碑的事件1806年Vauguelin和Robiquet在世界上首次分離出第一個氨基酸-天冬酰胺；1833年P(guān)ayen和Persoz提純淀粉酶-麥芽淀粉糖化酶；1938年MulderJG對蛋白質(zhì)進行了初步的系統(tǒng)研究，首次提出Protein一詞；1864年Hoppe-SeylerEF在世界上第一次結(jié)晶出蛋白質(zhì)-血紅蛋白；1886年MacMunnCA發(fā)現(xiàn)細胞色素；1902年FischerE和Hofmeister證明蛋白質(zhì)是多肽；1902年FischerE和HofmeisterF分別提出蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的肽鍵理論;1925-1930年Svedberg用超速離心機測定蛋白質(zhì)的沉淀系數(shù)；1941-1944年Martin和Synge發(fā)展了分配層析，并應(yīng)用于氨基酸分析；1945年Brand采用化學法和微生物法首次對beta-乳球蛋白的全部氨基酸組成進行了分析；1949年Stein和Moore用淀粉柱區(qū)帶層析法測定beta-乳球蛋白全部氨基酸組成；1949-1950Sanger和Edman分別發(fā)展了2,4-二硝基氟苯法和異硫氰酸苯酯法鑒定肽鍵的N-末端；1953年Sanger和Thompson完成了胰島素A鏈和B鏈氨基酸序列的測定；1955年Sanger完成了胰島素分子中二硫鍵的位置；1956-1958年Anfinsen和White發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的三維空間構(gòu)象由氨基酸所決定；1957年Kendrew采用核磁共振技術(shù)測定立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：肌紅蛋白（獲1962年諾貝爾化學獎）；1958年Stem,Moore和Spackman發(fā)明了氨基酸自動分析儀；1958年Ingram證明正常血紅蛋白一個氨基酸的變化可以導致鐮刀型血紅蛋白；1960年Kendrew采用高分辨X-射線分析了抹香鯨的血紅蛋白結(jié)構(gòu)；1965年MeyerTS等發(fā)明了用于聚丙烯酰胺凝的考馬斯亮藍染色法；1966年經(jīng)過美國多位生物化學家的努力，確定了組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的全部遺傳密碼；1969年HodgkinDMC獲得0.28nm分辨率的胰島素晶體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果；1967年ShapiroAL等發(fā)明了SDS電泳；1967年Edman和Begg研制出多肽氨基酸序列分析儀；1968-1972年Anfinsen建立了親和層析技術(shù)；1969年WeberK和OsbornM改進SDS電泳，并應(yīng)用測定蛋白質(zhì)的分子量；1970年LaemmliUK發(fā)明不連續(xù)SDS電泳；1973年中國學者用0.18nmX-射線分析了豬胰島素的空間結(jié)構(gòu);1973年Moore和Stein設(shè)計出氨基酸序列自動測定儀;1975年O’FarrellP和KloseJ發(fā)明了ISO-DALT雙向電泳；1979年TowbinH等發(fā)明Western印跡法；1979年SwitzerRC和MerrilCR等發(fā)明銀染色；1980年Anderso和Mckay采用X-射線分析了與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì):Cro抑制物和Cap的結(jié)構(gòu);1982年Tabin和Reddy分別發(fā)現(xiàn)人類癌基因的突變:一個氨基酸的突變就能引起癌癥發(fā)生;1982年BjellgvistB等發(fā)明固相pH梯度技術(shù)；1985年GorgA等發(fā)明了IPG-DALT雙向電泳；1985年MocremansM等發(fā)明了金染色法；1987年TanakaK獲得完整的蛋白質(zhì)質(zhì)譜（獲2002年諾貝爾化學獎）；1988年FennJB采用電噴霧離子化技術(shù)辨別了分子量為40kD的多肽（獲2002年諾貝爾化學獎）；1993年多個研究小組分別獨立提出PMF的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)；1997年UnluM等發(fā)明了雙向電泳中的熒光差異技術(shù)；2001年VenterC公布了繪制人類蛋白質(zhì)組圖譜的計劃。2、蛋白質(zhì)鑒定的主要方法氨基酸組成分析法N端和C端氨基酸序列測定法質(zhì)譜(massspectrometry,MS)分析法用質(zhì)譜數(shù)據(jù)對肽段從頭測序肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)串聯(lián)質(zhì)譜（tandamMS）質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的過程過程：包括兩個階段的MS

將肽段注入質(zhì)譜儀中，蛋白質(zhì)沿氨基端被打碎為幾個片段，這幾個片段在第一個質(zhì)譜中得到分離。這些片段的質(zhì)量在第2級質(zhì)譜中得到測定。所有獲得的片段質(zhì)量信息經(jīng)過處理就形成該肽段的MS/MS譜圖，所獲得的肽序列標簽再在表達序列標簽數(shù)據(jù)庫中查找以鑒定該蛋白。近來，有些商品化儀器把反向液相色譜與MS相偶聯(lián)，自動化LC-MS/MS，CE-MS/MS儀器可以產(chǎn)生幾百至幾千個MS/MS譜圖，使分析那些高度復(fù)雜復(fù)合物成為可能。串聯(lián)質(zhì)譜測定肽短序列分析串聯(lián)質(zhì)譜法是指用質(zhì)譜作質(zhì)量分離的質(zhì)譜方法。它還有幾種名稱，如質(zhì)譜-質(zhì)譜法，多級質(zhì)譜法，二維質(zhì)譜法和序貫質(zhì)譜法。

先對經(jīng)酶消化后的分離肽段進行分析得到其質(zhì)量，并與相同酶消化的蛋白質(zhì)標準數(shù)據(jù)庫相比較。理論與實驗測得的質(zhì)量相比較就能夠鑒定出該蛋白。用MALDI-TOF儀器可以獲得質(zhì)量和精確度均佳的結(jié)果。主要缺點：無法處理復(fù)雜復(fù)合物，而且該蛋白序列必須能在數(shù)據(jù)庫中檢索到。肽質(zhì)量指紋圖譜分析過程3、樣品質(zhì)量控制與制備概要樣品制備的前控制染色方法的選擇角蛋白污染的控制鹽分和去污劑等的控制樣品制備要點

膠內(nèi)酶解：切膠和脫色、還原和烷基化樣品純化和濃縮MALDI/MS基質(zhì)的選擇ZipTip純化和濃縮實驗室酶解的標準化目前有關(guān)基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜的解吸機制、解吸過程等問題尚沒有令人完全信服的統(tǒng)一理論。傳統(tǒng)的理論認為分析物被基質(zhì)結(jié)晶包裹在晶格中達到高度分離,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移到分析物上產(chǎn)生相變。但是實際上卻有與此理論不相符合的實驗結(jié)果。雖然不斷有人提出各種模型來解釋觀察到的實驗現(xiàn)象,如快速一級MALDI離子化理論、多步相互作用和雙中心能量聚集理論、假設(shè)快速反應(yīng)和延遲反應(yīng)的雙成分模型等,但是一般認為這些模型有很大的片面性。因此,基質(zhì)的選擇并沒有明確的指導原則,目前的基質(zhì)選用規(guī)則是從大量的實驗中總結(jié)出來的?；|(zhì)選用規(guī)則至少需要具備以下3個特點：（1）酶的水解位點專一；（2）酶切產(chǎn)生的蛋白的肽段大小適合質(zhì)譜分析并利于數(shù)據(jù)庫檢索；（3）酶自身穩(wěn)定，不易降解。用PMF檢索數(shù)據(jù)庫時，要提高檢索準確度，則產(chǎn)生肽譜的酶切點至少要有2個，同時相對分子質(zhì)量大于5000Da的肽片段對檢索沒有很大幫助。用于制備肽質(zhì)量指紋譜的酶二.基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜分析1、原理：

