ICS11.220

CCSB41

53

云南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB53/T1064.1—2021

綠孔雀檢疫技術(shù)

綠孔雀檢疫技術(shù)

第1部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范

QuarantinetechniqueforPavomuticus

—Part1:Technicalspecificationsforlaboratoryexaminationof

avianparamyxoviruses

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實(shí)施

云南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB53/T1064.1—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

引言.......................................................................................................................................................................I

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4縮略語.............................................................................................................................................................2

5總則.................................................................................................................................................................2

6儀器設(shè)備和試劑.............................................................................................................................................2

6.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備.............................................................................................................................................2

6.2試劑.........................................................................................................................................................3

7樣品.................................................................................................................................................................3

7.1采樣要求與原則.....................................................................................................................................3

7.2采集工具.................................................................................................................................................3

7.3樣品類型與采樣方法.............................................................................................................................3

7.4采樣登記表的填寫.................................................................................................................................4

7.5樣品的保存和運(yùn)輸.................................................................................................................................4

8試驗(yàn)步驟.........................................................................................................................................................4

8.1雞胚接種（病毒分離）.........................................................................................................................4

8.2病毒血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)....................................................................................4

8.3禽副黏病毒L和M基因的RT-PCR擴(kuò)增..............................................................................................5

8.4新城疫病毒F基因的RT-PCR擴(kuò)增及測序分析..................................................................................6

9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理.................................................................................................................................................7

9.1HA試驗(yàn)結(jié)果判定....................................................................................................................................7

9.2HI試驗(yàn)結(jié)果判定....................................................................................................................................7

9.3L和M基因擴(kuò)增結(jié)果判定......................................................................................................................7

9.4F基因擴(kuò)增結(jié)果及毒力判定..................................................................................................................7

附錄A（規(guī)范性）試劑配制........................................................................................................................8

附錄B（規(guī)范性）采樣記錄表..................................................................................................................10

附錄C（規(guī)范性）RT-PCR引物.................................................................................................................11

I

DB53/T1064.1—2021

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件DB53/T1064《綠孔雀檢疫技術(shù)》的第1部分。DB53/T1064已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第2部分：禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第4部分：消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。

本文件主要起草人：陳培富、黃艷梅、胡世享、楊敏、卓娜、李寧、錢麗敏、鄒豐才、何依蓉、楊

建發(fā)。

III

DB53/T1064.1—2021

引??言

綠孔雀（Pavomuticus）在我國僅分布于云南，是國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，也是全球?yàn)l危物種，

并已列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》。為

切實(shí)貫徹《中華人民共和國野生動(dòng)物保護(hù)法》和《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》，編制并發(fā)布DB53/T1064

《綠孔雀檢疫技術(shù)》地方標(biāo)準(zhǔn)，可讓從事綠孔雀保護(hù)的相關(guān)人員按標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化程序開展綠孔雀病原

學(xué)診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀的成活率，維護(hù)綠孔雀種群健康和地區(qū)生態(tài)平衡，

提升生物多樣性保護(hù)成效。

本文件已發(fā)布4個(gè)部分：

——第1部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的總則、儀

器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第2部分：禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的總則、禽

流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方

面制定了規(guī)范；

——第3部分：羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從羽虱實(shí)驗(yàn)室檢測的原理、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備

和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第4部分：消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從消化道線蟲實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的試驗(yàn)原理、

常見線蟲形態(tài)特征、試驗(yàn)條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等方面制定

了規(guī)范。

Ⅴ

DB53/T1064.1—2021

綠孔雀檢疫技術(shù)

第1部分：禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范

重要提示：本檢測技術(shù)規(guī)范中，氯仿有中等毒性，操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行并戴手套和口罩，不

小心接觸皮膚應(yīng)立即沖洗；凝膠電泳若使用溴化乙啶（EB）作核酸染色劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩，被

EB污染的物品要進(jìn)行無害化處理；操作焦碳酸二乙酯（DEPC）應(yīng)戴手套和口罩并在通風(fēng)條件下，不小心

接觸皮膚應(yīng)立即沖洗。由于新城疫病毒可引起人一過性結(jié)膜炎，采樣及檢測人員應(yīng)佩戴口罩和防護(hù)眼鏡，

并采取必要的消毒措施。本文件中凡接觸病毒樣品的檢驗(yàn)器材、廢棄物及其包裝物均應(yīng)做消毒或滅菌無

害化處理，以免污染環(huán)境或擴(kuò)散病毒。

1范圍

本文件規(guī)定了綠孔雀（Pavomuticus）檢疫技術(shù)中禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)涉及的總則、儀器設(shè)

