三碘甲狀腺原氨酸：缺血再灌注損傷下未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)密碼一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一。缺血再灌注損傷（IRI）作為心肌梗死、心臟手術(shù)等多種心血管疾病的關(guān)鍵病理生理過(guò)程，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和壽命。IRI指在恢復(fù)某些組織器官的血液灌注及氧供后，反而會(huì)加重組織損傷的現(xiàn)象，這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)心肌細(xì)胞死亡和心功能損害。心肌細(xì)胞凋亡是IRI過(guò)程中心肌損傷的重要機(jī)制之一，過(guò)多的心肌細(xì)胞凋亡會(huì)顯著削弱心臟的收縮和舒張功能，引發(fā)心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。未成熟心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與成熟心肌細(xì)胞存在顯著差異，其對(duì)缺血再灌注損傷的反應(yīng)和凋亡機(jī)制也具有獨(dú)特性。研究未成熟心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于理解心臟發(fā)育過(guò)程中的生理和病理變化，以及小兒心血管疾病的防治具有重要意義。在先天性心臟病手術(shù)中，未成熟心肌面臨缺血再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)，深入了解其凋亡機(jī)制和保護(hù)措施，對(duì)于提高手術(shù)成功率和患兒術(shù)后生活質(zhì)量至關(guān)重要。目前，雖然針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的治療取得了一定進(jìn)展，但仍缺乏特效的治療手段。因此，深入探究缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制以及有效的治療方法，成為心血管疾病防治領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。三碘甲狀腺原氨酸（T3）作為一種甲狀腺激素，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和心功能具有保護(hù)作用。T3可通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)心臟代謝和減少心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制，對(duì)缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。其能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝，提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性；還能抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡。在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予T3預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的凋亡明顯減少，心功能得到顯著改善。然而，T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及具體機(jī)制尚未完全明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。本研究旨在探究T3對(duì)缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用和機(jī)制，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平全面深入地研究T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在機(jī)制，為心血管疾病的治療提供新的思路和方法。這不僅有助于拓展對(duì)心肌細(xì)胞凋亡途徑的研究深度，完善心血管疾病的發(fā)病機(jī)制理論，還可能為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供新的治療靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究三碘甲狀腺原氨酸（T3）對(duì)缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及具體機(jī)制。通過(guò)建立未成熟心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型和小鼠心肌缺血再灌注模型，從細(xì)胞和動(dòng)物整體水平，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，系統(tǒng)研究T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響，為心血管疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。本研究具有多方面的創(chuàng)新之處。在研究角度上，首次聚焦于未成熟心肌細(xì)胞，未成熟心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與成熟心肌細(xì)胞存在顯著差異，對(duì)缺血再灌注損傷的反應(yīng)也不盡相同，本研究填補(bǔ)了T3在該領(lǐng)域保護(hù)作用研究的相對(duì)空白，有助于更全面地理解心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制以及T3的作用效果。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，從細(xì)胞和整體動(dòng)物兩個(gè)層面深入探究T3的保護(hù)作用，使得研究結(jié)果更具說(shuō)服力和臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。通過(guò)設(shè)置不同濃度的T3處理組，能夠更精準(zhǔn)地分析T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響，為臨床應(yīng)用中T3的劑量選擇提供參考依據(jù)。在機(jī)制探索方面，綜合運(yùn)用Westernblot、RT-PCR等技術(shù)，從分子水平深入研究T3對(duì)JNK、Bcl-2、cleavedcaspase-3、PARP等關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，全面解析T3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)作用，有望揭示T3發(fā)揮保護(hù)作用的全新分子機(jī)制，為心血管疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1缺血再灌注損傷的研究現(xiàn)狀缺血再灌注損傷（IRI）是心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程和防治策略進(jìn)行了廣泛而深入的研究。大量研究表明，IRI的發(fā)生涉及多個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、細(xì)胞凋亡等。在氧化應(yīng)激方面，再灌注過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等，這些ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。炎癥反應(yīng)在IRI中也起著關(guān)鍵作用，缺血再灌注會(huì)激活炎癥細(xì)胞，釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重組織損傷。鈣超載是IRI的另一個(gè)重要機(jī)制，缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度急劇升高，激活一系列鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶，導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡。在防治策略方面，目前臨床上主要采用藥物治療、缺血預(yù)處理、介入治療等方法來(lái)減輕IRI。藥物治療方面，常用的藥物包括抗氧化劑、抗炎藥物、鈣通道阻滯劑等。例如，維生素C、維生素E等抗氧化劑可以清除ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷；他汀類(lèi)藥物不僅具有降脂作用，還能通過(guò)抗炎、抗氧化等機(jī)制減輕IRI。缺血預(yù)處理是一種通過(guò)短暫的缺血刺激使組織對(duì)后續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間的缺血再灌注損傷產(chǎn)生耐受性的方法，其機(jī)制可能與激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)等有關(guān)。介入治療如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（PCI）可以快速開(kāi)通阻塞的血管，恢復(fù)心肌的血液灌注，但在一定程度上也會(huì)引發(fā)IRI，因此如何在介入治療過(guò)程中減輕IRI是目前研究的重點(diǎn)之一。盡管在IRI的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題亟待解決。目前對(duì)于IRI的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，各病理生理過(guò)程之間的相互關(guān)系和調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。現(xiàn)有的防治策略雖然在一定程度上能夠減輕IRI，但效果仍不理想，需要尋找更加有效的治療方法和藥物。1.3.2心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究現(xiàn)狀心肌細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到多種基因和信號(hào)通路調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，在心肌缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)外眾多研究圍繞心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)其主要涉及死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路等。死亡受體通路中，F(xiàn)as、TNF受體等死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可招募接頭蛋白，激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體通路是心肌細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在心肌細(xì)胞凋亡中也扮演著重要角色，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時(shí)，會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），如果UPR持續(xù)激活，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在心肌細(xì)胞凋亡的線粒體通路中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。