生物工業(yè)下游加工技術(shù)

第四章微生物細(xì)胞破碎第一節(jié)細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)第二節(jié)常用破碎方法第三節(jié)破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向

第一節(jié)細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁（cellwall）是細(xì)胞的外層，在細(xì)胞膜的外面，細(xì)胞壁之厚薄常因組織、功能不同而異。植物、真菌、藻類和原核生物（除了支原體與L形細(xì)菌（缺壁細(xì)菌））都具有細(xì)胞壁，而動(dòng)物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁。細(xì)胞壁本身結(jié)構(gòu)疏松，外界可通過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞中，細(xì)胞壁具有全透性。細(xì)胞壁分為3層，即胞間層（中層）、初生壁和次生壁。胞間層把相鄰細(xì)胞粘在一起形成組織。細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖

根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)造和化學(xué)組成不同，可將其分為G+細(xì)菌與G-細(xì)菌。G+細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚（20～80nm），但化學(xué)組成比較單一，只含有90％的肽聚糖和10％的磷壁酸；但G-細(xì)菌的細(xì)胞壁較?。?0～15nm），卻有多層構(gòu)造（肽聚糖和脂多糖層等），其化學(xué)成分中除含有肽聚糖以外，還含有一定量的類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分。此外，兩者在表面結(jié)構(gòu)上也有顯著不同。革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌

細(xì)胞壁的比較細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于多糖鏈上所存在的肽健數(shù)量和其交聯(lián)的程度。交聯(lián)程度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就越致密，破碎的難度也就越大。各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成微生物革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陰性菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1%-4%）肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖（11%-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30%-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)(6%-8%)脂類（8.5%-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)酵母菌細(xì)胞酵母菌形態(tài)酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)周質(zhì)空間原生質(zhì)膜多糖甘露糖蛋白周質(zhì)蛋白酵母細(xì)胞壁破碎的阻力主要取決于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。霉菌霉菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)霉菌的細(xì)胞壁主要由多糖組成，其次含有少量的蛋白質(zhì)和脂類。其中絕大多數(shù)的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的，幾丁質(zhì)與纖維素結(jié)構(gòu)很類似。由于霉菌細(xì)胞壁中含有纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎為了破碎細(xì)胞，必須克服的主要阻力是連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵。了解細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，就可以用合適的溶菌酶和化學(xué)試劑，以及在使用多種酶活化學(xué)試劑相結(jié)合時(shí)確定其使用的順序。第二節(jié)常用破碎方法分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。械高壓勻漿法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作法X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感的目的產(chǎn)物不適應(yīng)非酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差機(jī)化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性械滲透壓法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感的目的產(chǎn)物

干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活珠磨法珠磨法是一種有效的細(xì)胞破碎法。其工作原理是：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極小的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。珠磨機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖珠磨機(jī)實(shí)物圖高壓勻漿法高壓勻漿法是大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，所用設(shè)備是高壓勻漿器。原理：利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針型閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破裂。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。高壓勻漿法一般來(lái)說(shuō)，酵母菌較細(xì)菌難破碎，處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。不易采用高壓勻漿法的微生物細(xì)胞：團(tuán)狀或絲狀真菌（易造成堵塞），較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，以及含有包涵體的基因工程菌，因?yàn)榘w質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥。包涵體：在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。其形成原因主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。高壓勻漿法與珠磨法的比較高壓勻漿法：操作參數(shù)少，易確定，適合大規(guī)模操作。高壓勻漿需配備換熱器進(jìn)行級(jí)間冷卻。一次操作即可達(dá)到較高的破碎率。不適合于絲狀真菌及含有包涵體的基因工程菌。珠磨法：操作參數(shù)多，憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)。夾套冷卻控溫難度大。兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性。適合于各種微生物細(xì)胞的破碎。酶溶法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的。該方法可分為外加酶法和自溶法兩種。外加酶法中，常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶，蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。細(xì)胞壁溶解酶是這幾種酶的復(fù)合物。廣東省微生物所生產(chǎn)一種lywallzyme（溶壁酶），是復(fù)合酶，適合真菌和酵母細(xì)胞壁的溶解。外加酶法主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模釋放細(xì)胞內(nèi)的目的產(chǎn)物，還可用于剝離細(xì)胞壁，將原生質(zhì)體進(jìn)行融合。溶酶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。缺點(diǎn)：酶價(jià)格高，不適合大規(guī)模應(yīng)用；通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件；存在產(chǎn)物抑制，如甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低。自溶法是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。微生物細(xì)胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。例如對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌，可加入Na2CO3和NaHCO3，配成pH10的緩沖液，再配3%的細(xì)胞懸浮液，加熱至70C，保溫?cái)嚢?0min，菌體即可自溶。缺點(diǎn)：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性；此外，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速率下降。化學(xué)滲透法某些化學(xué)試劑可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使得胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)，這種處理方式稱為化學(xué)滲透法?；瘜W(xué)滲透試劑：（1）表面活性物質(zhì)：TritonX-100，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層。(2)EDTA螯合劑：EDTA，革蘭氏陰性菌的外層膜通?？慷r(jià)陽(yáng)離子結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持。EDTA螯合離子后，大量的脂多糖將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性增強(qiáng)?；瘜W(xué)滲透劑（3）有機(jī)溶劑：甲苯，能被吸收進(jìn)入細(xì)胞壁中的類脂，使細(xì)胞膜溶脹，進(jìn)而使細(xì)胞破碎。（4）變性劑：鹽酸胍和脲是常用的變性劑。它們與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液。幾種試劑合理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。。不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透

