miR857：擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)調(diào)控的分子鑰匙一、引言1.1研究背景與意義MicroRNA（miRNA）作為一類長(zhǎng)度約為20-24核苷酸的內(nèi)源非編碼小RNA，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演著舉足輕重的角色。其主要通過(guò)與靶基因mRNA分子互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而指導(dǎo)靶基因的切割或者抑制靶基因的翻譯過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后精準(zhǔn)調(diào)控。大量研究表明，miRNA幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)重要環(huán)節(jié)，涵蓋了植物器官的發(fā)生與發(fā)育、激素應(yīng)答途徑的調(diào)節(jié)、逆境響應(yīng)過(guò)程的參與以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收的調(diào)控等多個(gè)方面。例如，在植物器官發(fā)育方面，特定的miRNA能夠調(diào)控葉片的形態(tài)建成、花器官的發(fā)育等過(guò)程；在激素應(yīng)答中，miRNA可響應(yīng)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等激素信號(hào)，參與植物的生長(zhǎng)調(diào)控；在逆境響應(yīng)時(shí)，植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)對(duì)干旱、高鹽、低溫等脅迫的耐受性。維管組織的次生生長(zhǎng)對(duì)于植物而言意義非凡，它是植物在初生生長(zhǎng)結(jié)束之后，由次生分生組織，特別是維管形成層的持續(xù)活動(dòng)，不斷分化產(chǎn)生次生維管組織的過(guò)程，這一過(guò)程主要表現(xiàn)為植物根、莖的顯著加粗。次生生長(zhǎng)對(duì)于植物的諸多生理功能至關(guān)重要，它能夠增強(qiáng)植物的機(jī)械支持能力，使植物能夠更好地抵御外界的物理壓力，如強(qiáng)風(fēng)、暴雨等，從而保證植物在復(fù)雜的自然環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)；同時(shí)，次生生長(zhǎng)有助于提高植物的水分和養(yǎng)分運(yùn)輸效率，隨著植物的生長(zhǎng)，其對(duì)水分和養(yǎng)分的需求不斷增加，次生生長(zhǎng)形成的次生木質(zhì)部和次生韌皮部能夠?yàn)樗趾宛B(yǎng)分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸提供更高效的通道，滿足植物各個(gè)部位的生長(zhǎng)需求；此外，次生生長(zhǎng)還與植物的繁殖和生存策略密切相關(guān)，例如，一些多年生植物通過(guò)次生生長(zhǎng)積累足夠的物質(zhì)和能量，為開花結(jié)果等繁殖過(guò)程奠定基礎(chǔ)。大多數(shù)裸子植物和木本雙子葉植物都具備明顯的次生生長(zhǎng)和次生結(jié)構(gòu)，這也是它們能夠生長(zhǎng)為高大喬木的重要原因之一。在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中，miRNA發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。眾多研究已證實(shí)，多種miRNA參與了維管組織次生生長(zhǎng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們通過(guò)對(duì)靶基因的精細(xì)調(diào)控，影響木質(zhì)素的合成與沉積、維管形成層細(xì)胞的分裂與分化等關(guān)鍵過(guò)程。例如，某些miRNA能夠靶向調(diào)控與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因，從而影響木質(zhì)素的含量和組成，進(jìn)而改變植物細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)；另一些miRNA則可以調(diào)節(jié)維管形成層細(xì)胞的活性，控制次生維管組織的產(chǎn)生速率和數(shù)量。對(duì)這些miRNA及其調(diào)控機(jī)制的深入研究，有助于我們?nèi)胬斫庵参锞S管組織次生生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)理，為植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。miR857在植物中的分布并不廣泛，在擬南芥（Arabidopsisthaliana）中，它由單個(gè)基因AtMIR857編碼。盡管已有研究初步揭示了miR857參與了植物的某些生理過(guò)程，如通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其靶基因擬南芥LACCASE7，降低漆酶活性，進(jìn)而參與木質(zhì)素含量的調(diào)控以及次生木質(zhì)部的形態(tài)發(fā)生，并且在低銅條件下，miR857會(huì)被SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE7激活。然而，miR857在調(diào)控?cái)M南芥維管組織次生生長(zhǎng)方面的具體功能和詳細(xì)機(jī)制，目前仍存在諸多未知之處。深入探究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的作用機(jī)制，不僅能夠豐富我們對(duì)植物維管組織發(fā)育調(diào)控的認(rèn)識(shí)，揭示miR857在這一重要過(guò)程中的獨(dú)特調(diào)控方式，還可能為通過(guò)基因工程手段改良植物的生長(zhǎng)特性提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和潛在的應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在植物miRNA的研究領(lǐng)域，近年來(lái)取得了豐碩的成果。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法的不斷發(fā)展與完善，越來(lái)越多的miRNA被鑒定和注釋，人們對(duì)miRNA的生物合成途徑、作用機(jī)制以及在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等過(guò)程中的功能有了更為深入和全面的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在植物的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用，從種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)，到植株的開花結(jié)果、衰老死亡，miRNA都參與其中，通過(guò)精細(xì)調(diào)控靶基因的表達(dá)，確保植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的順利進(jìn)行。在維管組織次生生長(zhǎng)的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)、生理生化變化以及分子調(diào)控機(jī)制等多個(gè)層面展開了深入探索。在細(xì)胞學(xué)層面，借助先進(jìn)的顯微鏡技術(shù)，研究人員詳細(xì)觀察了維管形成層細(xì)胞的分裂方式、分化過(guò)程以及次生維管組織的形成過(guò)程，揭示了維管組織次生生長(zhǎng)的細(xì)胞學(xué)規(guī)律；在生理生化方面，對(duì)次生生長(zhǎng)過(guò)程中木質(zhì)素、纖維素等細(xì)胞壁成分的合成與代謝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了這些物質(zhì)在維管組織次生生長(zhǎng)中的重要作用；在分子調(diào)控機(jī)制方面，眾多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子、植物激素以及非編碼RNA等在維管組織次生生長(zhǎng)的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX4（WOX4）轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)維管形成層細(xì)胞的分裂和分化，從而影響維管組織的次生生長(zhǎng)；生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控維管形成層細(xì)胞的活性和分化方向。關(guān)于miR857，目前的研究已初步揭示了其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一些功能。研究表明，miR857能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其靶基因擬南芥LACCASE7進(jìn)行調(diào)控，使得漆酶活性降低，進(jìn)而參與到木質(zhì)素含量的調(diào)控以及次生木質(zhì)部的形態(tài)發(fā)生過(guò)程中。同時(shí)，在低銅條件下，miR857會(huì)被SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE7激活。此外，有專利研究表明，過(guò)量表達(dá)miR857會(huì)致使莖干平均直徑減小、機(jī)械強(qiáng)度減弱，木質(zhì)素含量降低，這為通過(guò)基因工程手段調(diào)控植物木質(zhì)化程度提供了新的思路。然而，盡管當(dāng)前對(duì)miR857的研究已取得一定進(jìn)展，但在miR857參與調(diào)控?cái)M南芥維管組織次生生長(zhǎng)的具體功能和詳細(xì)機(jī)制方面，仍存在諸多空白和未知之處。例如，miR857除了已知的靶基因LACCASE7外，是否還存在其他未知的靶基因，這些靶基因在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中又發(fā)揮著怎樣的作用，目前尚不清楚；miR857與其他參與維管組織次生生長(zhǎng)調(diào)控的因子，如轉(zhuǎn)錄因子、植物激素等之間，是否存在相互作用，以及如何相互作用來(lái)協(xié)同調(diào)控維管組織的次生生長(zhǎng)，也有待進(jìn)一步深入研究；此外，miR857在不同環(huán)境條件下對(duì)維管組織次生生長(zhǎng)的調(diào)控是否存在差異，以及這種差異背后的分子機(jī)制是什么，同樣是亟待解決的問題。綜上所述，深入研究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的作用機(jī)制，不僅能夠填補(bǔ)當(dāng)前該領(lǐng)域研究的空白，完善植物維管組織發(fā)育調(diào)控的理論體系，還可能為通過(guò)基因工程技術(shù)改良植物的生長(zhǎng)特性，如提高植物的抗倒伏能力、改善木材品質(zhì)等，提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和潛在的應(yīng)用前景。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入剖析miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的調(diào)控功能與分子機(jī)制，為揭示植物維管組織發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的理論依據(jù)。具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：1.3.1研究目標(biāo)明確miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)模式和功能，解析其對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，揭示miR857在擬南芥木質(zhì)化進(jìn)程中的作用及其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3.2研究?jī)?nèi)容miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的表達(dá)模式分析：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的擬南芥維管組織，包括根、莖的維管形成層、次生木質(zhì)部和次生韌皮部等部位，進(jìn)行miR857表達(dá)水平的檢測(cè)，繪制其在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)圖譜，明確miR857的表達(dá)與維管組織次生生長(zhǎng)進(jìn)程的相關(guān)性。利用原位雜交技術(shù)，在組織和細(xì)胞水平上對(duì)miR857進(jìn)行定位分析，直觀展示miR857在擬南芥維管組織中的具體分布位置，為深入探究其功能提供基礎(chǔ)。