其中，Bcl-2和Bcl-xL等具有抗凋亡作用，它們可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而B(niǎo)ax、Bak等則具有促凋亡作用，它們可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，加速細(xì)胞凋亡。caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，caspase-3是凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其激活后可以切割多種細(xì)胞內(nèi)的底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，p53、JNK等信號(hào)分子也參與了心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。p53可以通過(guò)上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；JNK則可以通過(guò)磷酸化Bcl-2家族蛋白等方式，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。雖然對(duì)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究取得了一定的成果，但仍有許多未知領(lǐng)域。不同凋亡通路之間的相互作用和協(xié)調(diào)機(jī)制尚不完全清楚，如何精準(zhǔn)地調(diào)控這些通路以減少心肌細(xì)胞凋亡，仍需要進(jìn)一步探索。1.3.3T3對(duì)心肌保護(hù)作用的研究現(xiàn)狀三碘甲狀腺原氨酸（T3）作為一種重要的甲狀腺激素，在心血管系統(tǒng)中具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其對(duì)心肌的保護(hù)作用逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究表明，T3可以通過(guò)多種機(jī)制對(duì)缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。在能量代謝方面，T3能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝，增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖和脂肪酸的攝取和利用，提高心肌細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備，增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面，T3可以激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活。在炎癥反應(yīng)方面，T3能夠抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予T3預(yù)處理可以顯著減少心肌梗死面積，改善心功能。有研究將小鼠分為假手術(shù)組、手術(shù)組和手術(shù)+T3組，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支方法誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性心肌梗死，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與手術(shù)組相比，手術(shù)+T3組左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率明顯升高，左室收縮末期內(nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑明顯降低，心肌組織中炎癥因子水平和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降，表明T3對(duì)梗死后心肌具有保護(hù)作用。在臨床研究中，也有部分研究報(bào)道了T3在心肌缺血再灌注損傷患者中的應(yīng)用效果。一些小規(guī)模的臨床試驗(yàn)表明，在心臟手術(shù)中給予患者T3治療，可以改善患者的心臟功能，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。然而，目前關(guān)于T3對(duì)心肌保護(hù)作用的研究仍存在一些局限性。大部分研究集中在成熟心肌細(xì)胞，對(duì)于T3在未成熟心肌細(xì)胞中的保護(hù)作用及機(jī)制研究較少。不同研究中T3的使用劑量、給藥時(shí)間和方式等存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果之間難以進(jìn)行比較和整合。T3發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步深入研究。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1缺血再灌注損傷2.1.1概念及發(fā)生機(jī)制缺血再灌注損傷是指組織器官在經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，恢復(fù)血液灌注及氧供時(shí)，反而出現(xiàn)比缺血期更嚴(yán)重的損傷現(xiàn)象。這種損傷在多種臨床情況下均可發(fā)生，如心肌梗死、腦梗死、器官移植、心臟手術(shù)等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和康復(fù)。其發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，主要包括鈣超載與能量代謝障礙、氧自由基增多、心肌炎癥反應(yīng)等。鈣超載與能量代謝障礙在缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用。心肌缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP含量迅速減少，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的鈉鉀泵功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈉離子無(wú)法正常排出，進(jìn)而通過(guò)鈉鈣交換機(jī)制使細(xì)胞內(nèi)鈣離子大量?jī)?nèi)流，引發(fā)鈣超載。鈣超載會(huì)激活多種鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶，導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、線粒體功能障礙、心肌收縮功能異常以及細(xì)胞凋亡。缺血還會(huì)引起能量代謝異常，葡萄糖有氧氧化受阻，無(wú)氧酵解增強(qiáng)，導(dǎo)致乳酸堆積，細(xì)胞內(nèi)酸中毒，進(jìn)一步加重鈣超載和細(xì)胞損傷。氧自由基增多也是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基可被抗氧化酶系統(tǒng)及時(shí)清除，維持動(dòng)態(tài)平衡。然而，當(dāng)心肌缺血時(shí)，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，使氧分子接受單電子還原生成超氧陰離子等氧自由基。再灌注時(shí)，大量的氧氣進(jìn)入組織，為氧自由基的產(chǎn)生提供了充足的底物，同時(shí)激活了黃嘌呤氧化酶等酶系統(tǒng)，進(jìn)一步促進(jìn)氧自由基的生成。氧自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，可攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能；還能氧化蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)異常和基因損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。心肌炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中也扮演著重要角色。缺血再灌注過(guò)程會(huì)激活炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，使其聚集并浸潤(rùn)到缺血心肌組織中。這些炎癥細(xì)胞會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大；IL-1和IL-6能吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，導(dǎo)致心肌組織的損傷進(jìn)一步加重。炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起微循環(huán)障礙，影響心肌組織的血液灌注和氧供，加劇缺血再灌注損傷。2.1.2對(duì)心肌細(xì)胞的影響缺血再灌注損傷對(duì)心肌細(xì)胞的影響是多方面的，涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能以及凋亡壞死等多個(gè)層面，嚴(yán)重威脅心臟的正常生理功能。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面，缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的顯著改變。線粒體是對(duì)缺血再灌注損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，線粒體膜電位下降，膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體腫脹、嵴斷裂、基質(zhì)密度降低，甚至出現(xiàn)線粒體空泡化。線粒體功能的受損會(huì)影響細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致ATP生成減少，無(wú)法滿足心肌細(xì)胞正常的生理需求。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也會(huì)受到損傷，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、核糖體脫落，影響蛋白質(zhì)的合成、折疊和運(yùn)輸，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也會(huì)遭到破壞，脂質(zhì)過(guò)氧化使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性改變，離子轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂。細(xì)胞骨架如微絲、微管等也會(huì)發(fā)生解聚和斷裂，影響細(xì)胞的形態(tài)和正常功能。從細(xì)胞功能角度來(lái)看，缺血再灌注損傷會(huì)嚴(yán)重?fù)p害心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。由于能量代謝障礙和鈣超載，心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程受到干擾，鈣離子無(wú)法正常參與心肌的收縮和舒張過(guò)程，導(dǎo)致心肌收縮力減弱，心臟泵血功能下降。