處理方式細(xì)胞類別變性劑清潔劑有機(jī)溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性菌******革蘭氏陽(yáng)性菌***酵母菌******植物細(xì)胞****巨噬細(xì)胞***化學(xué)滲透法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。（2）細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。缺點(diǎn)：（1）通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。（2）時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%。（3）有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過(guò)程中，需設(shè)法分離除去。X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25?C形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低、目標(biāo)產(chǎn)物活性保留率高。但此法不適用于對(duì)冷凍敏感的生活物質(zhì)。滲透壓法是一種較溫和的細(xì)胞破碎法。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)（甘油或蔗糖溶液）中，達(dá)到平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破碎，使得內(nèi)容物釋放出來(lái)。僅適用于細(xì)胞壁較為脆弱的細(xì)胞，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或者在培養(yǎng)過(guò)程中價(jià)位某些抑制劑（如抗生素），使得細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。原理：由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面，胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。此法只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復(fù)多次。此外，凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。干燥法可采用多種方法使細(xì)胞干燥，如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過(guò)干燥使細(xì)胞膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌。氣流干燥時(shí)部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥和噴霧干燥更容易提取。真空干燥多用于細(xì)菌，冷凍干燥多用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他活性物質(zhì)變性。第三節(jié)破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向1、直接測(cè)定法2、目的產(chǎn)物測(cè)定法3、導(dǎo)電率測(cè)定法直接測(cè)定法采用適當(dāng)?shù)姆椒?，?jì)數(shù)破碎前后的細(xì)胞數(shù)即可直接計(jì)算出細(xì)胞破碎率?？捎蔑@微鏡或電子微粒計(jì)算器直接計(jì)數(shù)。破碎后的細(xì)胞可采用染色的方法與未受損的完整細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。如采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，未受損的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。目的產(chǎn)物測(cè)定法（間接法）細(xì)胞破碎后，通過(guò)測(cè)定破碎液中目的產(chǎn)物的釋放量來(lái)估算破碎率。通過(guò)將破碎后的細(xì)胞懸浮液用離心法分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計(jì)算其破碎率。導(dǎo)電率測(cè)定法利用破碎前后導(dǎo)電率的變化來(lái)測(cè)定細(xì)胞破碎程度的快速方法。原理：細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。正式測(cè)定前應(yīng)預(yù)先采用其他方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。破碎技術(shù)的研究方法1.多種破碎方法相結(jié)合；2.與上游過(guò)程相結(jié)合；3.與下游過(guò)程相結(jié)合；多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞壁膜的化學(xué)組成，而機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度。在實(shí)際操作中，可先用化學(xué)法或酶法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，破壞細(xì)胞壁膜的某些物質(zhì)組成，使壁膜的機(jī)械強(qiáng)度下降，隨后再用機(jī)械法處理，即可大大提高細(xì)胞的破碎率。與上游過(guò)程相結(jié)合（1）培養(yǎng)過(guò)程控制：在發(fā)酵培養(yǎng)后期，加入能抑制細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑（如青霉素），導(dǎo)致新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁存在缺陷，有些胞內(nèi)產(chǎn)物不經(jīng)破碎便可直接滲透出來(lái)。（2）寄主細(xì)胞的選擇：選擇較易破壁的菌種作為宿主細(xì)胞，如革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）。與上游過(guò)程相結(jié)合（3）包涵體的形成。寄主細(xì)胞破碎后，包涵體可用密度梯度離心機(jī)收集。收集的包涵體用變性劑溶解，再除去變性劑即可得到恢復(fù)活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。（4）克隆噬菌體溶解基因：在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細(xì)胞自內(nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。與上游過(guò)程相結(jié)合耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)：如果產(chǎn)品能表達(dá)成耐高溫型（如高溫淀粉酶），雜蛋白仍然保持原特性，那么就可在較高溫度下將產(chǎn)品與雜質(zhì)分開(kāi)，既節(jié)省了冷卻費(fèi)用，又簡(jiǎn)化了分離