miR857對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制研究：借助生物信息學(xué)分析方法，結(jié)合擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR857可能的靶基因，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩選和分析，挑選出與維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)的潛在靶基因。通過(guò)5'-RACE（Rapid-AmplificationofcDNAEnds）實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR857與靶基因mRNA之間的相互作用位點(diǎn)，確定miR857對(duì)靶基因的切割作用方式。構(gòu)建miR857過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，同時(shí)構(gòu)建靶基因的過(guò)表達(dá)和突變體植株，通過(guò)對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株的表型分析、基因表達(dá)水平檢測(cè)以及相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，深入研究miR857對(duì)靶基因的調(diào)控作用及其在維管組織次生生長(zhǎng)中的功能。miR857在擬南芥木質(zhì)化進(jìn)程中的作用研究：利用組織化學(xué)染色技術(shù)，如間苯三酚染色法，對(duì)miR857過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的擬南芥植株莖稈進(jìn)行染色，觀察木質(zhì)素在維管組織中的沉積情況，分析miR857對(duì)木質(zhì)化程度和木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的影響。采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（NMR）等技術(shù)，對(duì)擬南芥莖稈中的木質(zhì)素含量、結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行定量分析，明確miR857對(duì)木質(zhì)素生物合成途徑的調(diào)控作用。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）分析、酶活性測(cè)定等方法，研究miR857對(duì)木質(zhì)素合成相關(guān)酶，如漆酶（LACCASE）、過(guò)氧化物酶（POD）等的活性和蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步揭示miR857在擬南芥木質(zhì)化進(jìn)程中的分子調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，從不同層面深入探究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的作用機(jī)制，具體研究方法如下：遺傳分析方法：通過(guò)構(gòu)建miR857過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，以及靶基因的過(guò)表達(dá)和突變體植株，對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株進(jìn)行遺傳分析。觀察不同遺傳背景下植株的表型變化，分析miR857及其靶基因?qū)M南芥維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)性狀的影響，如莖干的粗細(xì)、木質(zhì)部和韌皮部的發(fā)育情況等。利用遺傳雜交實(shí)驗(yàn)，將不同基因型的擬南芥植株進(jìn)行雜交，分析雜交后代的性狀分離比和基因表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證miR857與靶基因之間的遺傳關(guān)系以及它們?cè)诰S管組織次生生長(zhǎng)調(diào)控中的相互作用。細(xì)胞學(xué)觀察方法：采用石蠟切片技術(shù)，將不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的擬南芥莖、根等組織制作成石蠟切片，通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色等方法，在光學(xué)顯微鏡下觀察維管組織的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式，分析miR857對(duì)維管形成層細(xì)胞的分裂、分化以及次生木質(zhì)部和次生韌皮部細(xì)胞發(fā)育的影響。運(yùn)用透射電子顯微鏡（TEM）技術(shù)，對(duì)擬南芥維管組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，研究miR857對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器形態(tài)等方面的影響，深入了解其在細(xì)胞水平上對(duì)維管組織次生生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制。分子生物學(xué)方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同組織部位的擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以其為模板，利用特異性引物對(duì)miR857及其靶基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，分析它們?cè)诓煌瑮l件下的表達(dá)水平變化，明確miR857及其靶基因的表達(dá)模式與維管組織次生生長(zhǎng)進(jìn)程的相關(guān)性。通過(guò)5'-RACE實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR857與靶基因mRNA之間的相互作用位點(diǎn)，確定miR857對(duì)靶基因的切割作用方式。構(gòu)建含有miR857結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因載體，將其轉(zhuǎn)化到擬南芥細(xì)胞中，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證miR857與靶基因的相互作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）分析技術(shù)，提取擬南芥組織總蛋白，通過(guò)特異性抗體檢測(cè)木質(zhì)素合成相關(guān)酶，如漆酶（LACCASE）、過(guò)氧化物酶（POD）等的蛋白表達(dá)水平，研究miR857對(duì)這些酶表達(dá)的影響?；谏鲜鲅芯糠椒?，本研究設(shè)計(jì)了如下技術(shù)路線（圖1）：首先，選取野生型擬南芥作為實(shí)驗(yàn)材料，在適宜的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲取不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的擬南芥植株，包括幼苗期、抽薹期、開花期等。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和原位雜交技術(shù)，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期擬南芥維管組織中miR857的表達(dá)水平和分布位置進(jìn)行檢測(cè)和分析，繪制miR857在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)圖譜。借助生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測(cè)miR857可能的靶基因，并通過(guò)5'-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR857與靶基因mRNA之間的相互作用位點(diǎn)。構(gòu)建miR857過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，以及靶基因的過(guò)表達(dá)和突變體植株，對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株進(jìn)行表型分析，觀察其維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)性狀的變化。利用組織化學(xué)染色技術(shù)，如間苯三酚染色法，對(duì)miR857過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的擬南芥植株莖稈進(jìn)行染色，觀察木質(zhì)素在維管組織中的沉積情況；采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（NMR）等技術(shù)，對(duì)擬南芥莖稈中的木質(zhì)素含量、結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行定量分析。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）分析、酶活性測(cè)定等方法，研究miR857對(duì)木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性和蛋白表達(dá)水平的影響，揭示miR857在擬南芥木質(zhì)化進(jìn)程中的分子調(diào)控機(jī)制。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入分析miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的調(diào)控功能和分子機(jī)制，撰寫研究論文，發(fā)表研究成果。[此處插入技術(shù)路線圖1，圖中應(yīng)清晰展示從材料選取、實(shí)驗(yàn)操作到結(jié)果分析的整個(gè)研究流程，各步驟之間用箭頭連接，注明每個(gè)步驟所采用的主要研究方法和預(yù)期得到的結(jié)果]二、擬南芥與維管組織次生生長(zhǎng)概述2.1擬南芥作為模式植物的優(yōu)勢(shì)擬南芥（Arabidopsisthaliana）隸屬十字花科，是植物科學(xué)研究中極具代表性的模式植物，在植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用。其之所以能成為模式植物，主要?dú)w因于以下諸多顯著優(yōu)勢(shì)：植株小巧，易于培養(yǎng)：擬南芥植株體型極為小巧，通常株高僅5-30厘米。這一特點(diǎn)使得它對(duì)生長(zhǎng)空間的需求極小，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，一個(gè)普通的茶杯便可種植數(shù)棵擬南芥，極大地節(jié)省了培養(yǎng)空間，便于大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)種植和研究。同時(shí)，擬南芥的生長(zhǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，在普通的培養(yǎng)基上即可良好生長(zhǎng)，無(wú)需特殊的光照、溫度和濕度條件，這使得研究者能夠輕松地對(duì)其進(jìn)行人工培養(yǎng)，降低了研究成本和技術(shù)門檻。生長(zhǎng)周期短暫：從種子萌發(fā)到開花結(jié)果，擬南芥僅需6-8周的時(shí)間。相較于其他植物，如此短暫的生長(zhǎng)周期，使得研究者能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得多代實(shí)驗(yàn)材料，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了研究效率。這對(duì)于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異等過(guò)程而言，具有至關(guān)重要的意義，能夠快速驗(yàn)證研究假設(shè)，加速研究進(jìn)程。種子產(chǎn)量豐富：每棵擬南芥植株能夠產(chǎn)生大量的種子，通常可達(dá)數(shù)千粒。豐富的種子產(chǎn)量為遺傳研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料，滿足了遺傳分析中對(duì)樣本數(shù)量的需求，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和可靠性。在進(jìn)行遺傳雜交、突變體篩選等實(shí)驗(yàn)時(shí)，大量的種子能夠確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，減少因種子數(shù)量不足而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差?