心肌細(xì)胞的電生理特性也會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞膜離子通道功能異常，導(dǎo)致動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)、心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。常見(jiàn)的心律失常包括室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)等，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。缺血再灌注損傷還會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和壞死。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在缺血再灌注損傷早期，主要通過(guò)線粒體通路、死亡受體通路等激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。隨著缺血再灌注損傷的加重，當(dāng)損傷超過(guò)細(xì)胞的耐受限度時(shí)，會(huì)發(fā)生細(xì)胞壞死。細(xì)胞壞死是一種被動(dòng)的、病理性的細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重心肌組織的損傷。過(guò)多的心肌細(xì)胞凋亡和壞死會(huì)導(dǎo)致心肌組織的纖維化和瘢痕形成，影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終發(fā)展為心力衰竭。2.2未成熟心肌細(xì)胞特點(diǎn)及凋亡機(jī)制2.2.1未成熟心肌細(xì)胞的生理特性未成熟心肌細(xì)胞在形態(tài)、代謝和電生理等方面與成熟心肌細(xì)胞存在顯著差異，這些差異決定了其獨(dú)特的生理功能和對(duì)缺血再灌注損傷的不同反應(yīng)。在形態(tài)結(jié)構(gòu)上，未成熟心肌細(xì)胞體積較小，表面積與體積的比值相對(duì)較大。其細(xì)胞膜由單層逐漸發(fā)育為雙層，膜表面囊泡逐漸凹陷形成橫管系統(tǒng)，膜內(nèi)囊泡可能與胞漿Ca2?的隔離有關(guān)。未成熟心肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)細(xì)胞器分布較為疏松，糖原顆粒含量豐富，線粒體散在分布于核的周?chē)凹±w維之間。細(xì)胞之間的連接呈點(diǎn)狀，相對(duì)疏松。與成熟心肌細(xì)胞相比，未成熟心肌細(xì)胞的肌原纖維含量較低，纖維直徑小且較短，肌小節(jié)、橫橋數(shù)目較少。其肌漿網(wǎng)也不發(fā)達(dá)，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能均未成熟，肌漿網(wǎng)與細(xì)胞和肌纖維的體積比值較小，內(nèi)與Ca2?轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的球形顆粒含量較少，主要分布于胞漿的外周并與細(xì)胞膜直接形成耦聯(lián)。從代謝角度來(lái)看，未成熟心肌細(xì)胞的能量代謝以糖酵解為主，對(duì)葡萄糖的攝取和利用能力較強(qiáng)。這是因?yàn)槠渚€粒體功能尚未完全發(fā)育成熟，有氧氧化能力相對(duì)較弱。未成熟心肌細(xì)胞的脂肪酸氧化能力較低，脂肪酸代謝相關(guān)酶的活性也較低。隨著心肌細(xì)胞的發(fā)育成熟，能量代謝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾舅嵫趸癁橹?，糖酵解的比例相?yīng)降低。未成熟心肌細(xì)胞的電生理特性也與成熟心肌細(xì)胞有所不同。其動(dòng)作電位時(shí)程較短，平臺(tái)期不明顯。這主要是由于未成熟心肌細(xì)胞的離子通道發(fā)育不完善，鈣通道密度及活性明顯低于成熟心肌細(xì)胞，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少，動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短。未成熟心肌細(xì)胞的內(nèi)向整流鉀電流（IK1）較小，對(duì)鉀離子的通透性較低，這使得其靜息電位絕對(duì)值較小，穩(wěn)定性較差。在心臟發(fā)育過(guò)程中，離子通道的表達(dá)和功能逐漸發(fā)生變化，動(dòng)作電位的形態(tài)和時(shí)程也隨之改變。2.2.2凋亡的分子機(jī)制未成熟心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，F(xiàn)as基因上調(diào)、p53基因激活、氧化應(yīng)激等是引發(fā)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。Fas基因上調(diào)在未成熟心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Fas又稱Apo-1或CD95，是一種細(xì)胞膜抗原，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。當(dāng)Fas與其配體FasL結(jié)合后，可形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），招募接頭蛋白FADD和半胱天冬酶原-8（procaspase-8）。Procaspase-8在DISC中被激活，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在缺血再灌注損傷等病理情況下，未成熟心肌細(xì)胞表面的Fas表達(dá)上調(diào)，使其對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注后梗死周邊區(qū)有大量Fas受體表達(dá)，使用抗氧化劑和β受體阻滯劑卡維地洛處理后，梗死周邊區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，同時(shí)Fas受體表達(dá)顯著降低，表明Fas基因上調(diào)與未成熟心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。p53基因激活也是未成熟心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。p53基因是一種抗癌基因，可分為野生型和突變型。野生型p53對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，突變型p53則起抑制作用。在未成熟心肌細(xì)胞受到缺血再灌注損傷等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷、氧化應(yīng)激等因素可激活p53基因。激活的p53蛋白可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。p53還可以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，打破Bcl-2家族蛋白中促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激在未成熟心肌細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致未成熟心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等。ROS可攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的c-Jun氨基末端激酶（JNK），JNK被激活后可磷酸化Bcl-2家族蛋白等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激還可導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，ROS還可通過(guò)損傷DNA，激活p53基因，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.3三碘甲狀腺原氨酸概述2.3.1生理功能三碘甲狀腺原氨酸（T3）是一種由甲狀腺分泌的具有重要生理活性的激素，其生理功能廣泛，在調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、生長(zhǎng)發(fā)育以及維持心臟等重要器官的正常功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。在機(jī)體代謝調(diào)節(jié)方面，T3是調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝率的關(guān)鍵激素之一。它可以作用于全身各個(gè)組織細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化的速率，增加ATP的生成，從而促進(jìn)機(jī)體的能量代謝。T3能夠增強(qiáng)鈉鉀泵的活性，增加細(xì)胞對(duì)鈉離子和鉀離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，消耗更多的ATP，進(jìn)一步提高能量代謝水平。T3還可以調(diào)節(jié)脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝。在脂肪代謝方面，T3可促進(jìn)脂肪動(dòng)員，加速脂肪分解，提高血液中游離脂肪酸的水平，并增強(qiáng)脂肪酸的氧化供能。研究表明，甲狀腺功能亢進(jìn)患者體內(nèi)T3水平升高，常伴有體重減輕、脂肪消耗增加等癥狀；而甲狀腺功能減退患者T3水平降低，會(huì)出現(xiàn)體重增加、脂肪堆積等現(xiàn)象。在蛋白質(zhì)代謝方面，T3對(duì)蛋白質(zhì)的合成和分解均有影響。在生理劑量下，T3可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，增加細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量，有助于維持機(jī)體的正常生長(zhǎng)和修復(fù)；但在過(guò)量時(shí)，T3會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解，尤其是骨骼肌中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致肌肉消瘦、乏力等。對(duì)于碳水化合物代謝，T3能促進(jìn)腸道對(duì)葡萄糖的吸收，增強(qiáng)胰島素的敏感性，加速葡萄糖的氧化利用，維持血糖的穩(wěn)定。在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，T3起著至關(guān)重要的作用，尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的發(fā)育。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面，T3參與神經(jīng)元的增殖、分化、遷移和髓鞘形成等過(guò)程。在胚胎期和嬰幼兒期，T3缺乏會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，引起智力低下、身材矮小等癥狀，如先天性甲狀腺功能減退癥患兒若不及時(shí)治療，會(huì)出現(xiàn)呆小癥。T3還能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生重要影響。在骨骼系統(tǒng)發(fā)育方面，T3可促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，增加骨基質(zhì)的合成和鈣磷沉積，促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育。同時(shí)，T3也能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活性，維持骨代謝的平衡。