PCR實(shí)驗(yàn)室基因擴(kuò)增檢驗(yàn)人員培訓(xùn)試題及答案填空題1.PCR是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過(guò)程。2.PCR反應(yīng)體系主要包括模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶、緩沖液等成分。3.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括特異性、長(zhǎng)度合適、避免引物二聚體、GC含量適宜等。4.熒光定量PCR常用的熒光化學(xué)方法有SYBRGreenⅠ和水解探針兩種。5.在PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)中，通常分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。6.為防止PCR實(shí)驗(yàn)室的污染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)使用一次性手套、移液器吸頭帶濾芯等。7.PCR反應(yīng)的三個(gè)基本步驟是變性、退火、延伸。8.常用的DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等，其中PfuDNA聚合酶具有較高的保真性。9.熒光定量PCR中，Ct值是指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。10.反轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）是將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。11.基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)從清潔區(qū)流向污染區(qū)。12.進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，模板DNA的質(zhì)量和濃度會(huì)影響PCR反應(yīng)的結(jié)果。13.引物的退火溫度一般根據(jù)其Tm值來(lái)確定，通常比Tm值低5℃左右。14.陽(yáng)性對(duì)照的作用是驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系的有效性，陰性對(duì)照的作用是檢測(cè)是否存在污染。15.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、測(cè)序等。16.在PCR實(shí)驗(yàn)室中，紫外線燈主要用于空氣和物體表面的消毒。17.基因擴(kuò)增檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)并取得相應(yīng)的資格證書后才能上崗。18.實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以對(duì)樣本中的核酸含量進(jìn)行定量分析。19.標(biāo)本采集后應(yīng)盡快進(jìn)行處理，如果不能及時(shí)處理，應(yīng)將標(biāo)本保存在20℃或80℃冰箱中。20.PCR實(shí)驗(yàn)室的廢棄物應(yīng)按照醫(yī)療廢物進(jìn)行處理。單選題1.PCR反應(yīng)中，變性溫度一般為（）A.55℃B.72℃C.94℃D.100℃答案：C解析：PCR變性步驟是使雙鏈DNA解鏈為單鏈，一般在94℃左右。2.以下哪種物質(zhì)不是PCR反應(yīng)體系的成分（）A.引物B.抗體C.dNTPD.DNA聚合酶答案：B解析：PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶和緩沖液等，抗體不是其成分。3.熒光定量PCR中，SYBRGreenⅠ的作用是（）A.標(biāo)記引物B.標(biāo)記模板C.與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光D.與單鏈DNA結(jié)合發(fā)光答案：C解析：SYBRGreenⅠ能與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。4.PCR實(shí)驗(yàn)室中，試劑準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)配備的儀器不包括（）A.天平B.離心機(jī)C.生物安全柜D.測(cè)序儀答案：D解析：試劑準(zhǔn)備區(qū)主要進(jìn)行試劑的配制等操作，不需要測(cè)序儀，測(cè)序儀一般在擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)使用。5.引物設(shè)計(jì)時(shí)，GC含量一般應(yīng)控制在（）A.10%20%B.20%30%C.40%60%D.70%80%答案：C解析：引物GC含量在40%60%為宜，這樣能保證引物的穩(wěn)定性和特異性。6.下列關(guān)于Ct值的描述，正確的是（）A.Ct值越大，樣本中核酸含量越高B.Ct值越小，樣本中核酸含量越高C.Ct值與樣本中核酸含量無(wú)關(guān)D.Ct值只與PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)有關(guān)答案：B解析：Ct值是熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越小，說(shuō)明在較早的循環(huán)數(shù)就達(dá)到了閾值，即樣本中核酸含量越高。7.反轉(zhuǎn)錄PCR中，逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是（）A.將DNA轉(zhuǎn)錄為RNAB.將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNAC.擴(kuò)增DNAD.擴(kuò)增RNA答案：B解析：逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成cDNA。8.PCR實(shí)驗(yàn)中，為防止交叉污染，以下操作錯(cuò)誤的是（）A.不同區(qū)域使用不同的移液器B.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以不戴手套C.吸頭使用后應(yīng)丟棄D.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔和消毒答案：B解析：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須戴手套，以防止污染和保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。9.常用的DNA聚合酶Taq酶的最適反應(yīng)溫度是（）A.37℃B.55℃C.72℃D.94℃答案：C解析：Taq酶的最適反應(yīng)溫度是72℃，在此溫度下能高效地進(jìn)行DNA鏈的延伸。10.熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)（）繪制的。