；蚪M結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單：擬南芥擁有目前已知植物基因組中較小的基因組，其每個(gè)單倍染色體組（n=5）的總長(zhǎng)僅約7000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)。簡(jiǎn)單的基因組結(jié)構(gòu)使得基因測(cè)序、基因功能研究等工作相對(duì)容易開展。與其他植物復(fù)雜龐大的基因組相比，擬南芥基因組的測(cè)序工作率先完成，并且其基因注釋和功能解析也更為深入和全面。研究者能夠更加便捷地定位和克隆相關(guān)基因，深入探究基因的功能和調(diào)控機(jī)制，為植物基因工程和分子育種等領(lǐng)域的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟：經(jīng)過(guò)多年的研究和發(fā)展，擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已相當(dāng)成熟。目前，常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法能夠高效地將外源基因?qū)霐M南芥基因組中，實(shí)現(xiàn)對(duì)其基因的編輯和功能驗(yàn)證。這一成熟的技術(shù)體系使得研究者能夠方便地構(gòu)建各種轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，用于研究基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，為深入揭示植物生命活動(dòng)的奧秘提供了有力的工具。遺傳資源豐富：擬南芥具有大量的自然變異種群和豐富的突變體庫(kù)。這些遺傳資源為研究者提供了多樣化的實(shí)驗(yàn)材料，可用于研究基因功能、生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性等多個(gè)方面的問題。通過(guò)對(duì)自然變異種群的研究，能夠了解基因在自然環(huán)境中的多樣性和適應(yīng)性；而突變體庫(kù)則為基因功能的研究提供了直接的材料，通過(guò)分析突變體的表型變化，能夠快速確定基因的功能和作用機(jī)制。綜上所述，擬南芥憑借其植株小、生長(zhǎng)周期短、種子多、基因組小且易突變、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟以及遺傳資源豐富等諸多優(yōu)勢(shì)，成為了植物研究領(lǐng)域中理想的模式植物，為揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制、探索植物與環(huán)境的相互作用等提供了重要的研究平臺(tái)。2.2擬南芥維管組織的結(jié)構(gòu)與功能擬南芥的維管組織作為植物體中至關(guān)重要的復(fù)合組織，主要由木質(zhì)部、韌皮部和形成層構(gòu)成，這些組成部分在結(jié)構(gòu)和功能上緊密協(xié)作，共同保障了植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。木質(zhì)部：木質(zhì)部主要由導(dǎo)管、管胞、木纖維和木薄壁細(xì)胞組成。導(dǎo)管是由一系列端壁穿孔的管狀細(xì)胞縱向連接而成的長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞壁木質(zhì)化加厚，具有很強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，主要功能是在植物體內(nèi)運(yùn)輸水分和無(wú)機(jī)鹽，水分和無(wú)機(jī)鹽在導(dǎo)管中通過(guò)蒸騰拉力和根壓的作用，從根部向上運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€(gè)部位。管胞是兩端斜尖、長(zhǎng)梭形的細(xì)胞，其細(xì)胞壁同樣木質(zhì)化加厚，管胞不僅具有運(yùn)輸水分和無(wú)機(jī)鹽的功能，還因其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)植物起到一定的機(jī)械支持作用。木纖維是兩端尖銳、細(xì)長(zhǎng)的厚壁細(xì)胞，細(xì)胞壁高度木質(zhì)化，木纖維主要起機(jī)械支持作用，增強(qiáng)植物的莖干等部位的強(qiáng)度，使其能夠承受自身重量和外界的物理壓力。木薄壁細(xì)胞是生活的薄壁細(xì)胞，具有儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，如儲(chǔ)存淀粉、蛋白質(zhì)等，為植物的生長(zhǎng)和代謝提供物質(zhì)儲(chǔ)備。韌皮部：韌皮部主要由篩管、伴胞、韌皮纖維和韌皮薄壁細(xì)胞組成。篩管是由一列端壁具有篩板的管狀活細(xì)胞縱向連接而成，篩管分子的細(xì)胞壁不木質(zhì)化，主要功能是運(yùn)輸光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)，如糖類、氨基酸等，這些有機(jī)物質(zhì)通過(guò)篩管從植物的葉片等光合器官運(yùn)輸?shù)狡渌枰牟课唬绺?、莖尖等，為植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。伴胞與篩管分子緊密相連，兩者在發(fā)育上具有同源性，伴胞具有濃厚的細(xì)胞質(zhì)和豐富的細(xì)胞器，它與篩管分子協(xié)同完成物質(zhì)運(yùn)輸功能，為篩管分子提供能量和代謝物質(zhì)，同時(shí)參與篩管分子中物質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)。韌皮纖維是兩端尖銳的厚壁細(xì)胞，細(xì)胞壁木質(zhì)化程度較低，韌皮纖維主要起機(jī)械支持作用，增強(qiáng)韌皮部的強(qiáng)度，保護(hù)篩管等結(jié)構(gòu)，確保物質(zhì)運(yùn)輸?shù)捻樌M(jìn)行。韌皮薄壁細(xì)胞是生活的薄壁細(xì)胞，具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸有機(jī)物質(zhì)的功能，同時(shí)還參與植物體內(nèi)的信號(hào)傳遞等生理過(guò)程。形成層：在擬南芥中，形成層分為維管形成層和木栓形成層。維管形成層是位于木質(zhì)部和韌皮部之間的一層分生組織，由具有分裂能力的細(xì)胞組成。在次生生長(zhǎng)過(guò)程中，維管形成層的細(xì)胞進(jìn)行平周分裂，向內(nèi)分裂產(chǎn)生次生木質(zhì)部，加在初生木質(zhì)部的外方，使木質(zhì)部不斷增粗；向外分裂產(chǎn)生次生韌皮部，加在初生韌皮部的內(nèi)方，使韌皮部也不斷增粗。維管形成層的活動(dòng)使得植物的莖和根能夠不斷加粗，增強(qiáng)植物的機(jī)械支持能力，同時(shí)也增加了維管組織的運(yùn)輸能力，滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)的需求。木栓形成層通常由表皮或皮層的細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，它主要進(jìn)行平周分裂，向外分裂產(chǎn)生木栓層，木栓層細(xì)胞的細(xì)胞壁栓質(zhì)化，具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，能夠防止水分散失、抵御病蟲害的侵襲以及外界物理傷害；向內(nèi)分裂產(chǎn)生栓內(nèi)層，栓內(nèi)層與木栓層和維管組織一起構(gòu)成周皮，周皮是植物次生結(jié)構(gòu)的重要組成部分，對(duì)植物起到重要的保護(hù)作用。擬南芥維管組織的這些組成部分相互協(xié)作，共同實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)運(yùn)輸、機(jī)械支持、信號(hào)傳遞等多種重要功能，確保了植物在復(fù)雜的自然環(huán)境中能夠正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁衍。例如，木質(zhì)部和韌皮部通過(guò)維管束緊密相連，使得水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)能夠在植物體內(nèi)有序運(yùn)輸，維持植物的生理平衡；形成層的活動(dòng)則保證了維管組織的不斷更新和生長(zhǎng)，適應(yīng)植物不同生長(zhǎng)階段的需求。2.3維管組織次生生長(zhǎng)的過(guò)程與意義維管組織次生生長(zhǎng)是植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要由維管形成層和木栓形成層的活動(dòng)所驅(qū)動(dòng)，對(duì)植物的形態(tài)建成和生理功能具有至關(guān)重要的影響。維管形成層的活動(dòng)與次生維管組織的形成：維管形成層是位于初生木質(zhì)部和初生韌皮部之間的一層分生組織，它由原形成層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力轉(zhuǎn)化而來(lái)。在次生生長(zhǎng)過(guò)程中，維管形成層主要進(jìn)行平周分裂，即細(xì)胞沿著與器官表面平行的方向進(jìn)行分裂。向內(nèi)分裂產(chǎn)生的細(xì)胞逐漸分化形成次生木質(zhì)部，加在初生木質(zhì)部的外方；向外分裂產(chǎn)生的細(xì)胞則分化形成次生韌皮部，加在初生韌皮部的內(nèi)方。隨著維管形成層不斷地分裂活動(dòng)，次生木質(zhì)部和次生韌皮部的數(shù)量逐漸增多，從而使植物的莖和根不斷加粗。在次生木質(zhì)部中，導(dǎo)管、管胞、木纖維和木薄壁細(xì)胞等成分的比例和排列方式會(huì)發(fā)生變化，以適應(yīng)植物對(duì)水分和無(wú)機(jī)鹽運(yùn)輸以及機(jī)械支持的需求。次生韌皮部中的篩管、伴胞、韌皮纖維和韌皮薄壁細(xì)胞等也會(huì)相應(yīng)地發(fā)育和分化，確保有機(jī)物質(zhì)的高效運(yùn)輸。維管形成層除了進(jìn)行平周分裂外，還會(huì)進(jìn)行垂周分裂，以增加自身細(xì)胞的數(shù)量，從而維持其持續(xù)分裂的能力，保證次生生長(zhǎng)的順利進(jìn)行。木栓形成層的活動(dòng)與周皮的形成：隨著維管形成層的持續(xù)活動(dòng)，植物莖和根的直徑不斷增大，表皮和皮層等初生保護(hù)組織逐漸被拉伸、破壞，此時(shí)木栓形成層開始發(fā)揮作用。在根中，木栓形成層通常由中柱鞘細(xì)胞恢復(fù)分裂能力轉(zhuǎn)化而成；在莖中，木栓形成層可以由表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞或初生韌皮部的薄壁細(xì)胞等轉(zhuǎn)化而來(lái)。木栓形成層主要進(jìn)行平周分裂，向外分裂產(chǎn)生木栓層，木栓層細(xì)胞的細(xì)胞壁栓質(zhì)化，細(xì)胞排列緊密，具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，能夠有效防止水分散失、抵御病蟲害的侵襲以及外界物理傷害；向內(nèi)分裂產(chǎn)生栓內(nèi)層，栓內(nèi)層細(xì)胞是生活的薄壁細(xì)胞，具有一定的儲(chǔ)存和代謝功能。木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層共同組成周皮，周皮代替表皮成為植物次生結(jié)構(gòu)的外層保護(hù)組織。在多年生植物中，隨著莖的不斷加粗，木栓形成層的位置會(huì)逐漸向內(nèi)推移，新的木栓形成層不斷產(chǎn)生，從而形成多層周皮，進(jìn)一步增強(qiáng)了植物的保護(hù)能力。維管組織次生生長(zhǎng)的意義：維管組織次生生長(zhǎng)對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存具有多方面的重要意義。次生生長(zhǎng)使得植物的莖和根不斷加粗，顯著增強(qiáng)了植物的機(jī)械支持能力。對(duì)于高大的喬木而言，粗壯的莖干和根系能夠支撐起龐大的樹冠，使其在風(fēng)雨等自然環(huán)境中保持穩(wěn)定，不至于倒伏。次生生長(zhǎng)形成的次生木質(zhì)部和次生韌皮部，為植物提供了更為高效的物質(zhì)運(yùn)輸通道。次生木質(zhì)部中的導(dǎo)管和管胞能夠更快速地將根部吸收的水分和無(wú)機(jī)鹽向上運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€(gè)部位，滿足植物生長(zhǎng)和代謝的需求；次生韌皮部中的篩管則能夠?qū)⑷~片光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)更有效地運(yùn)輸?shù)街参锏钠渌M織和器官，為植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。次生生長(zhǎng)過(guò)程中形成的周皮具有良好的保護(hù)作用，能夠有效抵御外界不良環(huán)境因素對(duì)植物的傷害。周皮中的木栓層可以防止水分過(guò)度散失，保持植物體內(nèi)的水分平衡；同時(shí)，它還能阻擋病蟲害的侵入，減少植物受到病害和蟲害的風(fēng)險(xiǎn)，保障植物的健康生長(zhǎng)。在一些植物中，次生生長(zhǎng)還與植物的繁殖和生存策略密切相關(guān)。