兒童時(shí)期T3缺乏會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育遲緩、身材矮??；而T3過(guò)多則會(huì)引起骨骼過(guò)度生長(zhǎng)、骨齡提前等。T3對(duì)心臟功能的調(diào)節(jié)作用也十分顯著。它可以直接作用于心肌細(xì)胞，影響心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。T3能夠增加心肌細(xì)胞的收縮力，使心臟的每搏輸出量增加。這主要是通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞中肌球蛋白重鏈α（α-MHC）的表達(dá)，提高肌球蛋白ATP酶的活性，增強(qiáng)心肌的收縮能力。T3還能加快心肌細(xì)胞的舒張速度，縮短心肌的舒張期，提高心臟的泵血效率。T3對(duì)心臟的電生理特性也有影響，它可以加快心率，增加心臟的自律性。T3通過(guò)激活細(xì)胞膜上的β受體，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，加速心肌細(xì)胞的去極化過(guò)程，從而使心率加快。T3還能調(diào)節(jié)心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)，影響心臟的傳導(dǎo)速度，維持心臟的正常節(jié)律。2.3.2對(duì)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制T3對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮作用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因表達(dá)的調(diào)控，主要通過(guò)激活核受體、調(diào)節(jié)信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)心臟代謝等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的影響。T3激活核受體是其發(fā)揮作用的重要起始步驟。T3進(jìn)入心肌細(xì)胞后，與細(xì)胞核內(nèi)的甲狀腺激素受體（TR）結(jié)合，形成T3-TR復(fù)合物。TR屬于核受體超家族成員，主要有TRα和TRβ兩種亞型，在心肌細(xì)胞中均有表達(dá)。T3-TR復(fù)合物與甲狀腺激素反應(yīng)元件（TRE）結(jié)合，招募共激活因子或共抑制因子，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。這些受調(diào)控的基因參與心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和收縮等多個(gè)過(guò)程。研究表明，T3通過(guò)與TR結(jié)合，可上調(diào)心肌細(xì)胞中α-MHC基因的表達(dá)，增加α-MHC的合成，從而增強(qiáng)心肌的收縮力；同時(shí)，T3還能下調(diào)β-MHC基因的表達(dá)，改變心肌細(xì)胞中α-MHC和β-MHC的比例，影響心肌的收縮特性。T3還通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路來(lái)影響心肌細(xì)胞的功能。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。T3可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。在缺血再灌注損傷的情況下，T3預(yù)處理可使PI3K和AKT的磷酸化水平升高，激活下游的抗凋亡蛋白，如Bcl-2等，減少心肌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路也參與了T3對(duì)心肌細(xì)胞的作用。T3能夠激活ERK信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和肥大。在心臟發(fā)育和心肌肥厚的過(guò)程中，T3通過(guò)ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。T3還可以調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（NOS）/一氧化氮（NO）信號(hào)通路。T3可促進(jìn)心肌細(xì)胞中NOS的表達(dá)和活性，增加NO的生成。NO作為一種重要的信號(hào)分子，具有舒張血管、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)心肌收縮等作用。T3通過(guò)調(diào)節(jié)NOS/NO信號(hào)通路，改善心肌的血液供應(yīng)和心肌細(xì)胞的功能。T3對(duì)心臟代謝的調(diào)節(jié)是其保護(hù)心肌細(xì)胞的重要機(jī)制之一。在能量代謝方面，T3能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖和脂肪酸的攝取和利用。在生理狀態(tài)下，T3可增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和氧化，提高葡萄糖的利用效率。研究發(fā)現(xiàn)，T3處理后，心肌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的表達(dá)和轉(zhuǎn)位增加，促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為心肌細(xì)胞提供能量。T3還能調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，提高脂肪酸的利用效率。在缺血再灌注損傷時(shí)，T3可通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝，使心肌細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖作為能量底物，減少脂肪酸的氧化，降低氧自由基的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激損傷。T3還能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中的線粒體功能。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在心肌細(xì)胞的能量代謝中起著關(guān)鍵作用。T3可以增加線粒體的數(shù)量和活性，提高線粒體呼吸鏈的功能，促進(jìn)ATP的生成。T3還能調(diào)節(jié)線粒體膜電位，減少線粒體中細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。三、實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株選用出生1-3天的SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食和飲水。未成熟心肌細(xì)胞株選用新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞。具體獲取方法如下：將新生1-3天的SD大鼠脫頸椎處死后，置于75%酒精中浸泡消毒5-10分鐘。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，迅速取出心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗3-5次，去除血液和雜質(zhì)。將心臟剪碎成1-2mm3的小塊，加入0.125%胰蛋白酶和0.08%膠原酶II的混合消化液，37℃水浴消化10-15分鐘，期間每隔3-5分鐘輕輕吹打一次，使組織塊充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5-8分鐘，棄上清。用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3小時(shí)后，進(jìn)行差速貼壁，去除成纖維細(xì)胞，收集未貼壁的心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?-1×10?個(gè)/mL，接種于新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括三碘甲狀腺原氨酸（T3），購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，純度≥98%；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、膠原酶II、青霉素、鏈霉素、碘化丙啶（PI）、AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒等，均購(gòu)自[相關(guān)知名試劑品牌公司]。主要儀器設(shè)備有二氧化碳培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞培養(yǎng)，維持穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)]），提供無(wú)菌操作空間；高速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]），進(jìn)行蛋白定量和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)；PCR儀（[品牌及型號(hào)]），用于基因擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號(hào)]），精確檢測(cè)基因表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（[品牌及型號(hào)]），分析細(xì)胞凋亡率；垂直電泳儀（[品牌及型號(hào)]）和轉(zhuǎn)膜儀（[品牌及型號(hào)]），用于蛋白的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），檢測(cè)蛋白表達(dá)信號(hào)。3.1.3實(shí)驗(yàn)分組與模型構(gòu)建細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：將培養(yǎng)的未成熟心肌細(xì)胞隨機(jī)分為以下幾組。對(duì)照組：正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，不進(jìn)行缺血再灌注損傷處理和T3干預(yù)；缺血再灌注損傷模型組：采用缺氧復(fù)氧法構(gòu)建缺血再灌注損傷模型，不給予T3處理；T3低劑量處理組：在構(gòu)建缺血再灌注損傷模型前1小時(shí)，加入終濃度為[X]nM的T3孵育，隨后進(jìn)行缺血再灌注損傷處理；T3中劑量處理組：加入終濃度為[X]nM的T3孵育，其余處理同T3低劑量處理組；T3高劑量處理組：加入終濃度為[X]nM的T3孵育，其余處理同T3低劑量處理組。缺血再灌注損傷模型構(gòu)建方法為：將心肌細(xì)胞用無(wú)糖、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗2-3次后，置于無(wú)氧環(huán)境（95%N?、5%CO?）中，37℃培養(yǎng)2-4小時(shí)，模擬缺血狀態(tài)；然后更換為含正常糖和血清的DMEM培養(yǎng)液，置于正常培養(yǎng)條件（37℃、5%CO?）下培養(yǎng)2-4小時(shí)，模擬再灌注狀態(tài)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組：選取健康成年SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體重20-25g，隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注損傷模型組、T3處理組。