將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體。當用337nm的氮激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子吸收輻照光能量，導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，導致基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相，同時樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。由于樣品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化學鍵的斷裂?；|(zhì)在樣品離子形成過程中充當了質(zhì)子化或去質(zhì)子化試劑，使樣品分子帶上正電荷或負電荷。

MALDI源使用的激光是脈沖式，每一脈沖激光產(chǎn)生的一批離子得到一張質(zhì)譜圖，一般使用的質(zhì)譜圖是多次脈沖激光掃描質(zhì)譜峰結(jié)果的累加。

MALDI源產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分的質(zhì)量數(shù)有一一對應(yīng)關(guān)系，因此MALDI/MS最適合分析多肽及蛋白質(zhì)混合物。

MALDI源的離子化效率非常高，所以這種儀器是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀，能夠?qū)O微量樣品進行分析。2、特點

MALDI的最大優(yōu)點是與ESI等相比，它能耐受較高濃度的鹽，緩沖溶液以及去垢劑的存在。

MALDI產(chǎn)生的譜圖大多為單電荷離子，因此質(zhì)譜圖中的譜峰與多肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量是一一對應(yīng)的關(guān)系。與ESI/MS相比，MALDI具有較高的靈敏度和較大的質(zhì)量范圍。最新型的MALDI-TOF/MS靈敏度可達fmol（10-15），質(zhì)量范圍可達400kDa。

MALDI/MS易于操作和分析，對于初學者是最易上手的。3、肽質(zhì)量指紋譜（peptidemassfingerprinting，PMF）分析

由Henzel,James,Mann,Pappin,Yates等人所在的5個研究小組分別于1993年獨立提出，是質(zhì)譜技術(shù)中進行高通量蛋白分析鑒定的一種最有力的手段，尤其適合于對基因全序列已知物種的分析。是目前蛋白質(zhì)組研究中較為常用的鑒定方法。PMF是指蛋白質(zhì)被酶切位點專一的特定蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)）都不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，這種特征就像指紋一樣，每種蛋白都具有自己獨特的PMF，可用于蛋白質(zhì)的鑒定。理論PMF：指蛋白質(zhì)被特定酶切后可能出現(xiàn)的全部PMF,即蛋白質(zhì)酶切后生成多肽混合物的質(zhì)量在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)的理論預(yù)測；質(zhì)譜PMF：為蛋白質(zhì)在實際研究中被同樣的酶酶切后經(jīng)質(zhì)譜分析獲得的一套PMF的數(shù)據(jù)。質(zhì)譜PMF必定在理論PMF之中，因此可用實驗獲得的質(zhì)譜PMF在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找最相似的理論PMF來源的蛋白質(zhì)。理論PMF和質(zhì)譜PMF

PMF鑒定基本路線

1)肽段是由切點專一的試劑水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的，通常用已知切點專一的蛋白酶。2)這些肽段的質(zhì)量由MALDI/MS或ESI/MS精確測定。3)計算蛋白序列數(shù)據(jù)庫中的每一序列被實驗中所用水解試劑水解后產(chǎn)生的理論肽段的質(zhì)量，即理論PMF。4)用試驗得到的肽質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中的肽質(zhì)量計算值相匹配，計算得分或排序值。PMF鑒定依據(jù)步驟和標準2－DE膠上目的蛋白質(zhì)的選擇膠內(nèi)酶解樣品制備與上樣質(zhì)譜鑒定PMF的選取質(zhì)譜PMF與理論PMF匹配蛋白質(zhì)鑒定酶越純，專一性越高，檢索結(jié)果越可信。最常用的酶是胰蛋白酶。注意：即便是高純度的胰蛋白酶也會在非Lys或Arg的氨基酸殘基C端酶切（其后不是Pro）。Glu-C蛋白酶也較多用于肽譜制備，此外還有胰凝乳蛋白酶、Lys-C蛋白酶以及Asp-N蛋白酶等等。重視酶的選擇所有蛋白酶都存在的問題：如果蛋白序列中有2個或更多個連續(xù)氨基酸殘基是酶的切點，蛋白酶會對底物酶切不完全，留下漏切的位點和不完全的末端，許多檢索程序把漏切的位點數(shù)目作為輸入的一個檢索參數(shù)。內(nèi)肽酶Lys-C是另一個具高度專一性的酶，此酶產(chǎn)生的自切產(chǎn)物比胰蛋白酶少，但同樣也會有漏切位點，也會在非Lys位點酶切（其后不是Pro)。同樣也要注意，并非所有的蛋白質(zhì)不論是否經(jīng)凝膠分離都適用于胰蛋白酶或其他專一性蛋白酶切。但是，凝膠分離的蛋白質(zhì)由于其處于變性狀態(tài)，通常酶切十分有效。①被分析物與基質(zhì)（小分子芳香化合物）混合?；|(zhì)通常溶解在酸性且易揮發(fā)的有機溶劑中（HCCA基質(zhì)一般溶解于40%乙腈、0.5%三氟乙酸的水溶液中），超聲儀混合配成飽和溶液，以超過樣品1000倍的量與樣品用槍頭吹吸混合（體積比1:1），然后快速點加到金屬片／靶上，溶劑在空氣中自由揮發(fā)后，就形成了樣品—基質(zhì)共結(jié)晶薄膜。②將加有樣品—基質(zhì)混合結(jié)晶的靶送入質(zhì)譜儀的真空室（10-5-10-8Torr)。③在金屬片／靶上加＋20-30kV的高電壓（產(chǎn)生正離子），同時有短的激光脈沖照射在干燥的樣品上。蛋白質(zhì)和多肽的MALDI分析步驟④基質(zhì)晶體吸收特定波長的激光能量（紫外激光337nm，紅外激光2.94μm）,又以熱的形式將能量釋放，引發(fā)了解吸附。這一迅速的放熱過程又使基質(zhì)晶體升華，基質(zhì)和樣品分子氣化進入質(zhì)譜儀的氣相。該過程是基質(zhì)先吸收激光能量，然后將能量傳遞給與之共結(jié)晶的樣品，而非樣品直接從激光中吸收能量。樣品結(jié)晶的好壞直接影響得到譜圖的效果，白色且較厚的結(jié)晶一般都含很多基質(zhì)，較難得到樣品峰，故應(yīng)選取較透明的結(jié)晶點進行激發(fā)。MALDI離子化過程送入質(zhì)量分析器的離子實質(zhì)上具有相同的終動能。在動能一定時，離子的速度與離子的質(zhì)荷比m/z成反比。因此，在線性檢測器中，離子到達飛行管道另一端檢測器的時間反映了被檢測離子的m/z。激光強度需根據(jù)結(jié)晶中樣品的含量而定，激光太強則基線及基質(zhì)峰都會很高，激光太弱則很難得到樣品峰，最佳做法是先在較高激光強度下將基質(zhì)激發(fā)，再減弱激光到合適強度，這樣得到的譜圖信噪比相對高。最終的譜圖是通過每一次激發(fā)后得到譜圖的累加形成的，累加越多，譜峰也就越高，但基線也會越高，應(yīng)有目的地選擇，且應(yīng)多累加不同激發(fā)點得到的譜圖，使得到的譜圖更可靠，一般譜圖的峰強度應(yīng)達到1000以上。