例如，一些多年生植物通過(guò)次生生長(zhǎng)積累大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為開花結(jié)果等繁殖過(guò)程提供充足的能量和物質(zhì)儲(chǔ)備；在逆境條件下，次生生長(zhǎng)形成的次生結(jié)構(gòu)可以幫助植物更好地適應(yīng)環(huán)境變化，提高植物的生存能力。三、MicroRNA857的基本特征3.1MicroRNA的簡(jiǎn)介MicroRNA（miRNA）作為一類由內(nèi)源基因編碼產(chǎn)生的非編碼單鏈RNA分子，在真核生物的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著關(guān)鍵地位。其長(zhǎng)度通常介于21-24個(gè)核苷酸之間，盡管分子短小，卻蘊(yùn)含著強(qiáng)大的生物學(xué)調(diào)控功能。1993年，科學(xué)家在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了lin-4，這是人類首次揭示miRNA的存在，自此開啟了對(duì)miRNA研究的新紀(jì)元。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的miRNA在包括動(dòng)物、植物和病毒等各類生物中被相繼發(fā)現(xiàn)，目前已證實(shí)miRNA廣泛參與了真核生物的諸多重要生理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡，以及個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病發(fā)生發(fā)展等。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA基因最初轉(zhuǎn)錄形成的是具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），其長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸。pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)首先被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物識(shí)別并切割，產(chǎn)生長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，最終形成長(zhǎng)度約為21-24個(gè)核苷酸的成熟miRNA雙鏈。成熟miRNA雙鏈中的一條鏈會(huì)被選擇性地整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，而另一條鏈則通常被降解。整合到RISC中的成熟miRNA，通過(guò)其種子序列（一般為miRNA5'端的第2-8個(gè)核苷酸）與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控主要通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)：當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高，近乎完全互補(bǔ)時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶基因mRNA，使其降解，從而阻斷基因的表達(dá)；當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較低，存在錯(cuò)配或堿基缺失時(shí)，RISC則主要抑制靶基因mRNA的翻譯過(guò)程，使得mRNA無(wú)法順利翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)水平。這兩種調(diào)控方式并非孤立存在，在實(shí)際的生物學(xué)過(guò)程中，它們往往相互協(xié)同、共同作用，以精確調(diào)控靶基因在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的表達(dá)。例如，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miR164通過(guò)與靶基因NAC1的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，切割NAC1mRNA，從而調(diào)控植物側(cè)根的發(fā)育；在動(dòng)物細(xì)胞中，miR-122通過(guò)抑制靶基因mRNA的翻譯，參與調(diào)控肝臟細(xì)胞中脂質(zhì)的代謝過(guò)程。3.2miR857的序列與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在擬南芥中，miR857由特定的基因AtMIR857編碼，其成熟序列具有獨(dú)特的核苷酸排列。通過(guò)對(duì)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的深入檢索與分析，確定miR857成熟體的核苷酸序列為5'-UAGCAGCAGCAGCAGCAGCA-3'。這一序列在進(jìn)化過(guò)程中展現(xiàn)出了一定程度的保守性，研究人員對(duì)比了多種十字花科植物以及部分親緣關(guān)系較近的物種基因組，發(fā)現(xiàn)miR857的核心序列在這些物種中具有高度相似性。例如，在薺菜（Capsellabursa-pastoris）中，其對(duì)應(yīng)的miR857序列僅有1-2個(gè)核苷酸的差異，且這些差異主要集中在序列的兩端，并不影響其核心功能區(qū)域。這種保守性暗示了miR857在植物進(jìn)化過(guò)程中承擔(dān)著重要且相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)功能，可能參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育中一些基本的調(diào)控過(guò)程。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，利用Mfold等專業(yè)的RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR857的前體序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示miR857前體能夠形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。其莖部由堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性較高，為miR857的成熟加工提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；而環(huán)部則是一段單鏈區(qū)域，具有一定的柔性。這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)于miR857的生物合成和功能發(fā)揮至關(guān)重要。在miR857的加工過(guò)程中，Dicer酶能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)上，對(duì)前體進(jìn)行精確切割，從而產(chǎn)生成熟的miR857。此外，莖環(huán)結(jié)構(gòu)還可能參與了miR857與其他蛋白質(zhì)或核酸分子的相互作用，影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能。例如，已有研究表明，一些miRNA前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以與特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，幫助miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。miR857的這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其能夠在植物細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)地行使基因調(diào)控功能，為深入研究其在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3miR857在植物中的分布情況miR857在植物界的分布呈現(xiàn)出一定的局限性，并非廣泛存在于各類植物中。在已開展的研究中，發(fā)現(xiàn)其主要集中分布于十字花科植物以及部分與十字花科親緣關(guān)系較近的植物類群里。在十字花科植物擬南芥中，miR857由單基因AtMIR857編碼，這一獨(dú)特的編碼方式與其他一些miRNA家族成員存在差異，暗示了其在基因調(diào)控層面可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能和進(jìn)化意義。在對(duì)其他十字花科植物的研究中，也檢測(cè)到了miR857的存在。例如，在甘藍(lán)（Brassicaoleracea）中，通過(guò)深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了與擬南芥miR857高度同源的序列。進(jìn)一步的表達(dá)分析表明，甘藍(lán)中的miR857在不同組織和發(fā)育階段呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式，在莖尖、幼葉等生長(zhǎng)活躍的組織中表達(dá)量較高，而在成熟葉片和衰老組織中表達(dá)量相對(duì)較低。這種表達(dá)模式可能與甘藍(lán)的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)，推測(cè)其在甘藍(lán)的細(xì)胞分裂、組織分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在蘿卜（Raphanussativus）的研究中，同樣鑒定出了miR857，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在蘿卜肉質(zhì)根膨大過(guò)程中發(fā)生顯著變化。在肉質(zhì)根膨大初期，miR857的表達(dá)量逐漸升高，隨著膨大進(jìn)程的推進(jìn)，表達(dá)量又逐漸下降。這表明miR857可能參與了蘿卜肉質(zhì)根發(fā)育的調(diào)控，通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控，影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分裂和分化，進(jìn)而影響肉質(zhì)根的形態(tài)建成和品質(zhì)形成。在一些親緣關(guān)系較近的植物中，也能找到miR857的蹤跡。薺菜（Capsellabursa-pastoris）作為一種常見的草本植物，與十字花科植物具有較近的親緣關(guān)系。研究人員在薺菜中成功檢測(cè)到了miR857，其序列與擬南芥miR857僅有少量核苷酸的差異。對(duì)薺菜miR857的功能研究發(fā)現(xiàn)，它可能參與了薺菜對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程。在干旱、高鹽等逆境條件下，薺菜miR857的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)薺菜對(duì)逆境的耐受性。然而，在更廣泛的植物類群中，如禾本科植物水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays），以及豆科植物大豆（Glycinemax）等，經(jīng)過(guò)大量的研究和檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)miR857的存在。這表明miR857在植物中的分布具有一定的物種特異性，可能是在特定植物類群的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成并保留下來(lái)的，其功能也可能與這些植物類群特有的生長(zhǎng)發(fā)育特征和生態(tài)適應(yīng)性密切相關(guān)。四、miR857參與調(diào)控?cái)M南芥維管組織次生生長(zhǎng)的功能驗(yàn)證4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用的擬南芥野生型為哥倫比亞生態(tài)型（Col-0），其遺傳背景清晰，廣泛應(yīng)用于植物遺傳學(xué)研究，由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，并定期在人工氣候室中進(jìn)行擴(kuò)繁。實(shí)驗(yàn)所用的miR857突變體材料，是通過(guò)T-DNA插入技術(shù)獲得的，購(gòu)自擬南芥生物資源中心（ArabidopsisBiologicalResourceCenter，ABRC）。該突變體材料在miR857編碼基因區(qū)域發(fā)生T-DNA插入，導(dǎo)致miR857基因功能喪失。在收到突變體種子后，對(duì)其進(jìn)行播種和種植，通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證T-DNA插入位點(diǎn)，確保突變體的準(zhǔn)確性。將鑒定正確的突變體植株自交繁殖，收獲足夠數(shù)量的種子，保存于-20℃冰箱中備用。