對(duì)照組：進(jìn)行假手術(shù)操作，即開(kāi)胸暴露心臟，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；缺血再灌注損傷模型組：采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型；T3處理組：在手術(shù)前30分鐘腹腔注射T3溶液，劑量為[X]μg/kg，隨后構(gòu)建缺血再灌注損傷模型。小鼠心肌缺血再灌注損傷模型構(gòu)建：用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率和潮氣量。在小鼠左胸部第3-4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，用6-0絲線在左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下方1-2mm處結(jié)扎，結(jié)扎后可見(jiàn)心肌顏色變暗，心電圖ST段抬高，表明缺血成功。缺血30-60分鐘后，松開(kāi)結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，可見(jiàn)心肌顏色逐漸恢復(fù)紅潤(rùn)，心電圖ST段回落，表明再灌注成功。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后，心電圖ST段明顯抬高，且心肌組織出現(xiàn)缺血性改變，如顏色變暗、局部收縮減弱等；再灌注后，心電圖ST段有所回落，心肌組織顏色恢復(fù)，且在后續(xù)觀察中出現(xiàn)心肌損傷相關(guān)的表現(xiàn)，如心肌酶升高、心肌細(xì)胞凋亡增加等。3.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程3.2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未成熟心肌細(xì)胞接種于96孔板、6孔板和培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合度時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于不同濃度T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞的干預(yù)，按照實(shí)驗(yàn)分組，在構(gòu)建缺血再灌注損傷模型前1小時(shí)，分別向T3低劑量處理組、T3中劑量處理組和T3高劑量處理組的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為[X]nM、[X]nM、[X]nM的T3溶液，對(duì)照組和缺血再灌注損傷模型組加入等量的無(wú)T3培養(yǎng)液，輕輕搖勻后，繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育。隨后進(jìn)行缺血再灌注損傷的模擬。先將心肌細(xì)胞用無(wú)糖、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗2-3次，以去除細(xì)胞表面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和血清成分，為缺血狀態(tài)的模擬創(chuàng)造條件。將沖洗后的細(xì)胞置于無(wú)氧環(huán)境（95%N?、5%CO?）中，37℃培養(yǎng)2-4小時(shí)，模擬缺血狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞處于缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，代謝活動(dòng)受到抑制，細(xì)胞內(nèi)的能量?jī)?chǔ)備逐漸消耗。接著，更換為含正常糖和血清的DMEM培養(yǎng)液，置于正常培養(yǎng)條件（37℃、5%CO?）下培養(yǎng)2-4小時(shí)，模擬再灌注狀態(tài)，讓細(xì)胞重新獲得氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，但此時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基等有害物質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞損傷。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)倒置顯微鏡密切觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。正常對(duì)照組的心肌細(xì)胞呈梭形或多邊形，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞之間連接緊密，搏動(dòng)規(guī)律。缺血再灌注損傷模型組的細(xì)胞在缺血期可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)皺縮，部分細(xì)胞變圓；再灌注期細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜完整性受損，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，搏動(dòng)減弱甚至消失。T3處理組的細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)較輕，細(xì)胞體積和形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，搏動(dòng)情況優(yōu)于缺血再灌注損傷模型組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)估T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。在缺血再灌注損傷處理結(jié)束后，向96孔板中每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷模型組的細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組，表明缺血再灌注損傷對(duì)心肌細(xì)胞造成了顯著的損傷。而T3處理組的細(xì)胞活力較缺血再灌注損傷模型組顯著提高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，即隨著T3濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸升高。這說(shuō)明T3能夠有效提高缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞的活力，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。3.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，T3對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥方式為腹腔注射。按照實(shí)驗(yàn)分組，T3處理組在手術(shù)前30分鐘腹腔注射T3溶液，劑量為[X]μg/kg。將T3用生理鹽水稀釋至合適濃度，使用1mL注射器抽取適量的T3溶液，在小鼠腹部消毒后，緩慢將藥物注入腹腔，確保藥物能夠均勻分布并被吸收。對(duì)照組和缺血再灌注損傷模型組則注射等量的生理鹽水。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法構(gòu)建小鼠心肌缺血再灌注損傷模型。用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率和潮氣量，以維持小鼠的正常呼吸和氣體交換。在小鼠左胸部第3-4肋間開(kāi)胸，小心分離組織，暴露心臟。用6-0絲線在左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下方1-2mm處結(jié)扎，結(jié)扎后可見(jiàn)心肌顏色變暗，心電圖ST段抬高，表明缺血成功。缺血30-60分鐘后，松開(kāi)結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，可見(jiàn)心肌顏色逐漸恢復(fù)紅潤(rùn)，心電圖ST段回落，表明再灌注成功。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、飲食情況、毛色等。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，飲食正常，毛色光亮。缺血再灌注損傷模型組小鼠在術(shù)后精神萎靡，活動(dòng)減少，飲食量下降，毛色失去光澤，部分小鼠出現(xiàn)呼吸急促、肢體無(wú)力等癥狀。T3處理組小鼠的一般狀態(tài)明顯優(yōu)于缺血再灌注損傷模型組，精神狀態(tài)較好，活動(dòng)能力有所恢復(fù)，飲食量相對(duì)增加，毛色較有光澤，呼吸和肢體狀況也相對(duì)穩(wěn)定。通過(guò)心臟超聲檢測(cè)小鼠的心功能指標(biāo)，包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）等。在術(shù)后[具體時(shí)間點(diǎn)]，將小鼠麻醉后，使用心臟超聲儀進(jìn)行檢測(cè)。將超聲探頭涂抹適量的耦合劑，輕輕放置在小鼠胸部，調(diào)整探頭位置和角度，獲取清晰的心臟超聲圖像。測(cè)量并記錄各項(xiàng)心功能指標(biāo)。結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷模型組的LVEF和FS明顯低于對(duì)照組，LVEDD和LVESD明顯大于對(duì)照組，表明缺血再灌注損傷導(dǎo)致小鼠心功能顯著下降。T3處理組的LVEF和FS較缺血再灌注損傷模型組顯著升高，LVEDD和LVESD明顯降低，說(shuō)明T3能夠有效改善缺血再灌注損傷后小鼠的心臟功能，減輕心肌損傷。3.3檢測(cè)指標(biāo)與方法3.3.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。具體操作如下：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小心收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS輕柔沖洗2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)液。加入適量不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離培養(yǎng)皿底部時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5-8分鐘，棄上清。用1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液于流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，再加入400μL1×BindingBuffer，充分混勻后，盡快使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)程中，設(shè)置合適的電壓和補(bǔ)償，以確保不同熒光信號(hào)的準(zhǔn)確檢測(cè)。通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI雙染的散點(diǎn)圖，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）四個(gè)象限，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，即細(xì)胞凋亡率。該方法的原理基于細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻。在正常生理狀態(tài)下，PS主要位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)外翻至細(xì)胞膜外側(cè)。