A.不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與對(duì)數(shù)濃度B.不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度與濃度C.不同循環(huán)數(shù)的熒光強(qiáng)度與濃度D.不同循環(huán)數(shù)的Ct值與對(duì)數(shù)濃度答案：A解析：熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線是用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與對(duì)數(shù)濃度繪制而成。11.PCR實(shí)驗(yàn)室的空氣凈化級(jí)別一般要求為（）A.百級(jí)B.千級(jí)C.萬(wàn)級(jí)D.十萬(wàn)級(jí)答案：C解析：PCR實(shí)驗(yàn)室一般要求空氣凈化級(jí)別為萬(wàn)級(jí)。12.以下哪種方法可以用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大?。ǎ〢.酶切分析B.核酸雜交C.瓊脂糖凝膠電泳D.熒光定量PCR答案：C解析：瓊脂糖凝膠電泳可以根據(jù)DNA片段在電場(chǎng)中的遷移情況來(lái)判斷其大小。13.在PCR反應(yīng)中，引物的作用是（）A.提供模板B.激活DNA聚合酶C.引導(dǎo)DNA合成的起始D.增加DNA的穩(wěn)定性答案：C解析：引物與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合，為DNA聚合酶提供起始位點(diǎn)，引導(dǎo)DNA合成的起始。14.基因擴(kuò)增檢驗(yàn)人員在操作過(guò)程中，不慎將樣本濺到眼睛里，應(yīng)立即（）A.用手揉眼睛B.用清水沖洗眼睛C.繼續(xù)完成實(shí)驗(yàn)D.找領(lǐng)導(dǎo)匯報(bào)答案：B解析：樣本濺到眼睛里應(yīng)立即用大量清水沖洗眼睛，以減少可能的危害。15.對(duì)于PCR實(shí)驗(yàn)室的廢棄物處理，以下說(shuō)法正確的是（）A.可以隨意丟棄B.應(yīng)分類收集，高壓滅菌后按醫(yī)療廢物處理C.可以直接倒入下水道D.可以賣給廢品回收站答案：B解析：PCR實(shí)驗(yàn)室的廢棄物應(yīng)分類收集，經(jīng)過(guò)高壓滅菌等處理后按醫(yī)療廢物處理，防止污染環(huán)境和傳播疾病。判斷題1.PCR反應(yīng)中，退火溫度越高，引物與模板的結(jié)合越穩(wěn)定。（×）解析：退火溫度過(guò)高，引物與模板結(jié)合不充分；退火溫度過(guò)低，引物可能會(huì)與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，一般退火溫度比引物Tm值低5℃左右。2.熒光定量PCR可以直接對(duì)樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。（×）解析：熒光定量PCR是對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，不能直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。3.PCR實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)區(qū)域可以不設(shè)置緩沖間。（×）解析：PCR實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)區(qū)域應(yīng)設(shè)置緩沖間，以防止不同區(qū)域之間的交叉污染。4.引物二聚體的形成會(huì)影響PCR反應(yīng)的效率和特異性。（√）解析：引物二聚體的形成會(huì)消耗引物和dNTP等反應(yīng)成分，降低PCR反應(yīng)的效率，同時(shí)也會(huì)影響結(jié)果的特異性。5.反轉(zhuǎn)錄PCR可以用于檢測(cè)RNA病毒的感染。（√）解析：反轉(zhuǎn)錄PCR先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于檢測(cè)RNA病毒的核酸，從而判斷是否感染。6.陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)陰性結(jié)果，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系可能存在問(wèn)題。（√）解析：陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系可能存在問(wèn)題，如試劑失效等。7.PCR產(chǎn)物的濃度可以通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。（√）解析：凝膠成像系統(tǒng)可以根據(jù)PCR產(chǎn)物條帶的亮度等信息，結(jié)合已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)PCR產(chǎn)物的濃度進(jìn)行定量分析。8.基因擴(kuò)增檢驗(yàn)人員可以不經(jīng)過(guò)培訓(xùn)直接上崗操作。（×）解析：基因擴(kuò)增檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)并取得相應(yīng)資格證書后才能上崗操作。9.在PCR實(shí)驗(yàn)中，模板DNA的濃度越高，PCR反應(yīng)的結(jié)果越好。（×）解析：模板DNA濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題，合適的模板濃度對(duì)于PCR反應(yīng)很重要。10.PCR實(shí)驗(yàn)室的紫外線燈可以長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用。（×）解析：紫外線燈長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用會(huì)影響其壽命，且可能會(huì)產(chǎn)生臭氧等有害氣體，一般使用一段時(shí)間后應(yīng)適當(dāng)關(guān)閉。簡(jiǎn)答題1.簡(jiǎn)述PCR反應(yīng)的基本原理。答：PCR是一種體外模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)。其基本原理是在模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶和緩沖液等存在的條件下，通過(guò)變性、退火和延伸三個(gè)基本步驟的多次循環(huán)，使特定的DNA片段得到大量擴(kuò)增。具體過(guò)程如下：變性：將反應(yīng)體系加熱至94℃左右，使雙鏈DNA解鏈為單鏈，為引物與模板的結(jié)合提供條件。退火：將溫度降低至引物的退火溫度（一般比引物Tm值低5℃左右），引物與單鏈模板DNA互補(bǔ)結(jié)合。延伸：將溫度升高至72℃左右，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈，與模板鏈互補(bǔ)。