備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

本文件適用于綠孔雀檢疫技術(shù)中禽副黏病毒實(shí)驗(yàn)室檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

禽副黏病毒avianparamyxoviruses

一類感染家禽和野禽的單鏈負(fù)股RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科

（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），包括至少禽副黏病毒1~9血清型，其中禽副黏病

毒1型又稱作新城疫病毒（Newcastlediseasevirus），其致病性最受關(guān)注。

3.2

F蛋白酶切位點(diǎn)cleavagesiteofFprotein

新城疫病毒融合蛋白（F）的F2亞基（位于F氨基端）與F1亞基（位于F羧基端）之間被宿主細(xì)胞蛋

白內(nèi)切酶識別的一個(gè)短肽，由113～117位氨基酸殘基組成，其中113～116位可能含多個(gè)堿性氨基酸，如

精氨酸（R）或賴氨酸（K）。

3.3

病毒血凝試驗(yàn)viralhemagglutinationtest

1

DB53/T1064.1—2021

利用有血凝活性的病毒與特定動(dòng)物的紅細(xì)胞結(jié)合而使紅細(xì)胞凝集（即紅細(xì)胞不再自然下沉匯集）的

特性，測定病毒效價(jià)即滴度的方法。

3.4

病毒血凝抑制試驗(yàn)viralhemagglutinationinhibitiontest

使用抗體阻斷或抑制病毒的血凝活性，用于測定血清抗體效價(jià)或病毒種類的一種方法。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

AMV：禽成髓細(xì)胞瘤病毒Avianmyeloblastosisvirus

cDNA：互補(bǔ)DNAcomplementaryDNA

DEPC：焦碳酸二乙酯Diethypyrocarbonate

dNTP：脫氧核苷酸Deoxyribonucleotidetriphosphate

EB：溴化乙啶Ethidiumbromide

F：融合蛋白Fusionprotein

HA：血凝Hemagglutination

HAU：血凝單位Hemagglutinationunit

HI：血凝抑制Hemagglutinationinhibition

L：大聚合酶蛋白Largepolymeraseprotein

M：基質(zhì)蛋白Matrixprotein

NDV：新城疫病毒Newcastlediseasevirus

PBS：磷酸緩沖鹽溶液Phosphate-bufferedsaline

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerasechainreaction

RBCs：紅細(xì)胞Redbloodcells

RNA：核糖核酸Ribonucleicacid

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Reverse-transcriptionpolymerasechainreaction

SPF：無特定病原體Specificpathogenfree

5總則

5.1采用雞胚接種方法從綠孔雀檢測樣品分離禽副黏病毒。

5.2取5.1得到的雞胚尿囊液做病毒血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)，確定分離毒株的種屬和

血清型（亞型）。

5.3用RT-PCR擴(kuò)增分離毒株的RNA聚合酶（L）基因和基質(zhì)蛋白（M）基因，對禽副黏病毒及其第1

血清型（新城疫病毒）分別做出鑒定。

5.4對5.2或5.3確定的新城疫病毒分離株，采取RT-PCR擴(kuò)增其融合蛋白（F）基因，再做測序分析，

對新城疫病毒分離株做出毒力判定。

6儀器設(shè)備和試劑

6.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備

6.1.1PCR儀：溫度范圍4.0℃～99.9℃，樣品基座配置至少包括單個(gè)0.2mL孔。

2

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6.1.2凝膠成像系統(tǒng)：對EB染色的DNA檢測靈敏度低至0.1ng；有效像數(shù)1360×1024、10bit，數(shù)

據(jù)線接口USB2.0。

6.1.3冷凍高速離心機(jī)：最高離心力20000g；容量1.5mL×12。

6.1.4電泳儀：電壓50V～120V，電流10mA～800mA，定時(shí)0min～999min。

6.1.5電泳槽：耐高溫、耐腐蝕、不漏液；緩沖液新鮮且容量充足。

6.1.6冰箱：具有冷藏和冷凍功能分區(qū)（?20℃～4℃）。

6.1.7微量移液器：單道可調(diào)，量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL。

6.1.8水浴鍋：溫度范圍20℃～100℃。

6.1.9過濾器：一次性無菌用品，內(nèi)含孔徑0.45μm的濾膜。

6.1.10V形孔血凝反應(yīng)板：一次性或可重復(fù)使用的血凝反應(yīng)板。

6.2試劑

6.2.1阿氏液（Alsever'sSolution），pH7.2、0.01mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、1%健康未免疫雞