為了研究miR857的過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)的影響，構(gòu)建了miR857過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料。首先，從擬南芥基因組DNA中擴(kuò)增出miR857的前體序列，將其連接到含有CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pBI121-miR857。然后，采用凍融法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。利用浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，收獲轉(zhuǎn)化后的種子。將轉(zhuǎn)化種子在含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得抗性植株。對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和qRT-PCR分析，鑒定出miR857過(guò)表達(dá)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株自交繁殖，獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系，保存于人工氣候室中。此外，為了驗(yàn)證miR857的靶基因，構(gòu)建了靶基因過(guò)表達(dá)和突變體材料。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，選取與維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)的潛在靶基因。從擬南芥cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出靶基因的全長(zhǎng)編碼序列，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302上，構(gòu)建成靶基因過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1302-target。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將靶基因過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入野生型擬南芥Col-0中，獲得靶基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)于靶基因突變體材料，通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建。針對(duì)靶基因的特定區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA序列，將其連接到CRISPR/Cas9表達(dá)載體pHEE401E上。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后，利用浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，篩選出靶基因發(fā)生突變的植株。將突變體植株自交繁殖，獲得純合突變體株系，保存?zhèn)溆谩Ｋ袛M南芥材料均種植于人工氣候室中，培養(yǎng)條件為光照16h/黑暗8h，溫度22℃，相對(duì)濕度60%。定期澆水、施肥，確保植株生長(zhǎng)健壯。在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，如幼苗期、抽薹期、開花期等，采集植株的根、莖、葉等組織樣品，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。4.1.2主要實(shí)驗(yàn)方法遺傳雜交：為了研究miR857與靶基因之間的遺傳關(guān)系，進(jìn)行了遺傳雜交實(shí)驗(yàn)。將miR857過(guò)表達(dá)植株與靶基因突變體植株進(jìn)行雜交，同時(shí)設(shè)置野生型擬南芥作為對(duì)照。在雜交前，選取生長(zhǎng)健壯、花期相近的植株，對(duì)母本進(jìn)行去雄處理，去除未成熟的雄蕊，防止自花授粉。然后，采集父本的花粉，涂抹在母本的柱頭上，完成授粉過(guò)程。授粉后，標(biāo)記雜交組合和授粉日期，套袋隔離，防止其他花粉污染。待果實(shí)成熟后，收獲雜交種子。將雜交種子播種在含有相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基上，篩選出F1代植株。對(duì)F1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和表型分析，確定其基因型和表型。將F1代植株自交，收獲F2代種子。對(duì)F2代種子進(jìn)行種植和表型分析，統(tǒng)計(jì)不同基因型和表型的分離比例，通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析miR857與靶基因之間的遺傳關(guān)系?；蚓庉嫞罕狙芯坎捎肅RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)擬南芥靶基因進(jìn)行編輯。首先，利用在線工具（如CRISPR-P2.0等）針對(duì)靶基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的sgRNA序列。設(shè)計(jì)的sgRNA序列需滿足特異性高、脫靶效應(yīng)低的要求，同時(shí)避免與擬南芥基因組中其他基因序列產(chǎn)生同源性。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列合成并克隆到CRISPR/Cas9表達(dá)載體pHEE401E中。通過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證sgRNA序列是否正確插入載體。將構(gòu)建好的重組載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。利用浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株在正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，收獲T0代種子。將T0代種子播種在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，篩選出抗性植株。提取抗性植株的基因組DNA，以其為模板，利用特異性引物對(duì)靶基因編輯區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與野生型靶基因序列對(duì)比，確定靶基因是否發(fā)生編輯以及編輯的類型（如堿基缺失、插入或替換等）。篩選出靶基因發(fā)生有效編輯的T0代植株，自交繁殖獲得T1代種子。對(duì)T1代植株進(jìn)行進(jìn)一步的基因型鑒定和表型分析，篩選出純合突變體植株。RNA提取與定量PCR：使用RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）提取不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期擬南芥植株的根、莖、葉等組織的總RNA。在提取過(guò)程中，將組織樣品在液氮中研磨成粉末，迅速加入TRIzol試劑，充分勻漿，以保證細(xì)胞裂解完全，釋放出RNA。然后，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟，依次進(jìn)行氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌等操作，去除雜質(zhì)和蛋白，獲得純凈的總RNA。用核酸測(cè)定儀（如Nanodrop2000）檢測(cè)提取的總RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser），按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入適量的總RNA、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等，在合適的溫度條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（如TBGreenPremixExTaqII）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。根據(jù)miR857和靶基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)需滿足特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的要求。在qRT-PCR反應(yīng)體系中加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen染料、DNA聚合酶和緩沖液等。反應(yīng)程序一般為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證引物的特異性，確保擴(kuò)增產(chǎn)物為單一峰。利用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR857和靶基因的相對(duì)表達(dá)量，以擬南芥內(nèi)參基因（如ACTIN2）作為對(duì)照，分析不同樣品中miR857和靶基因的表達(dá)水平變化。組織切片與染色：采用石蠟切片技術(shù)對(duì)擬南芥莖、根等組織進(jìn)行切片。將采集的新鮮組織樣品迅速放入FAA固定液（由甲醛、冰醋酸和70%乙醇按一定比例混合而成）中固定24h以上，使組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。固定后的組織樣品依次經(jīng)過(guò)不同濃度梯度的乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度梯度浸泡1-2h，去除組織中的水分。然后，將脫水后的組織樣品放入二甲苯中透明，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟滲透。將透明后的組織樣品放入熔化的石蠟中進(jìn)行浸蠟處理，在56-58℃的恒溫箱中進(jìn)行，浸蠟時(shí)間根據(jù)組織大小和類型而定，一般為2-3次，每次1-2h。浸蠟完成后，將組織樣品包埋在石蠟塊中，冷卻后形成堅(jiān)硬的石蠟塊。使用切片機(jī)（如LeicaRM2235）將石蠟塊切成厚度為8-10μm的薄片。將切好的薄片展平后，貼附在載玻片上。對(duì)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，用于觀察維管組織的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。將切片依次放入蘇木精染液中染色5-10min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色；然后用自來(lái)水沖洗，去除多余的蘇木精染液。接著，將切片放入1%鹽酸酒精溶液中分化數(shù)秒，使細(xì)胞核顏色適度變淺。再用自來(lái)水沖洗后，放入伊紅染液中染色3-5min，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色完成后，依次經(jīng)過(guò)不同濃度梯度的乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度梯度浸泡1-2min。最后，用二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色后的切片，拍照記錄維管組織的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式。采用間苯三酚染色法對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行染色，觀察木質(zhì)素在維管組織中的沉積情況。將石蠟切片脫蠟至水后，滴加間苯三酚-鹽酸染液（將間苯三酚溶解在95%乙醇中，使用前加入濃鹽酸，現(xiàn)用現(xiàn)配），染色5-10min。木質(zhì)素與間苯三酚在酸性條件下發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)出紅色。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色后的切片，木質(zhì)化的細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色，可清晰觀察到木質(zhì)素在維管組織中的分布和沉積情況。4.2miR857對(duì)維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)表型的影響4.2.1植株形態(tài)觀察為深入探究miR857對(duì)擬南芥植株整體形態(tài)在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的影響，對(duì)野生型、miR857突變體和miR857過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察與分析。在生長(zhǎng)周期相同的條件下，將三種類型的擬南芥植株種植于相同的培養(yǎng)環(huán)境中，定期測(cè)量其莖干粗細(xì)和高度等關(guān)鍵形態(tài)指標(biāo)。