由于MALDI-TOF/MS產(chǎn)生的多為單電荷離子峰，因此譜圖上的峰值即為某個肽段的離子質(zhì)量。

M/Z值0—800多為基質(zhì)峰，因而對樣品峰的標定集中在M/Z800—3000，同時對信噪比大于3的譜峰才予以標定，角蛋白峰以及酶自切峰可以在標定過程中或標完后予以去除，以增加查詢時匹配的顯著性。高分辨率的質(zhì)譜儀得到的譜圖有同位素峰存在，標峰的時候只標定一系列同位素峰的第1個峰，不論該峰的強度是否最高；同位素峰的M/Z相差1，且一系列同位素峰的強度是逐漸減弱或先增強再減弱，當遇到逐漸減弱的同位素峰后緊接著又出現(xiàn)強度增強的質(zhì)譜峰時，該質(zhì)譜峰可能為新肽段出的峰，應(yīng)予標定。PMF的選取4、PMF檢索實例：大腸桿菌K12外膜蛋白的MALDI-TOF/MS鑒定過程外膜蛋白雙向電泳圖譜局部圖該蛋白點的PMF共可標定18個峰，其峰值分別為1285.57，1379.50，1395.58，1550.64，1569.64，1587.63，1616.75，1737.77，1829.71，2017.84，2034.88，2124.04，2139.94，2166.97，2185.00，2185.99，2209.97，2226.97。目的蛋白點的PMF圖譜

Mascot軟件的檢索界面圖特點：界面清晰、簡潔檢索的可靠性也很高目前最常用的蛋白質(zhì)檢索工具-MascotMascot中檢索得到的顯著性報告

排在第1位的TOLC-ECOLI:匹配了10個肽段;軟件給出的可靠性分數(shù)也高達128分。第2位（NRDG_ECO57）：匹配了3個肽段；軟件給出的分數(shù)僅為39分，其可靠性無顯著性。結(jié)合大腸桿菌全基因組序列已經(jīng)完成，因此，可以認為該蛋白點就是TOLC_ECOLI。Mascot中查詢得到的結(jié)果質(zhì)譜PMF數(shù)據(jù)與TOLC_ECOLI的理論PMF匹配情況18個譜峰中有10個與TOLC_ECOLI的理論PMF相一致（覆蓋率達到33%），分別是：1285.57，1395.58，1550.64，1616.75，1737.77，1829.71，2034.88，2124.04，2185.00，2226.97；其他8個峰沒有匹配。與PMF圖相比較，可以發(fā)現(xiàn)：1、并不是峰強度越大，被匹配的可能性也越大；2、m/z2185.00與2185.99為同位素峰，從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，2185.00被匹配，而2185.99沒有被匹配，此即前文中提到的一系列同位素峰標定第一個峰的原則在此處得到了驗證，因此峰值的標定對檢索結(jié)果也有決定性的影響。5、檢索可靠性的確認用MS-Fit軟件對TOLC_ECOLI的PMF數(shù)據(jù)再進行檢索MS-Fit軟件界面PMF結(jié)果在MS-Fit中查詢得到的結(jié)果

檢索結(jié)果：18個譜峰中有14個被匹配，覆蓋率達到37.1%，檢索結(jié)果亦為TolC,與Mastco的一致，說明有關(guān)鑒定結(jié)果的可靠性。由于不同軟件的算法不同，因此Mastco和MS-Fit所給出的參考分數(shù)有很大的區(qū)別，但不影響檢測結(jié)果。

即便是使用同一數(shù)據(jù)庫SwissProt，Mastco和MS-Fit所給出的匹配肽段也不盡相同。因此對結(jié)果評估其可靠性時，采用不同軟件進行搜索是有必要的。與匹配正確與否有關(guān)的某些表觀偽質(zhì)量（spuriousmasses）存在的可能原因總結(jié)如下：1)蛋白質(zhì)被正確鑒定，但是由于翻譯后修飾或人為修飾及翻譯后加工（如N或C末端加工）產(chǎn)生了另外的質(zhì)量。盡管某些質(zhì)量的差異可能與這些修飾情況相符，但除非經(jīng)實驗證明，否則僅僅是假設(shè)。2)蛋白質(zhì)被正確鑒定，但存在非特異性的蛋白水解，或有雜蛋白酶存在。通過排除酶切位點專一的假設(shè)，確定候選蛋白質(zhì)是否會產(chǎn)生具有那些質(zhì)量數(shù)的肽段，這樣可以接受這種可能性。3)蛋白質(zhì)被正確鑒定，但有部分雜質(zhì)蛋白質(zhì)混在其中，如2-DE膠上的蛋白點可能由多個蛋白質(zhì)組成。如果有足夠多的未匹配肽質(zhì)量數(shù)，就可以用這些數(shù)據(jù)單獨進行肽質(zhì)量檢索，以證實存在另外的蛋白質(zhì)。當然要做酶自切的對照實驗，以鑒別所有的酶自切產(chǎn)物。4)被鑒定的蛋白質(zhì)或許是數(shù)據(jù)庫中已登錄蛋白的同源序列，或者是其序列的剪切變異體。某些檢索程序允許實現(xiàn)跨種間檢索，如果能得到另外確實的數(shù)據(jù)，這一方法還是很有用的。因為從基因特征不清楚的種屬得到的蛋白質(zhì)也許可以在基因特征清楚的種屬的蛋白序列庫中得到匹配鑒定。5)蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果是假陽性。如果沒有其他數(shù)據(jù)，特別是實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量數(shù)精確度不高時，這一糟糕的結(jié)果很難被證實或證偽。如果所用檢索程序是用鑒定結(jié)果的得分值排序，而所得檢索結(jié)果得分值又比較低時，該結(jié)果的證實就更加困難了。在某些例子中，通過比較檢索結(jié)果中排序第1和第2位（及后面）的得分值之差，得到進一步確認。此蛋白質(zhì)也可能在蛋白數(shù)據(jù)庫中不存在。6、PMF分析的優(yōu)缺點優(yōu)點(1)容忍性好MAIDI可以耐受被分析樣品混合物中存在的微量緩沖液、鹽濃度和少量電荷離子的干擾，這樣的特性使其優(yōu)于電噴霧電離(ESI)等其它離子化方法而成為PMF分析的最佳離子化技術(shù)。(2)靈敏度高即僅需少數(shù)肽片段的質(zhì)量被準確測定就可鑒定被檢蛋白質(zhì)，且被檢測蛋白的量可低達fmol水平。缺點這種檢索途徑有一個明顯的限制，就是被鑒定的蛋白質(zhì)必須已經(jīng)在序列數(shù)據(jù)庫（翻譯的核酸序列或蛋白序列數(shù)據(jù)庫）中存在。如數(shù)據(jù)庫內(nèi)可用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)不足時不能明確鑒定。因此，這一手段非常適用那些基因特性非常清楚的物種，特別是全基因組已知的物種，亦適用那些已經(jīng)建立詳盡的蛋白質(zhì)或cDNA序列數(shù)據(jù)庫的物種。