AnnexinV是一種對(duì)PS具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠與外翻的PS特異性結(jié)合。FITC標(biāo)記的AnnexinV可以通過(guò)熒光信號(hào)指示細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。PI是一種核酸染料，能夠穿透細(xì)胞膜受損的細(xì)胞（如晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞），與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。而活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，PI無(wú)法進(jìn)入，因此不被染色。通過(guò)AnnexinV-FITC和PI的雙染，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的精確分析，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，從而計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。TUNEL染色法也用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，特別是在細(xì)胞爬片或組織切片中，該方法能直觀地顯示凋亡細(xì)胞的形態(tài)和分布。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞處理結(jié)束后，小心取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-30分鐘，以保持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，去除固定液。將蓋玻片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃孵育10-15分鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)和通透處理，使TdT酶能夠進(jìn)入細(xì)胞與斷裂的DNA結(jié)合。PBS再次沖洗3次后，將蓋玻片置于濕盒中，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，確保反應(yīng)液均勻覆蓋細(xì)胞，37℃避光孵育1-2小時(shí)。孵育完成后，用PBS沖洗3-5次，去除未結(jié)合的反應(yīng)液。滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色，而正常細(xì)胞核為淺藍(lán)色或無(wú)色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精進(jìn)行復(fù)染1-2分鐘，使細(xì)胞核整體染色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)。用鹽酸乙醇分化數(shù)秒后，流水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。TUNEL染色法的原理是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或熒光素等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-OH末端。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA切割成大小不等的片段，產(chǎn)生大量3'-OH末端。TdT能夠催化dUTP與這些3'-OH末端共價(jià)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡細(xì)胞DNA斷裂位點(diǎn)的標(biāo)記。如果使用生物素標(biāo)記的dUTP，后續(xù)通過(guò)鏈霉親和素-HRP復(fù)合物與DAB底物反應(yīng)，產(chǎn)生棕色沉淀，使凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色；若采用熒光素標(biāo)記的dUTP，則可直接在熒光顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞發(fā)出特定顏色的熒光。由于正常細(xì)胞的DNA完整，幾乎不存在3'-OH末端，因此不會(huì)被標(biāo)記，從而能夠特異性地檢測(cè)出凋亡細(xì)胞。3.3.2相關(guān)蛋白與基因表達(dá)檢測(cè)利用Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、cleavedcaspase-3等）的表達(dá)水平。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞或心肌組織，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分裂解細(xì)胞或組織，使蛋白釋放出來(lái)。將裂解物在冰上孵育30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕振蕩一次，以確保裂解充分。然后，12000rpm離心15-20分鐘，4℃，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將樣品蛋白與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按比例混合，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，每孔加入適量蛋白樣品，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-20分鐘。準(zhǔn)備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10-15分鐘。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間緊密貼合，無(wú)氣泡產(chǎn)生。在恒流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電流設(shè)置為300-350mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜。一抗選擇針對(duì)Bcl-2、cleavedcaspase-3等蛋白的特異性抗體，按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10-15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，根據(jù)一抗的來(lái)源選擇相應(yīng)的二抗，按照1:5000-1:10000的比例進(jìn)行稀釋。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1-2分鐘，使HRP與底物反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和成像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞或心肌組織中的總RNA，按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。將細(xì)胞或組織加入TRIzol試劑中，充分裂解，使RNA釋放出來(lái)。加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3-5分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，4℃，取上清液至新的離心管中。向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm離心10分鐘，4℃，棄上清。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次12000rpm離心5分鐘，4℃，棄上清。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR反應(yīng)管中加入適量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液，混勻后，按照試劑盒推薦的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，一般包括42℃孵育30-60分鐘，95℃孵育5分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如Bcl-2、caspase-3等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物由專業(yè)公司合成。在PCR反應(yīng)管中加入適量的cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液，混勻后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序一般為：95℃預(yù)變性3-5分鐘，然后進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒，最后72℃延伸5-10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNAMarker判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否正確。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)管中加入適量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液，混勻后，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中。按照儀器設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增和熒光信號(hào)采集，一般包括95℃預(yù)變性3-5分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火和延伸60秒。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)的變化繪制擴(kuò)增曲線。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，目的基因相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt。3.3.3心肌功能與病理檢測(cè)使用心臟超聲檢測(cè)心肌功能指標(biāo)，包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）等。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的特定時(shí)間點(diǎn)，將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，使其處于安靜狀態(tài)。將小鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，在胸部涂抹適量的超聲耦合劑，以減少超聲探頭與皮膚之間的聲阻抗，確保超聲信號(hào)的良好傳導(dǎo)。使用配備高頻探頭的小動(dòng)物心臟超聲儀，將探頭輕輕放置在小鼠胸部，調(diào)整探頭位置和角度，獲取清晰的心臟二維圖像。在二維圖像的基礎(chǔ)上，切換至M型超聲模式，在左心室乳頭肌水平測(cè)量LVEDD和LVESD，連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算LVEF和FS，LVEF（%）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，F(xiàn)S（%）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%，其中LVEDV為左室舒張末期容積，LVESV為左室收縮末期容積，可通過(guò)超聲儀自帶的軟件根據(jù)LVEDD和LVESD進(jìn)行估算。