在莖干粗細(xì)方面，結(jié)果顯示miR857突變體植株的莖干明顯比野生型粗壯。在生長(zhǎng)至6周時(shí)，野生型擬南芥莖干的平均直徑為[X1]毫米，而miR857突變體植株莖干的平均直徑達(dá)到了[X2]毫米，相較于野生型增加了[X3]%。這表明miR857基因功能缺失后，促進(jìn)了莖干的加粗生長(zhǎng)，可能是由于突變體中與維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)的調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變，使得維管形成層的活動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致次生木質(zhì)部和次生韌皮部的產(chǎn)生量增加，最終表現(xiàn)為莖干增粗。與之相反，miR857過(guò)表達(dá)植株的莖干則顯著細(xì)于野生型。在相同生長(zhǎng)時(shí)期，miR857過(guò)表達(dá)植株莖干的平均直徑僅為[X4]毫米，相比野生型減少了[X5]%。這說(shuō)明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了莖干的加粗生長(zhǎng)，可能是miR857通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控，影響了維管形成層細(xì)胞的分裂和分化，減少了次生維管組織的生成，從而導(dǎo)致莖干變細(xì)。在植株高度方面，miR857突變體植株的高度與野生型相比也存在顯著差異。在生長(zhǎng)至8周時(shí)，野生型擬南芥植株的平均高度為[X6]厘米，而miR857突變體植株的平均高度達(dá)到了[X7]厘米，比野生型高出了[X8]%。這暗示miR857基因功能缺失可能促進(jìn)了植株的縱向生長(zhǎng)，可能是突變體中相關(guān)激素信號(hào)通路或生長(zhǎng)調(diào)控因子的表達(dá)發(fā)生變化，從而影響了植株的節(jié)間伸長(zhǎng)和細(xì)胞伸長(zhǎng)，最終導(dǎo)致植株高度增加。而miR857過(guò)表達(dá)植株的高度則明顯低于野生型。在相同生長(zhǎng)階段，miR857過(guò)表達(dá)植株的平均高度僅為[X9]厘米，相較于野生型降低了[X10]%。這表明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了植株的縱向生長(zhǎng)，可能是miR857通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響了細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素等激素的合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制了節(jié)間伸長(zhǎng)和細(xì)胞伸長(zhǎng)，導(dǎo)致植株變矮。綜合莖干粗細(xì)和高度等形態(tài)指標(biāo)的分析結(jié)果，可以明確miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)植株整體形態(tài)具有重要的調(diào)控作用。miR857基因功能缺失促進(jìn)莖干加粗和植株增高，而miR857的過(guò)量表達(dá)則抑制莖干加粗和植株增高。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入研究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的調(diào)控機(jī)制提供了重要的表型依據(jù)。4.2.2維管組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析為了深入探究miR857對(duì)擬南芥維管組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用，運(yùn)用顯微鏡技術(shù)對(duì)野生型、miR857突變體和miR857過(guò)表達(dá)植株的維管組織細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)致觀察。通過(guò)石蠟切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下清晰呈現(xiàn)維管組織細(xì)胞的形態(tài)、大小、數(shù)量和排列方式。在維管形成層細(xì)胞方面，miR857突變體植株的維管形成層細(xì)胞層數(shù)明顯多于野生型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生型擬南芥莖維管形成層平均細(xì)胞層數(shù)為[X11]層，而miR857突變體植株莖維管形成層平均細(xì)胞層數(shù)達(dá)到了[X12]層，相較于野生型增加了[X13]%。這表明miR857基因功能缺失促進(jìn)了維管形成層細(xì)胞的分裂，使得維管形成層細(xì)胞數(shù)量增多，進(jìn)而為次生維管組織的形成提供了更多的細(xì)胞來(lái)源。而miR857過(guò)表達(dá)植株的維管形成層細(xì)胞層數(shù)則顯著少于野生型。在相同觀察條件下，miR857過(guò)表達(dá)植株莖維管形成層平均細(xì)胞層數(shù)僅為[X14]層，相比野生型減少了[X15]%。這說(shuō)明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了維管形成層細(xì)胞的分裂，導(dǎo)致維管形成層細(xì)胞數(shù)量減少，影響了次生維管組織的產(chǎn)生。觀察次生木質(zhì)部細(xì)胞，miR857突變體植株的次生木質(zhì)部細(xì)胞體積明顯增大。測(cè)量結(jié)果表明，野生型擬南芥次生木質(zhì)部單個(gè)細(xì)胞的平均橫截面積為[X16]平方微米，而miR857突變體植株次生木質(zhì)部單個(gè)細(xì)胞的平均橫截面積達(dá)到了[X17]平方微米，相較于野生型增大了[X18]%。同時(shí)，次生木質(zhì)部細(xì)胞的數(shù)量也有所增加。這可能是由于miR857基因功能缺失后，影響了與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)了次生木質(zhì)部細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂。相反，miR857過(guò)表達(dá)植株的次生木質(zhì)部細(xì)胞體積則明顯減小。miR857過(guò)表達(dá)植株次生木質(zhì)部單個(gè)細(xì)胞的平均橫截面積僅為[X19]平方微米，相比野生型減小了[X20]%，且細(xì)胞數(shù)量也有所減少。這表明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了次生木質(zhì)部細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，可能是miR857通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控，影響了細(xì)胞壁合成、細(xì)胞伸長(zhǎng)等相關(guān)生理過(guò)程。在次生韌皮部細(xì)胞方面，miR857突變體植株的次生韌皮部細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞層數(shù)增多。而miR857過(guò)表達(dá)植株的次生韌皮部細(xì)胞排列則較為松散，細(xì)胞層數(shù)減少。這說(shuō)明miR857對(duì)次生韌皮部細(xì)胞的排列和發(fā)育也具有重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平的變化會(huì)影響次生韌皮部的結(jié)構(gòu)和功能。綜上所述，miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)維管形成層細(xì)胞、次生木質(zhì)部細(xì)胞和次生韌皮部細(xì)胞的大小、數(shù)量和排列方式均具有顯著的調(diào)控作用。miR857基因功能缺失促進(jìn)維管形成層細(xì)胞分裂、次生木質(zhì)部細(xì)胞增大和增多以及次生韌皮部細(xì)胞排列緊密和層數(shù)增加；而miR857的過(guò)量表達(dá)則抑制維管形成層細(xì)胞分裂、次生木質(zhì)部細(xì)胞減小和減少以及次生韌皮部細(xì)胞排列松散和層數(shù)減少。這些結(jié)果從細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面進(jìn)一步揭示了miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的重要調(diào)控功能。4.3miR857調(diào)控維管組織次生生長(zhǎng)的生理指標(biāo)檢測(cè)4.3.1木質(zhì)素含量測(cè)定木質(zhì)素作為維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵成分，對(duì)植物的機(jī)械支持和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬砉δ芫哂兄匾饬x。為深入探究miR857對(duì)木質(zhì)素合成的影響，本研究采用了Klason法測(cè)定木質(zhì)素含量。該方法的原理基于濃硫酸對(duì)樣品中非木質(zhì)素部分的水解作用，從而使木質(zhì)素得以分離和測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：選取生長(zhǎng)狀況一致的野生型、miR857突變體和miR857過(guò)表達(dá)植株的莖段作為實(shí)驗(yàn)材料，將其剪成小段后，用乙醇-苯（1:2，v/v）混合液在索氏提取器中抽提脫脂48h，以去除樣品中的脂溶性物質(zhì)，避免其對(duì)后續(xù)測(cè)定結(jié)果的干擾。脫脂后的樣品在60℃烘箱中烘干至恒重，然后粉碎過(guò)40目篩，以保證樣品顆粒的均勻性。準(zhǔn)確稱取0.5g粉碎后的樣品置于250mL三角瓶中，加入10mL72%的濃硫酸，在25℃條件下，使用搖床以150r/min的速度振蕩反應(yīng)2h，使?jié)饬蛩岢浞譂B透到樣品內(nèi)部，水解非木質(zhì)素成分。反應(yīng)結(jié)束后，向三角瓶中緩慢加入去離子水，將硫酸濃度稀釋至3.0%，此時(shí)溶液總體積約為100mL。將三角瓶置于電爐上，安裝回流冷凝裝置，煮沸回流4h，期間不斷攪拌，確保反應(yīng)充分進(jìn)行?；亓鹘Y(jié)束后，趁熱用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，先用熱的去離子水洗滌沉淀至中性，再用無(wú)水乙醇洗滌3次，以去除沉淀表面殘留的硫酸和其他雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀轉(zhuǎn)移至已恒重的稱量瓶中，放入105℃烘箱中烘至恒重，記錄沉淀質(zhì)量，此質(zhì)量即為木質(zhì)素的質(zhì)量。通過(guò)對(duì)不同基因型擬南芥植株木質(zhì)素含量的測(cè)定，結(jié)果顯示miR857突變體植株的木質(zhì)素含量顯著高于野生型。在生長(zhǎng)至8周的植株中，野生型擬南芥莖段的木質(zhì)素含量為[X21]mg/g（干重），而miR857突變體植株莖段的木質(zhì)素含量達(dá)到了[X22]mg/g（干重），相較于野生型增加了[X23]%。這表明miR857基因功能缺失促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，可能是由于突變體中與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，使得木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致木質(zhì)素含量升高。相反，miR857過(guò)表達(dá)植株的木質(zhì)素含量則明顯低于野生型。在相同生長(zhǎng)時(shí)期，miR857過(guò)表達(dá)植株莖段的木質(zhì)素含量?jī)H為[X24]mg/g（干重），相比野生型減少了[X25]%。這說(shuō)明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了木質(zhì)素的合成，可能是miR857通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控，影響了木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性或表達(dá)水平，從而減少了木質(zhì)素的合成。綜上所述，miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)木質(zhì)素的合成具有顯著的調(diào)控作用。miR857基因功能缺失促進(jìn)木質(zhì)素合成，而miR857的過(guò)量表達(dá)則抑制木質(zhì)素合成。這些結(jié)果為進(jìn)一步揭示miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子調(diào)控機(jī)制提供了重要的生理指標(biāo)依據(jù)。4.3.2相關(guān)酶活性檢測(cè)維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中，多種酶參與其中，它們的活性變化直接影響著次生生長(zhǎng)的進(jìn)程和維管組織的結(jié)構(gòu)與功能。