肽質(zhì)量檢索鑒定蛋白質(zhì)方法的依據(jù)是實驗中獲得的蛋白質(zhì)的多個肽段的質(zhì)量數(shù)據(jù)與同一蛋白質(zhì)肽段質(zhì)量計算值之間的相關(guān)性。因此，這一技術(shù)既不適用于檢索表達序列標鑒數(shù)據(jù)庫（EST)翻譯序列，也不適用于鑒定2個以上的蛋白混合物。但是，對某些蛋白質(zhì)可進行種屬間鑒定，已經(jīng)有了為這一特殊目的而編寫的程序。此外，小的酸性蛋白質(zhì)酶切后不能產(chǎn)生足夠的肽段時也不能明確鑒定,分離后凝膠上的一個斑點由于共分離作用含多個蛋白質(zhì)時也不能鑒定。7、鑒定軟件的算法研究基于用實驗測得的肽質(zhì)量與蛋白序列數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量計算值進行相關(guān)性分析“正交法”對單個肽段的氨基酸序列或組成提供額外的，或限制性的信息。在這種方法中，樣品除用于原始質(zhì)量測量外，還分出一部分用于正交分析。正交分析信息限制了用肽質(zhì)量在數(shù)據(jù)庫中檢索鑒定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多個肽段與同一質(zhì)量匹配的情況。正交方法可分為以下幾類。正交方分類1.特異位點的化學修飾甲酯化，在每個羧基基團上增加14個質(zhì)量單位[如酸性氨基酸殘基（Asp,Glu）側(cè)鏈或肽的C末端；碘化反應(yīng)，在酪氨酸上增加126個質(zhì)量單位；及用1:1混合的乙酰氨／氘代乙酰氨在每個半胱氨殘基上進行同位素標記。2.測定肽段的部分氨基酸組成有兩種方法：如果肽段中的可交換氫在氘溶液中被交換，那么每一個氨基酸有其特定的交換數(shù)目，每個殘基為0至5個質(zhì)量單位。因此，肽質(zhì)量增加的總數(shù)就反映了肽的氨基酸組成。肽段部分氨基酸組成也可通過鑒別MS/MS質(zhì)譜圖中的氨離子（immoniumion)峰來確定。3.鑒定N末端氨基酸殘基混合物中肽段的N末端氨基酸確定可用化學法，一步Edman反應(yīng)；或酶法，用氨肽酶除去末端氨基酸殘基。4.肽內(nèi)不同酶切位點的鑒定為了確定段肽中一個特定殘基的存在及相對位置，有人采用酶切位點不同的酶對一級水解產(chǎn)物進行二次水解（次級水解）。同樣也可把一份樣品分為兩等分用切點不同的酶平行水解。5.鑒定C末端殘基與N末端殘基鑒定相似，用羧肽酶除去C末端氨基酸殘基，某些情況下，會有一個或多個額外的殘基被水解了，但是當使用高度專一性的酶時，除去一個殘基不能提供太多信息。三.電噴霧電離質(zhì)譜分析美國耶魯大學Fenn教授和他的同事在80年代后期提出ESI是當今有機質(zhì)譜中最軟的電離技術(shù)將蛋白質(zhì)的弱酸性水或水溶劑溶液通過毛細管導進入大氣壓電離源內(nèi)(AtmospherePressureIonization,API),在氣化氣的幫助下和源內(nèi)毛細管終端和反電極之間的強電場作用下,樣品溶液形成帶電荷的霧,即電噴霧。這些霧滴在熱氮氣流下蒸發(fā),半徑逐漸縮小,霧滴表面的電場不斷增強到某一臨界點時發(fā)生離子的場發(fā)射,或溶劑完全蒸發(fā)。生成的樣品氣相離子經(jīng)質(zhì)量分析器分析,測出它們的質(zhì)/荷比。蛋白質(zhì)在陽離子或陰離子ESI時,分別生成一系列[M+nH]n+或[M-nH]n-的多電荷離子,用一個簡單的方程式能精確測出蛋白質(zhì)的分子量,質(zhì)量準確度達0.01%或更好。用軟件將蛋白質(zhì)的一組多電荷離子轉(zhuǎn)換成通常的質(zhì)譜圖。納電噴霧源(NanoESI,Nano-electorspraytionizationsource,納升流速)(1)提高了分析的靈敏度;(2)少至0.5μL的樣品溶液,可得到30多分鐘的穩(wěn)定噴霧,以致有充分的機會使MS的參數(shù)最佳化和進行許多串聯(lián)質(zhì)譜分析。ESI源與單級四極分析器組成的ESI/MS主要用于測定多肽和蛋白質(zhì)的分子量。而ESI源與三級四極分析器組成的串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI-MS/MS),在分析混合物時有高度的專一性。在ESI-MS/MS分析中,多肽混合物被ESI源電離后,第1級MS選擇特定m/z的多肽離子通過并進入碰撞活化室,在碰撞活化室內(nèi)肽離子與惰性氣體碰撞發(fā)生碰撞誘導解離(CID)生成碎片離子,第2級MS對裂解生成的碎片離子進行分析。CID也可在離子源內(nèi)發(fā)生,但源內(nèi)CID不能選擇離子故不適合混合物分析。ESI源最常連用的分析器ESI產(chǎn)生的離子特別適合CID,因為多肽的高電荷狀態(tài)增加了碰撞能量。多肽CID時的碎裂作用優(yōu)先發(fā)生在酰胺鍵上,生成專一的序列離子。當酰胺鍵斷裂形成離子時電荷保留在N端的碎片上定名為a,b,c離子,當電荷存在于C端的碎片上時稱之為x,y,z離子。通常在低能裂解條件下,c和ｚ離子一般觀察不到。a離子是從相應(yīng)的b離子失去CO(28Da)形成的。有時也可觀察到亞銨離子和?；栯x子。?；栯x子是由2個主鍵鏈裂解產(chǎn)生的。m/z值高于母離子的離子常常是部分y系列離子。在多肽的CID質(zhì)譜圖上,通常能觀察到多肽的N端和C端互補的序列離子,獲得多肽完全或幾乎完全的序列信息。應(yīng)用ESI-MS/MS測定多肽的氨基酸序列,是對Edman降解反應(yīng)測序的最好補充,因為它能測定修飾的氨基酸和封閉的末端。ESI-MS/MS測得的多肽序列信息結(jié)合多肽的質(zhì)量數(shù)據(jù),在分析蛋白質(zhì)翻譯后的修飾時特別有用。1、原理