紅細(xì)胞懸液、標(biāo)準(zhǔn)新城疫病毒抗原、陽性對照血清和陰性對照血清。

6.2.2RNA提取試劑盒、氯仿、異丙醇、75%乙醇、1.0%瓊脂糖凝膠、50×TAE緩沖液、10μg/μL溴

化乙啶（EB）或其他可替代的核酸染料、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×TaqMasterMix、無RNA酶滅菌超純水

（DEPC處理水）、10×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、dNTPs、RNase抑制劑（40U/μL)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）、

膠回收試劑盒。

6.2.3試劑配制見附錄A。

7樣品

7.1采樣要求與原則

7.1.1采樣應(yīng)符合NY/T541的要求。

7.1.2采集的樣品具有代表性，應(yīng)從瀕死、死禽和處于急性發(fā)病期的綠孔雀采集樣品，對暴發(fā)疫病的

群體宜采集多只發(fā)病或死亡個(gè)體的樣品，采樣過程應(yīng)無菌操作，容器應(yīng)密封，注意避免被污染。

7.2采集工具

棉拭子、剪刀、鑷子、1.5mL離心管、研缽等采樣工具經(jīng)121℃、20min高壓滅菌并烘干。

7.3樣品類型與采樣方法

7.3.1組織樣品

取病死孔雀待檢樣品，采集肺臟（或氣管）、腦、心、肝、脾、胃、腎等組織各1份，每份不少于

3g，置于潔凈樣品袋或平皿內(nèi)。將樣品封口貼上標(biāo)簽，做好標(biāo)記。

7.3.2拭子樣品

7.3.2.1取待檢樣品，采集喉氣管拭子和泄殖腔拭子（或新鮮糞樣）各1份，將拭子樣品端剪下或折

斷，分別置于無菌試管或器皿中，加1.0mL～1.5mL含抗生素的PBS。將樣品封口，貼上標(biāo)簽，做好

標(biāo)記。

7.3.2.2抗生素含量視具體情況而定：

a)對氣管拭子，PBS應(yīng)含青霉素（1000U/mL）、鏈霉素（1mg/mL）或卡那霉素（50μg/mL）

和制菌霉素（1000U/mL）；

3

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b)對泄殖腔拭子和糞便PBS，上述抗生素濃度應(yīng)提高至5倍。

7.3.3血清樣品

采集靜脈血液2mL～3mL于無菌離心管中，自然放置析出血清，3000r/min離心10min，將血清轉(zhuǎn)

移、分裝于新的無菌試管中，蓋緊蓋子，封好口，貼上標(biāo)簽。不同個(gè)體的血清樣品不能混合。

7.3.4整只采樣

將病死孔雀裝入封閉的無毒塑料袋內(nèi)，至少用兩層塑料袋包裝，封口并貼上標(biāo)簽，作好標(biāo)記。

7.4采樣登記表的填寫

填寫采樣記錄表（見附錄B），樣品編號應(yīng)與標(biāo)簽一致，隨樣品送至符合NY/T1948要求的實(shí)驗(yàn)室。

7.5樣品的保存和運(yùn)輸

7.5.1樣品應(yīng)置于加干冰或冰袋的保溫瓶或隔熱泡沫盒中運(yùn)輸，也可用液氮罐運(yùn)輸，保溫容器應(yīng)密封，

防止?jié)B漏。保溫容器外貼封條，封條有貼封人（單位）簽字或蓋章，并注明貼封日期。

7.5.2所有樣品在4℃以下運(yùn)輸，拭子樣品和組織樣品應(yīng)作暫時(shí)的冷藏（4℃）或冷凍（–20℃）處

理，隨即送至實(shí)驗(yàn)室。

7.5.3血清樣品宜單獨(dú)存放。若24h內(nèi)可運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室，在保溫箱內(nèi)加冰袋冷藏運(yùn)輸；若超過24h，應(yīng)