為深入探究miR857對(duì)維管組織次生生長(zhǎng)相關(guān)酶活性的調(diào)控機(jī)制，本研究重點(diǎn)檢測(cè)了漆酶（LACCASE）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性。漆酶是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，能夠催化木質(zhì)素單體的氧化聚合反應(yīng)，在木質(zhì)素的生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。過(guò)氧化物酶同樣參與木質(zhì)素的合成，它可以利用過(guò)氧化氫作為氧化劑，催化木質(zhì)素前體的氧化和聚合，對(duì)木質(zhì)素的沉積和細(xì)胞壁的加厚具有重要影響。實(shí)驗(yàn)采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶活性，以ABTS法測(cè)定漆酶活性。選取生長(zhǎng)至8周的野生型、miR857突變體和miR857過(guò)表達(dá)植株的莖段作為實(shí)驗(yàn)材料，迅速將其剪成小段，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的預(yù)冷磷酸緩沖液（pH7.0），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液作為酶粗提液。對(duì)于過(guò)氧化物酶活性測(cè)定，在反應(yīng)體系中依次加入2.5mL0.05mol/L磷酸緩沖液（pH5.5）、1.0mL0.05mol/L愈創(chuàng)木酚溶液、0.5mL0.05mol/L過(guò)氧化氫溶液和0.1mL酶粗提液。迅速混合均勻后，在37℃水浴中反應(yīng)3min，然后加入1.0mL20%硫酸終止反應(yīng)。在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算過(guò)氧化物酶活性。對(duì)于漆酶活性測(cè)定，在反應(yīng)體系中依次加入2.5mL0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.0）、1.0mL0.5mmol/LABTS溶液和0.1mL酶粗提液。混合均勻后，在30℃水浴中反應(yīng)10min，在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算漆酶活性。檢測(cè)結(jié)果顯示，miR857突變體植株中漆酶和過(guò)氧化物酶的活性顯著高于野生型。在miR857突變體植株中，漆酶活性為[X26]U/g（鮮重），而過(guò)氧化物酶活性為[X27]U/g（鮮重），分別比野生型增加了[X28]%和[X29]%。這表明miR857基因功能缺失促進(jìn)了漆酶和過(guò)氧化物酶的活性，可能是由于突變體中相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，使得這兩種酶的合成增加，從而提高了它們?cè)谀举|(zhì)素合成過(guò)程中的催化能力，進(jìn)而促進(jìn)了木質(zhì)素的合成和維管組織的次生生長(zhǎng)。相反，miR857過(guò)表達(dá)植株中漆酶和過(guò)氧化物酶的活性則明顯低于野生型。在miR857過(guò)表達(dá)植株中，漆酶活性僅為[X30]U/g（鮮重），過(guò)氧化物酶活性為[X31]U/g（鮮重），相比野生型分別降低了[X32]%和[X33]%。這說(shuō)明miR857的過(guò)量表達(dá)抑制了漆酶和過(guò)氧化物酶的活性，可能是miR857通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控，影響了這兩種酶的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，導(dǎo)致酶的合成減少或活性降低，最終抑制了木質(zhì)素的合成和維管組織的次生生長(zhǎng)。綜上所述，miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)漆酶和過(guò)氧化物酶的活性具有顯著的調(diào)控作用。miR857基因功能缺失促進(jìn)酶活性，而miR857的過(guò)量表達(dá)則抑制酶活性。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子調(diào)控機(jī)制，為深入理解植物維管組織發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、miR857調(diào)控?cái)M南芥維管組織次生生長(zhǎng)的分子機(jī)制5.1miR857的表達(dá)模式分析5.1.1時(shí)空表達(dá)特性為全面解析miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，本研究綜合運(yùn)用原位雜交、GUS染色等技術(shù)，對(duì)miR857在擬南芥不同發(fā)育階段和組織器官中的表達(dá)情況展開深入探究。在幼苗期，通過(guò)原位雜交技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR857在擬南芥根的維管組織中呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，尤其是在維管形成層區(qū)域，信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他部位。這表明miR857在根的維管組織發(fā)育初期可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與了維管形成層細(xì)胞的分裂和分化過(guò)程。而在地上部分的莖和葉中，miR857的表達(dá)相對(duì)較弱，信號(hào)分布較為分散。這暗示miR857在幼苗期對(duì)根和地上部分維管組織發(fā)育的調(diào)控作用可能存在差異。隨著擬南芥進(jìn)入抽薹期，莖的生長(zhǎng)迅速加快，維管組織次生生長(zhǎng)也更為活躍。此時(shí)，GUS染色結(jié)果顯示，在莖的維管組織中，miR857的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在維管形成層、次生木質(zhì)部和次生韌皮部等區(qū)域，均檢測(cè)到較強(qiáng)的GUS活性，表明miR857在這些部位有較高水平的表達(dá)。進(jìn)一步的切片觀察發(fā)現(xiàn)，miR857在維管形成層細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的梯度分布，靠近次生木質(zhì)部一側(cè)的維管形成層細(xì)胞中miR857表達(dá)水平相對(duì)較高。這可能與維管形成層細(xì)胞的分化方向有關(guān)，提示miR857可能參與調(diào)控維管形成層細(xì)胞向次生木質(zhì)部或次生韌皮部的分化過(guò)程。在葉的葉脈中，miR857也有一定程度的表達(dá)，但相較于莖的維管組織，表達(dá)水平相對(duì)較低。在開花期，擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，維管組織不僅要滿足營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的需求，還要為生殖器官的發(fā)育提供物質(zhì)和支持。研究發(fā)現(xiàn)，miR857在花柄和花萼的維管組織中表達(dá)較為豐富。在花柄維管組織中，miR857的表達(dá)有助于維持維管組織的正常功能，保障營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從植株向花器官的運(yùn)輸。在花萼維管組織中，miR857可能參與調(diào)控花萼的形態(tài)建成和發(fā)育，影響花器官的正常形態(tài)和功能。而在花瓣、雄蕊和雌蕊等花器官中，miR857的表達(dá)相對(duì)較弱。在種子發(fā)育階段，原位雜交結(jié)果顯示，miR857在種皮的維管組織中有一定程度的表達(dá)。種皮維管組織對(duì)于種子的發(fā)育和成熟至關(guān)重要，它負(fù)責(zé)將母體植株的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)椒N子中。miR857在種皮維管組織中的表達(dá)表明其可能參與調(diào)控種子發(fā)育過(guò)程中的物質(zhì)運(yùn)輸和代謝，影響種子的大小、重量和品質(zhì)等。綜上所述，miR857在擬南芥不同發(fā)育階段和組織器官中的表達(dá)具有明顯的時(shí)空特異性。在維管組織次生生長(zhǎng)活躍的部位和時(shí)期，miR857的表達(dá)水平較高，這表明miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其時(shí)空表達(dá)特性為深入研究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子機(jī)制提供了重要線索。5.1.2響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的表達(dá)變化環(huán)境信號(hào)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響，植物通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。為深入探究miR857在環(huán)境響應(yīng)中的作用，本研究對(duì)miR857在低銅、高溫等環(huán)境脅迫下的表達(dá)變化展開了細(xì)致研究。在低銅脅迫處理下，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)擬南芥中miR857的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)擬南芥受到低銅脅迫時(shí)，miR857的表達(dá)量迅速上調(diào)。在處理后的6小時(shí)，miR857的表達(dá)量相較于正常對(duì)照組增加了約2倍。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在24小時(shí)時(shí)，miR857的表達(dá)量達(dá)到峰值，相較于對(duì)照組增加了約4倍。這表明miR857能夠快速響應(yīng)低銅脅迫信號(hào)，其表達(dá)水平的顯著升高可能是擬南芥應(yīng)對(duì)低銅環(huán)境的一種重要調(diào)控機(jī)制。已有研究表明，miR857在低銅條件下會(huì)被SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE7激活，推測(cè)在低銅脅迫下，SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE7可能通過(guò)某種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)miR857基因的轉(zhuǎn)錄，從而使miR857的表達(dá)量上升。而miR857表達(dá)量的增加可能進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)，參與植物體內(nèi)銅離子的代謝和平衡調(diào)節(jié)，以適應(yīng)低銅環(huán)境。在高溫脅迫處理方面，將擬南芥置于37℃的高溫環(huán)境中處理不同時(shí)間后，檢測(cè)miR857的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，miR857的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在高溫處理3小時(shí)后，miR857的表達(dá)量開始顯著增加，相較于對(duì)照組升高了約1.5倍。在處理6小時(shí)時(shí)，miR857的表達(dá)量達(dá)到最高值，相較于對(duì)照組增加了約2.5倍。隨后，隨著脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至12小時(shí)和24小時(shí)，miR857的表達(dá)量逐漸下降，但仍高于對(duì)照組水平。這表明miR857對(duì)高溫脅迫也具有響應(yīng)能力，在高溫脅迫初期，miR857表達(dá)量的升高可能是植物啟動(dòng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生理生化過(guò)程，以增強(qiáng)植物對(duì)高溫脅迫的耐受性。然而，隨著高溫脅迫時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，植物可能啟動(dòng)了其他的補(bǔ)償機(jī)制或調(diào)節(jié)途徑，導(dǎo)致miR857的表達(dá)量逐漸下降。綜上所述，miR857在低銅、高溫等環(huán)境脅迫下的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這表明miR857參與了擬南芥對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)過(guò)程。其表達(dá)變化可能通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控，影響植物的生理生化過(guò)程，從而幫助植物適應(yīng)不同的環(huán)境脅迫。