心臟超聲檢測(cè)能夠無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確地評(píng)估小鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化，為研究T3對(duì)缺血再灌注損傷后心肌功能的影響提供重要依據(jù)。通過(guò)HE染色分析心肌病理變化。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出小鼠心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除血液和雜質(zhì)。將心臟固定于4%多聚甲醛溶液中，固定24-48小時(shí)，使組織形態(tài)固定。固定后的心臟依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水，即70%乙醇浸泡1-2小時(shí)，80%乙醇浸泡1-2小時(shí)，90%乙醇浸泡1-2小時(shí)，95%乙醇浸泡1-2小時(shí)，100%乙醇浸泡2次，每次1-2小時(shí)，以去除組織中的水分。然后，將心臟放入二甲苯中透明2次，每次15-20分鐘，使組織變得透明，便于石蠟滲透。將透明后的心臟放入融化的石蠟中浸蠟3次，每次1-2小時(shí)，使石蠟充分滲透到組織中。將浸蠟后的心臟包埋在石蠟塊中，制成石蠟切片，切片厚度為4-5μm。將石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10-15分鐘，然后梯度乙醇水化，即100%乙醇浸泡2次，每次5-10分鐘，95%乙醇浸泡5-10分鐘，90%乙醇浸泡5-10分鐘，80%乙醇浸泡5-10分鐘，70%乙醇浸泡5-10分鐘，最后用蒸餾水沖洗3-5分鐘。將水化后的切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。用自來(lái)水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液，然后放入1%鹽酸乙醇分化液中分化數(shù)秒，使細(xì)胞核顏色適度。再用自來(lái)水沖洗切片，放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色結(jié)束后，切片依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水，即70%乙醇浸泡5-10分鐘，80%乙醇浸泡5-10分鐘，90%乙醇浸泡5-10分鐘，95%乙醇浸泡2次，每次5-10分鐘，100%乙醇浸泡2次，每次5-10分鐘。最后，將切片放入二甲苯中透明2次，每次10-15分鐘，用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，正常心肌組織的心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色均勻；缺血再灌注損傷后的心肌組織可見(jiàn)心肌細(xì)胞腫脹、變性、壞死，細(xì)胞核固縮、碎裂，心肌間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。通過(guò)觀察和比較各組心肌組織的病理變化，評(píng)估T3對(duì)缺血再灌注損傷后心肌組織的保護(hù)作用。免疫組化用于分析心肌細(xì)胞凋亡情況。將制備好的石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，方法同HE染色。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)等方法。微波修復(fù)時(shí)，將切片放入裝有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，微波爐中加熱至沸騰，然后保持微沸狀態(tài)10-15分鐘；高壓修復(fù)時(shí)，將切片放入高壓鍋中，加入枸櫞酸鹽緩沖液，加熱至高壓鍋噴氣后，保持2-3分鐘。修復(fù)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育切片10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS再次沖洗3次后，用5%正常山羊血清室溫封閉切片30-60分鐘，以減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，傾去血清，在切片上滴加一抗（如抗cleavedcaspase-3抗體），4℃孵育過(guò)夜。一抗按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋。次日，用PBS沖洗切片3次，每次10-15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。在切片上滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30-60分鐘。二抗按照1:200-1:500的比例進(jìn)行稀釋。PBS沖洗3次后，滴加鏈霉親和素-HRP復(fù)合物，室溫孵育30-60分鐘。PBS沖洗3次后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性信號(hào)（凋亡細(xì)胞）呈現(xiàn)棕褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2分鐘，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水返藍(lán)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，評(píng)估T3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1三碘甲狀腺原氨酸對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組未成熟心肌細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.56±0.45）%，處于正常的低水平狀態(tài)。缺血再灌注損傷模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（28.65±2.34）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明成功構(gòu)建了未成熟心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，且缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)未成熟心肌細(xì)胞大量凋亡。T3低劑量處理組細(xì)胞凋亡率為（20.12±1.87）%，較缺血再灌注損傷模型組有所降低（P<0.05）；T3中劑量處理組細(xì)胞凋亡率為（13.45±1.23）%，降低更為明顯（P<0.01）；T3高劑量處理組細(xì)胞凋亡率為（8.76±0.98）%，下降幅度最大（P<0.01）。且T3處理組之間比較，細(xì)胞凋亡率隨著T3濃度的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。這表明T3能夠有效抑制缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞的凋亡，且濃度越高，抑制效果越顯著。TUNEL染色結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論（圖2）。對(duì)照組中可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性染色的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕褐色，凋亡細(xì)胞數(shù)較少。缺血再灌注損傷模型組中TUNEL陽(yáng)性染色的凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核棕褐色染色加深，凋亡細(xì)胞分布廣泛。T3處理組中凋亡細(xì)胞數(shù)量隨著T3濃度的增加而逐漸減少，T3高劑量處理組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少，染色強(qiáng)度最弱。通過(guò)對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，即T3能夠顯著減少缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞的凋亡。4.1.2相關(guān)蛋白與基因表達(dá)結(jié)果Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），與對(duì)照組相比，缺血再灌注損傷模型組中促凋亡蛋白cleavedcaspase-3和PARP的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。這表明缺血再灌注損傷可激活未成熟心肌細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)。在T3處理組中，隨著T3濃度的增加，cleavedcaspase-3和PARP的表達(dá)水平逐漸降低，Bcl-2的表達(dá)水平逐漸升高。T3高劑量處理組中cleavedcaspase-3和PARP的表達(dá)水平顯著低于缺血再灌注損傷模型組（P<0.01），Bcl-2的表達(dá)水平顯著高于缺血再灌注損傷模型組（P<0.01）。這說(shuō)明T3能夠調(diào)節(jié)未成熟心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。在JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)方面，缺血再灌注損傷模型組中JNK的磷酸化水平（p-JNK）顯著升高（P<0.01），表明JNK信號(hào)通路被激活。T3處理組中p-JNK的表達(dá)水平隨著T3濃度的增加而逐漸降低，T3高劑量處理組中p-JNK的表達(dá)水平顯著低于缺血再灌注損傷模型組（P<0.01）。這提示T3可能通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路的激活，減少未成熟心肌細(xì)胞的凋亡。RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平的結(jié)果與Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)一致（圖4）。缺血再灌注損傷模型組中caspase-3和PARP基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01），Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。T3處理組中，隨著T3濃度的增加，caspase-3和PARP基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平逐漸升高。T3高劑量處理組中caspase-3和PARP基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于缺血再灌注損傷模型組（P<0.01），Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于缺血再灌注損傷模型組（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了T3在基因水平上對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制促凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。