電噴霧：常見的電噴霧是內(nèi)徑0.1mm的金屬毛細管。當在它上面施加3－8kV的電壓時，由于毛細管的頂端很窄，形成的電場強度可高達106V/m。當流速為0.5－5μL/min的LC流出物溢出金屬毛細管時，會形成扇狀噴霧。它是細小的液珠和溶劑蒸汽的混合體。由于高壓電場的作用，溶液中帶某種電荷的溶質(zhì)會向液體表面移動，使液珠表面該種電荷過剩。離子的形成：當表面帶有大量電荷的精細液珠向下游移動時，溶劑迅速揮發(fā)，液珠表面積不斷縮小，電荷密度增高。當此情況達到Rayleigh極限時，液珠會分裂成更小的液珠。在質(zhì)量和電荷在分配后，更小的液珠進入穩(wěn)定態(tài)，然后再重復(fù)蒸發(fā)、電荷過剩和液珠分裂。在整個過程的某個階段，分析物能夠以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。離子的輸送：大氣壓條件下形成的離子，在電位差的驅(qū)使下（當然也有壓力差的作用），通過取樣孔進入質(zhì)譜真空區(qū)。離子流通過一個加熱的金屬毛細管，進入第1個降壓區(qū)，在毛細管的出口處形成超聲速噴射流。由于分析物帶電荷并且動量大，可通過下游處于低電位的錐形分離器的小孔，進入第2降壓區(qū)，經(jīng)聚焦后進入質(zhì)譜。而與分析物離子一同穿過毛細管的少量的溶劑，由于呈電中性并且動量小，則在第1和第2降壓區(qū)就被抽走。離子通過入口后，在一個只加有射頻場（radiofrequency,RF)的四極桿控制下進入質(zhì)量分析器，可以是四極桿、四極桿—飛行時間、或離子阱質(zhì)量分析器。

ESI產(chǎn)生的多肽離子的特征是帶多電荷，電荷數(shù)與肽分子中可電離的基團數(shù)目有關(guān)。如果用ESI-MS正離子模式分析胰酶酶切肽段，大多數(shù)肽段都會帶至少兩個電荷，一個在N末端的NH：基團上，另一個在胰酶酶切位點，肽段C末端堿性氨基酸的側(cè)鏈上。

2．ESI方法的特點（1）產(chǎn)生大量的多電荷離子。在ESI以前的電離技術(shù)主要是產(chǎn)生單電荷離子，所測得的值即是離子的質(zhì)量。普遍使用的四極矩質(zhì)譜的質(zhì)荷比測量范圍一般在3000以下。磁質(zhì)譜的測量范圍一般在5000以下。由于產(chǎn)生多電荷離子，離子的質(zhì)量數(shù)落在一般的四極矩的測量范圍之內(nèi)，因此對于分子量在幾萬以上的生物大分子，傳統(tǒng)的質(zhì)譜是不可企及的。ESI技術(shù)的出現(xiàn)使質(zhì)譜在這方面的應(yīng)用有了根本的改觀。（2）幾乎沒有任何外能輸給化合物，因此ESI是迄今為止最為柔和的電離方法。

EIS-MS譜圖主要給出與準分子離子有關(guān)的信息，例如（在單電荷離子的情況下）MH+，MNa+，（M）nH+，[M-H]-，[（M）n-H]-等，很少給出化合物碎片。這不利于化合物的結(jié)構(gòu)推導。為了克服此不足，ESI常與MS/MS聯(lián)用。3、上樣在ESI源中，含有被分析樣品（多肽／蛋白質(zhì)）的溶液流經(jīng)一個細細的進樣針，針頭上加高電壓（+1000－5000V）用來產(chǎn)生正離子。高電壓導致樣品液流分散為呈噴霧狀的帶高電荷的微小液滴，質(zhì)譜儀入口端的有孔平板上加有+100—1000V的低電壓，引導離子通過入口（orifice)，這一入口是離子源和質(zhì)譜儀的連接處，離子源處于大氣壓環(huán)境，質(zhì)譜儀處于真空系統(tǒng)內(nèi)。原理：蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，一段3個氨基酸的肽有203種可能排列方式，4個氨基酸的肽有204種可能排列方式，一個特定序列的4肽出現(xiàn)的概率為1/160000。所以5～6個氨基酸殘基的序列片段在一個蛋白質(zhì)組成中具有很高的特異性,這個片段稱為PST，可用于蛋白質(zhì)鑒定。（1）肽序列標簽(Peptidesequencetag,PST)方法：Mann等提出。用讀出的部分氨基酸序列結(jié)合此段序列前后的離子質(zhì)量和肽段母離子質(zhì)量，在數(shù)據(jù)庫中查尋的方法。4、肽序列標簽分析法此方法非?？焖俸蛯Ｒ?但檢索前需要對多肽的MS/MS圖譜進行解析并從中提取出肽序列標簽。（2）將實驗測得肽的MS/MS圖譜,與數(shù)據(jù)庫中多肽的理論MS/MS裂解圖譜進行比較。應(yīng)用Sequest和Mascot程序,在一次聯(lián)機HPLCESI-MS/MS實驗中,能檢索數(shù)百個MS/MS圖譜,而且不需要事先對圖譜進行解析,可實現(xiàn)自動化。相對于PMF方法，將序列信息用于蛋白質(zhì)的鑒定具有更高的專一性。PST技術(shù)注意事項：（1）Ile和Leu有著相同的分子量，MS不能區(qū)分；（2）在Gly附近的還原性裂解將導致Gly-Gly和Asn、Gly-Ala和Gln之間的含糊不清；（3）半胱氨酸在丙烯酰胺中變成烷基化物。肽段離子斷裂的方式具有序列特異性，主要是沿肽骨架的肽鍵斷裂，如果肽離子的正電荷保留在碎片離子的N末端，此離子被稱為b系列離子，用下標數(shù)字代表這一碎片離子中的氨基酸殘基數(shù)目，從N末端起為1。因此，b離子代表C末端缺失，N末端完整的碎片離子。如果電荷保留在C末端，離子被稱為y系列離子（與b系列離子一樣有下標數(shù)字，但從C末端數(shù)起）。因此y離子代表N末端缺失，C末端完整的碎片離子。CID譜圖是由幾千種獨立的裂解過程產(chǎn)生數(shù)據(jù)的混合圖，即b系列和y系列離子的混合圖。譜圖中也存在一些其他離子：（1）氨基酸側(cè)鏈（Gln,Lys,Arg）中性丟失氨，產(chǎn)生少17個質(zhì)量數(shù)的離子；（2）氨基酸側(cè)鏈（Ser,Thr,Asp,Glu)中性丟失H2O產(chǎn)生少18個質(zhì)量單位的離子；（3）b系列離子中性丟失CO產(chǎn)生少28個質(zhì)量單位的離子，即a系列離子；（4）如果一個肽段離子發(fā)生多次裂解，就會產(chǎn)生中間碎片，包括酞基離子（acyl，由至少2個氨基酸殘基組成)和亞氨離子。亞氨離子代表單個氨基酸的質(zhì)量，因此提供了肽段的部分氨基酸組成。并不是所有的肽鍵在CID條件下都具有相同的斷裂傾向，在同一張MS/MS譜圖中產(chǎn)生的碎片離子的強度也有顯著差異。最常發(fā)生的斷裂是在脯氨酞(prolyl）鍵上，通常產(chǎn)生CID譜圖中的最強離子峰。另外，不穩(wěn)定的脯氨酞(prolyl)鍵斷裂還導致產(chǎn)生了最常見的中間碎片酞基離子（acyl)，并從脯氨酸殘基延伸到C末端。常用的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)檢索程序網(wǎng)站

