DB15Drugscreeningregulationofprecisetreatmentforbacterialmastitisindairycows2020-11-30發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC1I奶牛細(xì)菌性乳房炎精準(zhǔn)治療藥物篩選技術(shù)規(guī)程最小抑菌濃度minimalinhibi用試管稀釋法測定細(xì)菌對藥物的敏感性。完全抑制細(xì)菌生長的最高稀釋管1毫升所含的藥量。亦即1金黃色葡萄球菌Staphylococcu一種革蘭氏陽性鏈球菌，可以導(dǎo)致感染腺體，長期注：該菌生長適宜溫度為37℃,pH為7.4～7.6，在普通培養(yǎng)基中生長不良，在加4試劑和材料4.1乳頭藥浴液。4.65%綿羊血瓊脂平板。4.12DNAmarker：DL2000。24.15質(zhì)控菌株ATCC29213/254.17滅菌吸頭(5mL/1mL/200uL/10uL)。4.19無菌醫(yī)用棉簽。5.2高壓滅菌鍋。5.3生物安全柜。5.4恒溫培養(yǎng)箱。5.5恒溫振蕩培養(yǎng)箱。5.8微波爐。5.10凝膠成像系統(tǒng)。5.11麥?zhǔn)媳葷醿x。3將奶樣混勻，用無菌醫(yī)用棉簽蘸取奶樣，劃線接種到直徑為9cm的5%綿羊血瓊脂平板，將平板放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，剩余的奶樣置于4℃冰箱中保存，備用用1uL的無菌接種環(huán)挑取典型單個菌落,接種到不同的肉湯中于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中增菌培養(yǎng)。16h～24h后用1uL的無菌接種環(huán)在血平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，養(yǎng)24h～48h。若無雜菌生長則認(rèn)為該細(xì)菌已是純化的細(xì)菌，若有雜菌生長則需重新純從血平板上挑取已經(jīng)純化的典型單個細(xì)菌接種到肉湯中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中增菌培養(yǎng)8h～16h，按照400uL菌液加入200用水煮法或細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒進(jìn)行提?。ň唧w方法參照分子克隆指南或相關(guān)產(chǎn)品說Bacterial16s-F：ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCBacterial16s-R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACT循環(huán)；72℃延伸10min。預(yù)期目的條帶大小挑取已經(jīng)鑒定的單個菌落接種到肉湯中（腸桿菌用MH肉湯，葡萄球菌用MH肉湯，鏈球菌用含5%血4（約1×108CFU/mL）。將0.5個麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌懸濁液稀釋1000倍，此時細(xì)菌懸濁液（約1×105CFU/mL此后將100uL的細(xì)菌懸濁液加移液器先吸取100uL無菌肉湯加入到第12孔中，作為空白對照，然后吸取1加入到96孔反應(yīng)板的第1～11孔中。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h～20h，進(jìn)行MIC結(jié)果的讀取。只加細(xì)菌孔生長良好且只加MH肉湯孔無細(xì)菌生長時，可進(jìn)行下一步。細(xì)菌對某種藥物的MIC，即抑制細(xì)菌生長的最低抑菌濃度，一般判定是參考細(xì)菌生長孔前一孔的濃度，即為MIC值（用甲氧芐啶和磺胺類藥物先確定大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株、金黃色葡萄球菌ATCC29213標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC數(shù)據(jù)是否符合質(zhì)控9藥物敏感性判定測試菌株藥物敏感性判定參考CLSI或EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，詳見表AMP(≥0.5)AMP(>2)AMC(≥8/4)AMC(≥8/4)FFC(≥8)5氟苯尼考；RIF-利福平(可代表利福昔明)；VA-萬古霉素；CIP-環(huán)丙沙星；SIZ-磺胺異噁唑；TMP/SMX-甲氧芐啶+磺--EFT-頭孢噻呋；MEM-美羅培南，STR-鏈霉素,KAN-卡那