重復(fù)上述變性、退火和延伸的循環(huán)過(guò)程，每一次循環(huán)都會(huì)使特定DNA片段的數(shù)量增加一倍，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)后，就可以得到大量的目標(biāo)DNA片段。2.簡(jiǎn)述引物設(shè)計(jì)的基本原則。答：引物設(shè)計(jì)的基本原則如下：特異性：引物應(yīng)能特異性地與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，避免與非目標(biāo)序列結(jié)合，以保證PCR反應(yīng)的特異性。可以通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)來(lái)驗(yàn)證引物的特異性。長(zhǎng)度合適：引物長(zhǎng)度一般在1825個(gè)堿基之間。引物過(guò)短，特異性降低；引物過(guò)長(zhǎng)，合成成本增加，且退火溫度可能過(guò)高，不利于引物與模板的結(jié)合。避免引物二聚體：引物之間應(yīng)避免形成互補(bǔ)序列，防止引物二聚體的形成。引物二聚體的形成會(huì)消耗引物和dNTP等反應(yīng)成分，降低PCR反應(yīng)的效率。GC含量適宜：引物的GC含量一般應(yīng)控制在40%60%之間，這樣能保證引物的穩(wěn)定性和特異性。過(guò)高或過(guò)低的GC含量都可能影響引物與模板的結(jié)合。退火溫度：引物的退火溫度應(yīng)相近，一般相差不超過(guò)5℃，以保證在同一退火溫度下引物都能與模板有效結(jié)合。3'端穩(wěn)定性：引物的3'端應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)的G或C，以防止非特異性擴(kuò)增。同時(shí)，3'端不應(yīng)有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的可能性。3.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)及各區(qū)域的主要功能。答：PCR實(shí)驗(yàn)室通常分為四個(gè)區(qū)域，各區(qū)域的主要功能如下：試劑準(zhǔn)備區(qū)：主要用于試劑的制備、分裝和保存。該區(qū)域應(yīng)保持清潔，避免污染，配備天平、移液器、離心機(jī)、冰箱等儀器設(shè)備。標(biāo)本制備區(qū)：用于臨床標(biāo)本的接收、處理和核酸提取。該區(qū)域需要使用生物安全柜等設(shè)備，以防止操作人員受到生物危害和標(biāo)本之間的交叉污染。擴(kuò)增區(qū)：進(jìn)行PCR反應(yīng)的擴(kuò)增過(guò)程。該區(qū)域應(yīng)配備PCR儀等設(shè)備，溫度和濕度應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定，以保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析，如瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序等。該區(qū)域是PCR實(shí)驗(yàn)室中最容易受到污染的區(qū)域，應(yīng)與其他區(qū)域嚴(yán)格分開。4.簡(jiǎn)述熒光定量PCR的原理和優(yōu)點(diǎn)。答：熒光定量PCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。常用的熒光化學(xué)方法有SYBRGreenⅠ和水解探針兩種。SYBRGreenⅠ法：SYBRGreenⅠ是一種能與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出熒光的染料。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，隨著雙鏈DNA的擴(kuò)增，SYBRGreenⅠ與雙鏈DNA結(jié)合的數(shù)量增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。水解探針?lè)ǎ核馓结樖且环N帶有熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，TaqDNA聚合酶的5'3'外切酶活性將探針?biāo)?，使?bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)釋放出來(lái)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)如下：靈敏度高：可以檢測(cè)到極低濃度的核酸模板，能夠檢測(cè)到單個(gè)拷貝的核酸分子。特異性強(qiáng)：通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，可以準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)核酸序列。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而對(duì)樣本中的核酸含量進(jìn)行定量分析。重復(fù)性好：由于采用了熒光信號(hào)的檢測(cè)方法，減少了人為因素的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較好。操作簡(jiǎn)便：無(wú)需進(jìn)行PCR產(chǎn)物的后續(xù)處理，如電泳等，節(jié)省了時(shí)間和成本。5.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)室防止污染的措施。答：PCR實(shí)驗(yàn)室防止污染的措施主要包括以下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：將PCR實(shí)驗(yàn)室分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，各區(qū)域之間設(shè)置緩沖間，并有明確的標(biāo)識(shí)，人員和物品應(yīng)按照單向流動(dòng)的原則進(jìn)行操作，避免交叉污染。人員防護(hù)：實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽子和手套等防護(hù)用品，在不同區(qū)域更換工作服和手套，避免將污染從一個(gè)區(qū)域帶到另一個(gè)區(qū)域。儀器設(shè)備：各區(qū)域應(yīng)配備專用的儀器設(shè)備，如移液器、離心機(jī)、PCR儀等，不得交叉使用。儀器設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行清潔和維護(hù)，防止污染。實(shí)驗(yàn)耗材：使用一次性的實(shí)驗(yàn)耗材，如吸頭、離心管等，吸頭應(yīng)帶有濾芯，以防止氣溶膠污染。實(shí)驗(yàn)耗材應(yīng)在使用前進(jìn)行滅菌處理?？諝鈨艋篜CR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備空氣凈化系統(tǒng)，保持實(shí)驗(yàn)室的