程序名字網(wǎng)址服務(wù)網(wǎng)站MS-Tag/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=mstagstan

dardUCSFMassSpectrometryFacilityPepFraghttp:///prowl/pepfrag.htmlProteoMetricsandRockefellerUniversityMOWSEhttp://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowseTheUKHumanGenomeMappingProjectResourceCentreMascothttp:///search_form_select.htmlMatrixScienceLtd.,LondonPeptideSearchhttp://www.unb.br/cbsp/paginiciais/peptsrcseqtag.htmEMBLProtein&PeptideGroup1.NanoESIMS/MS:由于分析時是鈉升的流速,1μL樣品溶液可噴霧1個小時或更長時間,能在合適的條件下進行很多MS/MS分析,再結(jié)合應(yīng)用快速的數(shù)據(jù)庫檢索,能對蛋白質(zhì)進行“實時”鑒定,還可以在同一個電噴霧實驗中對一些鑒定結(jié)果作確證實驗。2.聯(lián)機HPLCESIMS/MS分析:用Micromass的HPLCESIＱTOF儀器進行分析時,反相HPLC對多肽進行分離。ＱTOF質(zhì)譜儀對從色譜柱洗脫出的多肽自動選擇前體離子進行MS/MS分析。分析時用內(nèi)徑為75180nm的色譜柱,移動相流速小于1μL/min可以得到較高的靈敏度。具有較高靈敏度、能聯(lián)機脫鹽和自動化分析等優(yōu)點。

NanoESIMS/MS在重新測序方面有特長,聯(lián)機HPLCESI-MS/MS適合自動化分析。實驗時兩者互相補充能獲得最佳的效果。利用上述的PSD-MALDI-TOF-MS也可以獲得多肽的序列信息。2種獲得多肽的序列信息的ESIMS/MS途徑

(1)復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物可以被逐個鑒定，因為每一個做MS/MS分析的肽段產(chǎn)生的碎片離子數(shù)據(jù)都獨立進入數(shù)據(jù)庫檢索。

(2)在這種類型的分析中，來自于每一個肽段的碎片離子譜都代表一個獨立的數(shù)據(jù)庫檢索。如果一個單一的蛋白質(zhì)被酶解，蛋白質(zhì)鑒定結(jié)論基本上能夠自動確定。因為在多肽段檢索結(jié)果中，應(yīng)該是同一個蛋白位于最高排位。(3）自動化程度高。(4)通過指導程序可以預(yù)測某一特定殘基上的特定修飾，此方法適用于尋找有特定翻譯后修飾的肽段，同樣可以鑒定產(chǎn)生這一翻譯后修飾肽段的蛋白質(zhì)。優(yōu)點5、PST檢索鑒定實例

南美白對蝦血清中血藍蛋白鑒定從中選取雙電荷離子峰m/z604.31為母離子南美白對蝦血藍蛋白的ESI-MS分析圖譜南美白對蝦血藍蛋白核質(zhì)比為604.31的ESI-MS酶解片段的ESI-MS/MS分析圖譜

PST(175.12)tnflsfw(1070.56)的檢索參數(shù)及結(jié)果檢索參數(shù)檢索結(jié)果四．MS/MS分析1．分析原理串聯(lián)質(zhì)譜儀主要由離子源、多級質(zhì)量分析器及碰撞室組成。第一級質(zhì)量分析器起質(zhì)量過濾器作用，即從總離子譜中挑選出需進一步進行結(jié)構(gòu)分析的母離子進入碰撞室，母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)高流速惰性氣體碰撞誘導離解（CID）產(chǎn)生碎片離子/子離子，由第二級質(zhì)量分析器分析子離子的質(zhì)荷比。通過母離子和子離子的質(zhì)量，研究二者關(guān)系及母離子的裂解規(guī)律，可以獲得母離子的結(jié)構(gòu)信息。串聯(lián)質(zhì)譜：ESI–三級四極質(zhì)譜、ESI-離子阱質(zhì)譜、ESI-Q-TOF質(zhì)譜以及LC-ESI/MS。MS/MS中的分離過程實際上是瞬間完成的，離子源內(nèi)混合物中所有組分是同時可被利用的。這一主要差別就導致了MS/MS具有一些特殊的操作方式。

目的：碰撞誘導產(chǎn)生碎片離子，進行結(jié)構(gòu)解析

Collision-induceddissociation(CID)Ionsourceiondaughteriongranddaughterion選擇離子MSCIDMS/MSCIDMS/MS/MS質(zhì)量分析器的串聯(lián)

(1)子離子掃描模式：適合于從分子離子獲得分子結(jié)構(gòu)信息。在一個給定的時間點，Q1設(shè)定為僅傳輸某一選定質(zhì)荷比的離子，此離子進入Q2后，經(jīng)碰撞誘導解離，產(chǎn)生的碎片離子通過掃描Q3進行檢測。這樣得到與Q1選擇的初始肽段離子相關(guān)的碎片離子質(zhì)譜圖。Q1選擇母離子，在Q2內(nèi)進行CID，Q3分析碎片離子，這一分析過程不斷循環(huán)，用以選擇分析不同質(zhì)量的肽段離子。2.操作方式

(2)前體離子掃描模式或母離子掃描模式：在母離子掃描實驗中，四極分析器的功能與子離子掃描時正相反，Q1進行質(zhì)量掃描，離子經(jīng)CID后Q3僅允許通過特定m/z的離子。這種方式適用于檢測同一類型的化合物，它能追溯碎片離子的來源，能對產(chǎn)生某種特征碎片離子的一類化合物進行快速篩選。(3)中性丟失掃描：

此模式中Q1和Q3的電壓同步掃描，但保持一個特定m/z值的電壓差，Q2是碰撞室，Q1和Q3的電壓差值與Q2內(nèi)碰撞消除的一個特定中性分子的質(zhì)量一致。因此，在離子混合物中，只有碰撞裂解后能丟失這一特定基團的離子才會被Q3傳輸?shù)綑z測器。這一掃描方式特別適合鑒定含有相同功能團具有相同碎裂方式的同一類型的化合物。(4)選擇反映監(jiān)測（SRM）選擇反映監(jiān)測不產(chǎn)生譜圖，而是用來監(jiān)測從預(yù)選的母離子所形成的預(yù)選子離子。這種方法具有高的信噪比，因而與掃描的MS/MS相比有較高的靈敏度，專一性也好。SRM主要用于復(fù)雜體系中對目標化合物的快速篩選，如環(huán)境監(jiān)測，法庭毒物學等。3．主要基于MS/MS分析的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)同位素標記親和標簽鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)(Isotopecodedaffinitytages,ICAT)