先冷凍，其后在保溫箱內(nèi)加大量冰袋運(yùn)輸，途中不能超過48h。

7.5.4各種樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，若暫時(shí)不進(jìn)行處理，則應(yīng)冷凍（–20℃以下）保存，不應(yīng)反復(fù)凍融。

8試驗(yàn)步驟

8.1雞胚接種（病毒分離）

8.1.1樣品處理

將棉拭子在PBS中充分混勻至拭子上沒有肉眼可見的樣品；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研

磨，按照1g組織加10mLPBS的比例混成懸液。樣品液經(jīng)3000r/min離心10min，取上清液用濾器過濾，

再取濾過液作為接種材料。

8.1.2樣品接種

取按8.1.1處理完畢的樣品，以0.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種孵化9d～11d的SPF雞胚，每個(gè)樣品

接種3～5枚雞胚，在37℃孵化箱內(nèi)孵育，每天上午和下午定點(diǎn)觀察雞胚死亡情況。無菌收集24h~96h

死亡雞胚及96h仍存活雞胚的尿囊液，用于病毒血凝試驗(yàn)以測定有無HA活性。

8.2病毒血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)

8.2.1病毒血凝（HA）試驗(yàn)

8.2.1.1在96孔V型微量反應(yīng)板，每孔預(yù)先加25μLPBS。

8.2.1.2向第1孔加入25μL尿囊液，反復(fù)吹吸3次～5次混勻。

8.2.1.3從第1孔吸取25μL溶液加入第2孔，混勻后吸取25μL加入第3孔，如此進(jìn)行2倍連續(xù)稀

釋至第11孔，從第11孔吸取25μL溶液棄去，但第12孔加入25μLPBS或正常尿囊液作為陰性對照

孔。

4

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8.2.1.4每孔加入25μLPBS。

8.2.1.5每孔加入25μL1%雞紅細(xì)胞懸液。

8.2.1.6輕輕振蕩血凝反應(yīng)板以混勻反應(yīng)體系，室溫（20℃～25℃）靜置40min，或4℃靜置60min，

當(dāng)陰性對照孔的紅細(xì)胞在孔底匯集成原點(diǎn)時(shí)判定結(jié)果。

8.2.2病毒血凝抑制（HI）試驗(yàn)

8.2.2.1在96孔血凝反應(yīng)板，每孔預(yù)先加入25μLPBS。

8.2.2.2向第一孔加入25μL血清樣品，混勻。

8.2.2.3在血凝反應(yīng)板上將血清作橫向的2倍連續(xù)稀釋，但第12孔、第13孔、第14孔和第15孔分

別設(shè)置為加25μLPBS的紅細(xì)胞對照孔、加未做任何免疫禽血清的陰性對照孔、加禽流感病毒抗體的對

照孔和加禽腺病毒抗體的對照孔（對已確定禽副黏病毒血清型的分離毒株，還可設(shè)置陽性對照孔）。

8.2.2.4每孔加入25μL4HAU的病毒抗原，室溫（20℃～25℃）靜置不少于30min，或4℃靜置不

少于60min。

8.2.2.5每孔加入25μL1%RBCs，輕輕振蕩混勻，室溫（20℃～25℃）靜置約40min，或4℃放置

約60min，當(dāng)紅細(xì)胞對照孔呈顯著鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。

8.3禽副黏病毒L和M基因的RT-PCR擴(kuò)增

8.3.1病毒RNA的提取

可用商品化RNA提取試劑盒提取待檢樣品（棉拭子、組織或雞胚尿囊液）、陽性對照樣品及陰性

對照樣品的病毒RNA。也可用RNA提取試劑（如Trizol）提取，方法如下：

a)將經(jīng)過預(yù)處理的250μL待檢樣品加入750μLRNA提取試劑（如Trizol）中，振蕩2min，室

溫放置5min；

b)加入250μL氯仿，在微量振蕩器上振蕩1min，室溫放置5min后，4℃、12000r/min（約14000×g）

離心15min；

c)吸取上層水相轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入等量的異丙醇，混勻，室溫放置15min，4℃、12000

r/min（約14000×g）離心15min；

d)小心吸棄上清，加入DEPC處理的75%乙醇750μL，4℃、12000r/min（約14000×g）離心

5min；

e)小心吸棄上清，將沉淀自然風(fēng)干或于50℃干燥箱中晾干，加適量的DEPC處理水溶解；

f)取5μL提取物與1μL6×核酸上樣緩沖液混勻，做1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA提取效果，