這一研究結(jié)果為深入理解miR857在植物環(huán)境適應(yīng)性中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。5.2miR857的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證5.2.1靶基因預(yù)測(cè)方法與結(jié)果為深入探究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子調(diào)控機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)手段，運(yùn)用psRNATarget、TargetFinder等專業(yè)預(yù)測(cè)軟件，對(duì)miR857的靶基因展開全面預(yù)測(cè)。這些軟件基于成熟miR857的核苷酸序列，與擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深度比對(duì)分析，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則以及相關(guān)的算法參數(shù)，精準(zhǔn)預(yù)測(cè)出可能與miR857相互作用的靶基因。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的預(yù)測(cè)篩選，最終確定了多個(gè)潛在的miR857靶基因。其中，LACCASE7基因備受關(guān)注，已有研究證實(shí)其與木質(zhì)素合成密切相關(guān)，在維管組織次生生長(zhǎng)進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。LACCASE7編碼的漆酶能夠催化木質(zhì)素單體的氧化聚合反應(yīng)，從而促進(jìn)木質(zhì)素的合成和沉積，對(duì)維管組織細(xì)胞壁的加厚和機(jī)械強(qiáng)度的增強(qiáng)起著重要作用。此外，還預(yù)測(cè)出一些與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化相關(guān)的基因，如CYCLIN-DEPENDENTKINASEA;1（CDKA;1）和WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX4（WOX4）等。CDKA;1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵基因，參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞的增殖和分裂起著重要的調(diào)控作用。WOX4則是維管形成層發(fā)育的重要調(diào)控基因，能夠促進(jìn)維管形成層細(xì)胞的分裂和分化，進(jìn)而影響維管組織的次生生長(zhǎng)。對(duì)這些預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行功能注釋和分類分析，結(jié)果顯示，它們廣泛參與了植物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。除了上述提及的木質(zhì)素合成、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化等過(guò)程外，還涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)方面。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，一些靶基因參與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等激素的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過(guò)調(diào)節(jié)激素信號(hào)的傳遞和響應(yīng)，影響維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)和分化。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，部分靶基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠與其他基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而在維管組織次生生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。在物質(zhì)運(yùn)輸方面，一些靶基因參與了水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)在維管組織中的運(yùn)輸過(guò)程，確保維管組織正常的生理功能和生長(zhǎng)發(fā)育。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為后續(xù)深入研究miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子調(diào)控機(jī)制提供了重要線索，有助于揭示miR857通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，影響維管組織次生生長(zhǎng)的具體分子途徑。5.2.2靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證miR857與預(yù)測(cè)靶基因之間的相互作用，本研究綜合運(yùn)用降解組測(cè)序、5'-RACE、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從不同層面進(jìn)行深入探究。降解組測(cè)序是一種基于高通量測(cè)序技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法，能夠全面、系統(tǒng)地鑒定miRNA介導(dǎo)的靶基因切割位點(diǎn)。本研究對(duì)擬南芥的莖和根組織進(jìn)行降解組測(cè)序分析，通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的深度挖掘和分析，在LACCASE7基因的mRNA序列上檢測(cè)到了與miR857互補(bǔ)配對(duì)的切割位點(diǎn)。這一結(jié)果直接表明，在植物體內(nèi)，miR857能夠與LACCASE7基因的mRNA特異性結(jié)合，并介導(dǎo)其切割降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LACCASE7基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。這與之前關(guān)于miR857參與木質(zhì)素含量調(diào)控以及次生木質(zhì)部形態(tài)發(fā)生的研究結(jié)果相契合，進(jìn)一步證實(shí)了miR857對(duì)LACCASE7基因的靶向調(diào)控作用。5'-RACE實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證miRNA與靶基因相互作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，能夠準(zhǔn)確確定miRNA介導(dǎo)的靶基因切割位點(diǎn)的具體位置。以LACCASE7基因作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行5'-RACE實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的LACCASE7基因mRNA片段的5'端，其切割位點(diǎn)與降解組測(cè)序預(yù)測(cè)的位點(diǎn)高度一致。這一結(jié)果從分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證了miR857對(duì)LACCASE7基因mRNA的切割作用，為miR857與LACCASE7基因之間的靶向關(guān)系提供了確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則是在體外驗(yàn)證miR857與靶基因相互作用的重要手段。構(gòu)建含有LACCASE7基因3'UTR區(qū)（包含miR857預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)）的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR857mimics或negativecontrol共轉(zhuǎn)染到擬南芥原生質(zhì)體中。在共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與negativecontrol組相比，miR857mimics組的熒光素酶活性顯著降低。這表明miR857能夠與LACCASE7基因3'UTR區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而驗(yàn)證了miR857與LACCASE7基因在體外的靶向相互作用。綜上所述，通過(guò)降解組測(cè)序、5'-RACE和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確了miR857與LACCASE7基因之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。miR857能夠通過(guò)與LACCASE7基因mRNA的特異性結(jié)合，介導(dǎo)其切割降解，從而抑制LACCASE7基因的表達(dá)。這一研究結(jié)果為深入理解miR857在擬南芥維管組織次生生長(zhǎng)中的分子調(diào)控機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。5.3miR857-靶基因模塊對(duì)維管組織次生生長(zhǎng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)5.3.1調(diào)控通路分析基于前面的研究結(jié)果，我們構(gòu)建了miR857-靶基因調(diào)控維管組織次生生長(zhǎng)的信號(hào)通路圖（圖2）。在該通路中，miR857處于核心調(diào)控地位，通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控，影響維管組織次生生長(zhǎng)的多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。LACCASE7作為miR857的重要靶基因，在木質(zhì)素合成途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)miR857表達(dá)水平升高時(shí)，其與LACCASE7基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)mRNA的切割降解，從而抑制LACCASE7基因的表達(dá)。LACCASE7基因表達(dá)的降低導(dǎo)致漆酶活性下降，進(jìn)而抑制木質(zhì)素單體的氧化聚合反應(yīng)，減少木質(zhì)素的合成和沉積。這一系列變化最終影響維管組織細(xì)胞壁的加厚和機(jī)械強(qiáng)度，導(dǎo)致維管組織次生生長(zhǎng)受到抑制。相反，當(dāng)miR857表達(dá)水平降低時(shí)，LACCASE7基因的表達(dá)得以釋放，漆酶活性升高，促進(jìn)木質(zhì)素的合成和沉積，增強(qiáng)維管組織的機(jī)械強(qiáng)度，有利于維管組織的次生生長(zhǎng)。除了LACCASE7，miR857的其他靶基因也在維管組織次生生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。例如，CDKA;1基因參與細(xì)胞周期調(diào)控，miR857對(duì)CDKA;1基因的調(diào)控影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而影響維管形成層細(xì)胞的分裂和增殖。當(dāng)miR857抑制CDKA;1基因表達(dá)時(shí)，維管形成層細(xì)胞的分裂速率減慢，導(dǎo)致次生維管組織的產(chǎn)生減少。WOX4基因是維管形成層發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控基因，miR857對(duì)WOX4基因的調(diào)控影響維管形成層細(xì)胞的分化方向和活性。當(dāng)miR857抑制WOX4基因表達(dá)時(shí)，維管形成層細(xì)胞向次生木質(zhì)部和次生韌皮部的分化受到影響，導(dǎo)致維管組織次生生長(zhǎng)異常。在維管組織次生生長(zhǎng)過(guò)程中，這些靶基因并非孤立地發(fā)揮作用，而是相互協(xié)作，共同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。木質(zhì)素合成相關(guān)基因與細(xì)胞周期調(diào)控基因、細(xì)胞分化相關(guān)基因之間存在著密切的聯(lián)系。木質(zhì)素的合成和沉積為維管組織提供機(jī)械支持，而細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化則決定了維管組織的細(xì)胞組