ICAT：一種人工合成的化學試劑由三個功能區(qū)域：半胱氨酸反應(yīng)區(qū)

8個H或2H的連接子有親和標簽作用的生物素形成8個Da質(zhì)量差異的親和標簽實驗時，兩種不同細胞狀態(tài)的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的ICAT標記，等量混合并用蛋白酶消化，經(jīng)過生物素親和層析進行分離，標記的多肽由于生物素的作用被吸附下來，經(jīng)過液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，經(jīng)不同ICAT標記的相同肽段一前一后相鄰分布在MS圖譜上,經(jīng)計算機數(shù)據(jù)庫查詢，得到在不同細胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達差異。該技術(shù)靈敏度及準確度均很高，主要用于研究蛋白質(zhì)組差異，能夠快速定性和定量鑒定多肽和翻譯后修飾蛋白質(zhì)、低豐度蛋白質(zhì),尤其是膜蛋白等疏水性蛋白。但該技術(shù)只能對含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)進行分析；ICAT分子量約為500Da，相對肽段來講是一個很大的修飾物，增加了數(shù)據(jù)庫搜索的難度；而且操作的步驟較多，對精確的定量分析有影響。ICAT鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)五．用質(zhì)譜數(shù)據(jù)對肽段從頭測序（denovosequencing）利用PMF和PST往往適用于鑒定那些數(shù)據(jù)庫中已有其序列的蛋白質(zhì)，對那些數(shù)據(jù)庫尚不存在其序列的蛋白質(zhì)可以利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)對肽段從頭測序，可以采用MS進行單級質(zhì)譜測序或MS/MS獲得的CID譜進行人工完全解析。蛋白質(zhì)經(jīng)化學或酶法降解在C末端或N末端斷裂產(chǎn)生肽段,形成相鄰肽段間相差一個氨基酸殘基的肽段階梯序列,可以進行單級質(zhì)譜測序,通常采用MALDI/MS進行。如果采用MS/MS獲得高質(zhì)量的CID譜，主要指含有完整的y和b系列離子，則可以通過對碎片離子的從頭解析來確定肽段的序列。經(jīng)典蛋白質(zhì)鑒定的方法－使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來鑒定肽：給定肽的串聯(lián)質(zhì)譜，首先從數(shù)據(jù)庫中選出與其母肽質(zhì)量相匹配的那些肽作為候選肽，然后把給定的質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中的候選肽的理論質(zhì)譜相比較，最后將這些候選肽按照它們的質(zhì)譜與給定肽的質(zhì)譜的匹配程度進行打分排序。缺點：它們要依賴一個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以及該數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)條目的正確性；普遍存在的翻譯后修飾會降低肽鑒定的精度；隨著數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列數(shù)的增長，數(shù)據(jù)庫檢索的鑒定方法越來越慢；且這種方法不會發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)。直接解釋串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)鑒定方法。測定未知肽序列稱為“從頭測序”，即“denovosequencing”。通常情況下，蛋白質(zhì)從頭測序分兩步：第1步，生成與給定串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)相匹配的理論肽的集合，由于不可避免的污染和測量誤差的存在，本集合可能非常大；第2步，使用啟發(fā)式方法對這些理論肽進行評分排序，然后輸出評分最高的那些肽。1．蛋白質(zhì)（或肽）從頭測序原理1）化學衍生標記法2）單級質(zhì)譜測序法3）高質(zhì)量CID譜的人工分析2.種類1．化學衍生標記法（1）質(zhì)量偏移法將多肽的N端或C端標記，通過質(zhì)量偏移區(qū)分b離子和y離子。Goodlett等采用酯標記肽C端，Cagney等人則采用O-甲基異脲將胰蛋白酶解肽段中的Lys衍生成高精氨酸，與未衍生的肽段1:1混合后，通過C端Lys的質(zhì)量偏移，確定C端離子。Horiuchi等人還發(fā)展了穩(wěn)定同位素摻入法，在進行蛋白質(zhì)胰蛋白酶解時，用1:1的H218O/H216O作為溶劑，在酶解肽段的C端同時有18O和16O，在形成碎片時，同時有這兩種氧原子的離子為C端離子。（2）單向離子增抑法主要的方法是將肽的N端或C端衍生使其電荷達到增強或削弱，引入正電荷和負電荷均可。在正離子檢測模式下，引入帶正電荷的基團可使某一端的離子得到增強，如引入四價季銨；若引入帶負電荷的基團，則是某一端的離子減弱甚至完全被抑制，如引入磺酸基團。反之，在負離子檢測模式下，引入負電荷則增強，引入正電荷就抑制某一端離子。（3）穩(wěn)定同位素標記的氨基酸摻入法由于體外的化學修飾有一定的缺陷（如反應(yīng)效率問題），普遍有副反應(yīng)而增加了圖譜解析的難度等。另外，一些研究組嘗試在細胞培養(yǎng)時，就將已用同位素標記的氨基酸摻入，因此，在合成出的蛋白質(zhì)中就帶有同位素標記的氨基酸。Gu等有選擇50%4個D標記的Lys（Lys-d4）摻入，使所有蛋白質(zhì)中的Lys都以等量的Lys-d0和Lys-d4形式存在，由于胰蛋白酶酶切位點在Lys的C端，因此在蛋白質(zhì)酶切圖譜中形成了C端被差異標記的肽段，從而達到了分辨b離子和y離子的目的。缺陷：僅能用于培養(yǎng)細胞，而不能用于組織。2．單級質(zhì)譜測序法單級質(zhì)譜測序是分析肽段的階梯序列，即相鄰肽段間相差一個氨基酸殘基，用質(zhì)譜分析肽階梯，通常用MALDI-TOF/MS分析。