對組織樣品觀測到28S、18S及5.8SrRNA三個(gè)條帶或至少前兩個(gè)條帶，提示RNA提取合格；

g)提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT或RT-PCR擴(kuò)增，若需長期保存RNA，應(yīng)置于?80℃冰箱或

液氮內(nèi)。

8.3.2RT-PCR擴(kuò)增（兩步法）

8.3.2.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA的合成）：取提取的RNA11μL，加入2μL、10μmo1//L的反轉(zhuǎn)錄引物

（見附錄C），4μL5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶、0.5μLRNA酶抑制劑、2μLdNTPMixture至

20μL，42℃孵育1h，即得到cDNA溶液，直接用于PCR擴(kuò)增或?20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

8.3.2.2PCR擴(kuò)增體系：在反應(yīng)管中依次加入8μL無核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述

cDNA溶液、0.5μL上游引物和0.5μL下游引物（見附錄C，引物濃度均為10μmol/L），混勻，瞬時(shí)

離心，使液體全部集中于管底。

5

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8.3.2.3PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循環(huán)30

次，72℃延伸5min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后立即取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查或置于4℃冰箱備用。

8.3.3擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

制備1.5%瓊脂糖凝膠板。在電泳槽內(nèi)加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取3μL～5μL

擴(kuò)增產(chǎn)物加到凝膠孔，加入5μLDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。恒壓（8V～10V/cm凝膠長度）電泳30min～40min，

隨后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

8.4新城疫病毒F基因的RT-PCR擴(kuò)增及測序分析

8.4.1病毒RNA的提取

按照8.3.1步驟進(jìn)行。

8.4.2引物

針對新城疫病毒F基因設(shè)計(jì)的引物見附錄C。

8.4.3RT-PCR擴(kuò)增（一步法）

8.4.3.1RT-PCR擴(kuò)增體系配制見表1。體系配好后，蓋緊PCR反應(yīng)管蓋，并做好標(biāo)記。

8.4.3.2使用瞬時(shí)離心使液體都沉降到PCR管底。同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性對照。PCR擴(kuò)增程序：42℃

反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸45s共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃

再延伸7min。PCR產(chǎn)物置于4℃保存或?20℃凍存?zhèn)錂z。

表1RT-PCR擴(kuò)增體系

組分體積（μL）

無RNA酶滅菌超凈水14.6

10×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液2.5

dNTPs（2.5mmol/Leach）2.0

RNase抑制劑（40U/μL）0.5

AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）0.7

Taq酶（5U/μL）0.7

F基因上游引物（10μmol/L）0.5

F基因下游引物（10μmol/L）0.5

模板RNA3.0

總計(jì)25

8.4.4擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢查

參照8.3.3操作。

8.4.5測序分析

將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收、純化，做核酸測序，所獲序列用DNAstar（5.0）分析并在NCBI

網(wǎng)站上做BLAST在線比對。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)分離毒株F的氨基酸序列，確定內(nèi)切蛋白酶識別位點(diǎn)的

堿性氨基酸數(shù)量。

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9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

9.1HA試驗(yàn)結(jié)果判定

9.1.1將血凝反應(yīng)板傾斜呈約60°，觀察RBCs有無呈淚珠樣流淌，出現(xiàn)淚珠樣流淌的反應(yīng)孔判定為病

毒血凝陰性。

9.1.2完全凝集（無淚珠樣流淌）的病毒最大稀釋倍數(shù)為該病毒樣品（尿囊液）的血凝滴度，其相應(yīng)

的病毒含量表示為1個(gè)血凝單位（HAU)，再根據(jù)開始的稀釋倍數(shù)精確計(jì)算血凝滴度。

9.1.3血凝判定標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞均勻分散在孔內(nèi)、傾斜血凝板時(shí)不流淌判為完全凝集，記作++++；75%