用于MS序列分析的肽階梯是由化學或酶法降解肽段產(chǎn)生，由C末端或N末端斷裂。測定N末端序列的化學方法應(yīng)用Edman化學反應(yīng)，用MALDI/MS讀出產(chǎn)生的變短的肽。這一方法通常被稱為“階梯測序”。在這種方法上發(fā)展了兩種變化方式。第1種：在每一測序循環(huán)開始時，在多肽／蛋白質(zhì)底物內(nèi)加Edman試劑。每一個循環(huán)中有一小部分的底物被N末端封閉，末端封閉后的肽在下一個循環(huán)中不會參加反應(yīng)，這樣就產(chǎn)生了序列階梯。最終反應(yīng)產(chǎn)物混合物經(jīng)MALDI/MS分析，其質(zhì)量數(shù)之差反映了氨基酸殘基的質(zhì)量數(shù)。第2種：在每一個Edman降解循環(huán)中多次加入多肽/蛋白質(zhì)底物。在此法中加入過量易揮發(fā)的Edman試劑以使反應(yīng)完全，每一循環(huán)中的過量試劑可通過蒸發(fā)被除去。經(jīng)MALDI/MS分析得到肽序列階梯，實現(xiàn)階梯測序。這2種方法都需要底物蛋白質(zhì)為自由N末端，并且不能分辨同質(zhì)異核氨基酸殘基亮氨酸和異亮氨酸。好處：可以將很少量的起始反應(yīng)物直接放在MALDI樣品靶的表面反應(yīng)，只要加入基質(zhì)就可以終止反應(yīng)。通過控制反應(yīng)時間可以讀出較長的序列。但此方法不能分辨Gln和Lys及Ile和Leu。3．高質(zhì)量CID譜的人工分析如果CID能產(chǎn)生高質(zhì)量的譜，例如譜圖含有完整的y和b系列離子，那么，通過對碎片離子的從頭解析可以確定肽段的序列。但是，通常對y和b離子的判斷具有很低的置信度，使得讀出最終序列很困難。使CID譜圖解析變得復(fù)雜的主要因素包括：①碎片離子丟失，如產(chǎn)生不完整的離子系列；②將觀察到的信號歸屬為某一特定離子系列較困難；③若樣品的純度不是很好，樣品溶液中有鹽干擾，譜圖噪聲較大，要從中找出完整的y或b型離子系列，讀出完整的肽序列較困難。一種便于人工解析CID譜及從頭測序的化學方法是對肽段的羧基實行甲酯化。這個反應(yīng)使肽段每一個羧基質(zhì)量增加14u，包括未修飾的C末端、Asp和Glu上的羧基。如果肽段中沒有酸性殘基，同時C末端沒有被修飾，那么只有y系列離子及其中性丟失離子會表現(xiàn)出質(zhì)量數(shù)的變化，比較衍生化與未衍生化兩份樣品的碎片離子譜就會鑒定出y系列離子。如果肽段中存在酸性殘基，這個方法的價值就極其有限了，因為只能鑒定中間碎片。對N末端殘基特異性標記從而鑒定b系列離子的方法也有嘗試。在這些實驗中肽段的氨基被衍生化，衍生化試劑在氣相中含有永久正電荷。雖然這些方法在概念上引人注目，但在實踐上遇到困難，主要由于在質(zhì)譜分析衍生化物之前必須先除去過量的試劑，同時這個反應(yīng)不能區(qū)別N末端氨基和賴氨酸側(cè)鏈上的氨基。4．denovo肽測序軟件

（1）自動化denovo肽測序軟件工具AuDeNS

Baginsky等人提出了對輸入的質(zhì)譜峰賦予相關(guān)性值的啟發(fā)式的數(shù)據(jù)清洗算法（割草機算法grassmowers），而且實現(xiàn)了一個原型系統(tǒng)－AuDeNS。該系統(tǒng)首先使用割草機算法預(yù)處理原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后利用經(jīng)修正的Chen等的噪聲測序算法，該算法能夠處理質(zhì)譜測量誤差。而且，他們通過對解賦予相關(guān)性值，以及僅列舉用戶指定的、與最大相關(guān)性值有關(guān)的域值內(nèi)的那些解，解決了可能的有關(guān)解的數(shù)量問題。

AuDeNS系統(tǒng)的輸出是一列帶有評分排序的多個序列。雖然AuDeNS在性能上還未超過denovo肽鑒定工具Lutefish，但其運行速度遠快于Lutefish，且啟發(fā)式清洗算法還可進一步微調(diào)，前景較為樂觀。（2）使用MS/MS數(shù)據(jù)的肽denovo測序軟件工具PEAKS該軟件由加拿大西安大略大學的MaB、ZhangKZ等人于2002在美國Orlando召開的第50屆ASMS會議上提出的。該軟件能夠自動地從肽的MS/MS實驗數(shù)據(jù)導出該肽對應(yīng)的氨基酸序列。PEAKS接受MS/MS數(shù)據(jù)的質(zhì)譜峰列表之后，試圖用每一個可能的肽可產(chǎn)生的各種離子解釋質(zhì)譜中的質(zhì)峰，最后把其中解釋質(zhì)峰最好的那些肽作為預(yù)測的肽序列輸出。PEAKS的新穎之處在于這種方法依賴于更多的信息，而且能容忍質(zhì)譜儀的測量誤差。PEAKS的方法不同于像MSCOT、Sequest等軟件系統(tǒng)所使用的數(shù)據(jù)庫搜索方法，PEAKS是搜索所有可能的氨基酸串而不是搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。而且為了加快搜索速度，PEAKS使用了一個復(fù)雜的動態(tài)規(guī)劃算法，該算法能保證最好的那些肽不被忽略。PEAKS處理質(zhì)譜的步驟主要包括質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理、候選肽的計算以及候選肽的排序三步。PEAKS的運算速度較快，且就精度而言，其預(yù)測能力超過了所有的現(xiàn)階段能見到的其他肽denovo測序軟件工具。六．氨基酸組成分析法氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。生物樣品中的氨基酸可以游離分子狀態(tài)存在，故可對氨基酸進行分析來研究蛋白質(zhì)。氨基酸的分析包括定量和定性2個方面。以定性為基礎(chǔ)的氨基酸組成分析法是蛋白質(zhì)組研究中的鑒定方法之一。1977年首次作為鑒定蛋白質(zhì)的一種工具,是一種獨特的“腳印”技術(shù)。該方法經(jīng)濟、快速，但靈敏度低，約十幾皮摩爾。Latter首次表明氨基酸組分的數(shù)據(jù)能用于從2－DE凝膠上鑒定蛋白質(zhì)。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展和不斷完善,氨基酸組成分析法在蛋白質(zhì)鑒定中的作用越來越成為從屬地位。1．原理氨基酸組成分析法是利用蛋白質(zhì)異質(zhì)性的氨基酸組分特征,成為一種獨立于蛋白質(zhì)序列的屬性,不同于肽質(zhì)量或序列標簽。它是通過測定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分數(shù)（％）或各氨基酸的摩爾比率，然后與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的理論值進行比較，給出匹配分數(shù)值大小，分數(shù)值越小，表示其與真正蛋白質(zhì)越接近。2．方法測定氨基酸組成常用的方法是酸水解,另外還有放射性標記法、蛋白酶水解法。蛋白質(zhì)經(jīng)過Edman降解，切除N端3～4個氨基酸后,仍可測定氨基酸組成,檢索軟件為改良的AACompIdent。當測得氨基酸組成后,最后一步是進行數(shù)據(jù)庫檢索。常用的軟件是AACompIdent(從ExPASy獲得),另外還有軟件ASA、FINDER、AACpI、PROP－SEACH。但仍存在一些缺點,如由于不足的酸性水解或者部分降解會產(chǎn)生氨基酸的變異,故應(yīng)聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性進行鑒定。1．原理Edman降解法的基本原理為，異硫氰酸苯酯能在較溫和的條件下與具有自由氨基的多肽或蛋白質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng),生成苯氨基甲硫酰衍生物,后者經(jīng)過環(huán)化，并從肽鏈上斷裂下來，然后轉(zhuǎn)變?yōu)镻TH氨基酸，如此完成一次Edman降解。去掉一個氨基酸的肽鏈或蛋白質(zhì)又重新與異硫氰酸苯酯發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，再重復(fù)上面的步驟完成二次Edman降解。如此反復(fù)進行。每一次切下來的PTH-氨基酸通過內(nèi)置的高效液相層析分離系統(tǒng)，分析鑒定每一個氨基。將每次切下來的單個氨基酸按先后順序拼接起來就可以獲得整個蛋白質(zhì)或肽的