凝集記作+++；50%凝集記作++；25%凝集記作+；紅細(xì)胞匯集于孔底中央呈圓點(diǎn)、傾斜血凝板時(shí)與對照

孔（僅含25μLRBCs和50μLPBS）RBCs流淌相同的孔判定為不凝集，記作?。

9.2HI試驗(yàn)結(jié)果判定

9.2.1紅細(xì)胞均勻分散在孔底周圍、傾斜血凝板時(shí)不流淌判為完全凝集，記作++++；75%凝集記作+++；

50%凝集記作++；25%凝集記作+；紅細(xì)胞集中在孔底中央呈圓點(diǎn)、傾斜血凝板時(shí)與對照孔（僅含25μL

RBCs和50μLPBS）RBCs流淌相同的孔判定為不凝集或血凝被抑制，記作?。

9.2.2完全抑制4HAU病毒抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為該血清的HI滴度。

2

9.2.3檢查各種對照：陰性對照血清HI滴度不高于4（記作2或2log2），陽性對照血清HI滴度應(yīng)

在已知滴度的一個(gè)稀釋度以內(nèi)，紅細(xì)胞對照應(yīng)無自凝現(xiàn)象，結(jié)果有效，試驗(yàn)成立。

4

9.2.4如果高于1:16（2或4log2）稀釋度的血清能抑制4HAU的病毒抗原，HI滴度被判為HI抗體

陽性，表明動(dòng)物發(fā)生新城疫病毒感染或接種過新城疫疫苗。

9.2.5如果血清HI滴度為16，判為可疑，需重復(fù)HI試驗(yàn)，若HI滴度仍為16，可判定血清抗體陽性，

若HI滴度為8則判定為血清抗體陰性。

9.2.6在所有的確診試驗(yàn)中針對試驗(yàn)采用的HAU應(yīng)設(shè)病毒HA滴度的追溯性測定。

9.2.7當(dāng)血凝活性不被禽流感病毒抗體和禽腺病毒抗體阻斷，便可初步判定為禽副黏病毒陽性。

9.3L和M基因擴(kuò)增結(jié)果判定

使用L基因引物做PCR擴(kuò)增呈陽性結(jié)果時(shí)，禽副黏病毒各血清型的擴(kuò)增產(chǎn)物均約121bp。進(jìn)而使用

M基因引物擴(kuò)增NDV陽性對照、陰性對照和待測分離毒株，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，陰、

陽性對照同時(shí)成立表明試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無效。在陰、陽性對照結(jié)果成立的前提下，如果待檢樣品的

RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳后在約300bp位置出現(xiàn)特異性的單一條帶，則初步判定為禽副黏病毒1型即NDV

核酸陽性。

9.4F基因擴(kuò)增結(jié)果及毒力判定

9.4.1試驗(yàn)成立條件：凝膠電泳陽性對照出現(xiàn)約535bp擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對照無擴(kuò)增條帶。

9.4.2待檢樣品出現(xiàn)535bp左右的目的片段（與陽性對照大小相符），判為新城疫病毒核酸陽性；待

檢樣品未出現(xiàn)目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。

9.4.3若NDV分離毒株F2亞基的羧基端有3個(gè)以上堿性氨基酸（精氨酸或賴氨酸）殘基而F1亞基

的氨基端即117位為苯丙氨酸，判定該分離毒株為NDV強(qiáng)毒株。

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AA

附錄A

（規(guī)范性）

試劑配制

A.11.5%瓊脂糖凝膠

稱取瓊脂糖1.5g，放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃時(shí)，加入5μL核酸

染料，迅速混勻并鋪板，使凝膠厚度為3mm～5mm。

A.250×TAE電泳緩沖液

A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）：稱取EDTA18.61g，加滅菌雙蒸水至100mL，后用氫氧化鈉

調(diào)pH至8.0。

A.2.250×TAE電泳緩沖液：Tris堿242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加滅菌雙蒸水

溶解至1000mL。

A.3溴化乙啶（EB）溶液

溴化乙啶20mg，加滅菌雙蒸水溶解至20mL，避光保存。

A.4DEPC處理的雙蒸水

焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加滅菌雙蒸水至100mL，室溫放置6h～8h，121℃±2℃高壓滅菌

20min，分裝到DEPC處理過的1.5mL離心管。

A.5阿氏液（Alsever'sSolution）

A.5.1阿氏液配方見表A.1。

表A.1阿氏液配方

序號成分含量(g/100mL)

1葡萄糖2.05

2檸檬酸鈉0.80

3檸檬酸0.055

4氯化鈉0.42

A.5.2配制方法：加蒸餾水100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)?/p>

用。

A.6pH7.2、0.01mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）

A.6.1配制25×PB

磷酸氫二鈉2.74g；磷酸二氫鈉0.79g；加蒸餾水100mL。

A.6.2配制1×PBS

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25×PB40