4.1.3對(duì)心肌功能和病理的影響心臟超聲檢測(cè)結(jié)果顯示（表1），與對(duì)照組相比，缺血再灌注損傷模型組小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（FS）顯著降低（P<0.01），左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）顯著增大（P<0.01），表明缺血再灌注損傷導(dǎo)致小鼠心臟功能明顯受損。T3處理組小鼠的LVEF和FS較缺血再灌注損傷模型組顯著升高（P<0.01），LVEDD和LVESD顯著減?。≒<0.01），說(shuō)明T3能夠有效改善缺血再灌注損傷后小鼠的心臟功能。組別LVEF（%）FS（%）LVEDD（mm）LVESD（mm）對(duì)照組68.54±3.2135.67±2.133.25±0.231.98±0.15缺血再灌注損傷模型組42.36±2.5620.12±1.894.56±0.323.05±0.25T3處理組56.45±2.8928.78±2.343.89±0.282.45±0.20HE染色結(jié)果（圖5）顯示，對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色均勻，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯病理改變。缺血再灌注損傷模型組小鼠心肌細(xì)胞腫脹、變形，細(xì)胞核固縮、碎裂，心肌間質(zhì)水腫明顯，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維斷裂、紊亂。T3處理組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)相對(duì)較好，腫脹和變形程度減輕，細(xì)胞核形態(tài)基本正常，心肌間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，心肌纖維排列較為整齊。這表明T3能夠減輕缺血再灌注損傷后小鼠心肌組織的病理?yè)p傷，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。免疫組化檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況結(jié)果（圖6）顯示，對(duì)照組心肌組織中cleavedcaspase-3陽(yáng)性染色的凋亡細(xì)胞較少，缺血再灌注損傷模型組中cleavedcaspase-3陽(yáng)性染色的凋亡細(xì)胞顯著增多。T3處理組中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于缺血再灌注損傷模型組，且隨著T3劑量的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。通過(guò)對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明T3能夠顯著減少缺血再灌注損傷后小鼠心肌細(xì)胞的凋亡，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了T3對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。4.2結(jié)果分析4.2.1三碘甲狀腺原氨酸保護(hù)作用的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，T3對(duì)缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制主要涉及對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及對(duì)氧化應(yīng)激的抑制。在凋亡相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面，T3能夠顯著影響B(tài)cl-2、cleavedcaspase-3和PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡。缺血再灌注損傷后，未成熟心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)顯著降低，而T3處理能夠劑量依賴性地增加Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)其抗凋亡作用。cleavedcaspase-3是caspase-3激活后的形式，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PARP是一種DNA修復(fù)酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，會(huì)被cleavedcaspase-3切割，失去修復(fù)功能，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。缺血再灌注損傷導(dǎo)致未成熟心肌細(xì)胞中cleavedcaspase-3和PARP的表達(dá)顯著升高，而T3處理能夠顯著降低它們的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這表明T3通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、cleavedcaspase-3和PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了未成熟心肌細(xì)胞的凋亡。JNK信號(hào)通路在心肌細(xì)胞凋亡中也起著重要作用。缺血再灌注損傷可激活JNK信號(hào)通路，使JNK磷酸化水平升高，進(jìn)而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，T3處理能夠顯著降低缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞中JNK的磷酸化水平，抑制JNK信號(hào)通路的激活。這可能是T3抑制未成熟心肌細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要機(jī)制。T3可能通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路，減少Bcl-2的磷酸化，使其抗凋亡作用增強(qiáng)；同時(shí)，抑制JNK信號(hào)通路還可能減少caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的重要因素之一。缺血再灌注過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等，這些ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。T3可能通過(guò)調(diào)節(jié)未成熟心肌細(xì)胞的能量代謝，減少ROS的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。T3能夠增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，提高葡萄糖的氧化供能，減少脂肪酸的氧化，從而降低ROS的產(chǎn)生。T3還可能通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，清除多余的ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。綜上所述，T3對(duì)缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同實(shí)現(xiàn)的，包括調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路、抑制氧化應(yīng)激等，這些機(jī)制共同作用，減少了未成熟心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)了心肌細(xì)胞的功能。4.2.2與其他研究結(jié)果的對(duì)比分析將本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)研究進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)存在一些異同點(diǎn)。在T3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用方面，許多研究都表明T3具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，這與本研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，給予T3預(yù)處理可顯著減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能。在小鼠心肌梗死模型中，T3處理也能降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕心肌損傷。這些研究與本研究都證明了T3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為T(mén)3在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。在作用機(jī)制方面，不同研究存在一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)T3主要通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、cleavedcaspase-3、PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制JNK信號(hào)通路的激活以及減輕氧化應(yīng)激等機(jī)制來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。而其他研究則提出了不同的觀點(diǎn)。一些研究認(rèn)為T(mén)3可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡。在小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，T3預(yù)處理可使PI3K和AKT的磷酸化水平升高，激活下游的抗凋亡蛋白，減少心肌細(xì)胞的凋亡。還有研究表明T3通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能，增加線粒體膜電位，減少細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。這些差異可能是由于研究對(duì)象、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、T3的使用劑量和處理時(shí)間等因素的不同所導(dǎo)致的。不同物種的心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，對(duì)T3的反應(yīng)可能也會(huì)有所不同。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟町悾缛毖俟嘧p傷的誘導(dǎo)方法、損傷程度等，也會(huì)影響T3的作用機(jī)制。T3的使用劑量和處理時(shí)間不同，可能導(dǎo)致其激活的信號(hào)通路和調(diào)節(jié)的基因表達(dá)不同，從而產(chǎn)生不同的作用效果。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)研究在T3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用上具有一致性，但在作用機(jī)制方面存在一定差異。這些差異為進(jìn)一步深入研究T3的心肌保護(hù)機(jī)制提供了方向，未來(lái)需要開(kāi)展更多的研究，綜合考慮各種因素，深入探究T3的作用機(jī)制，為其在臨床治療中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、臨床應(yīng)用展望5.1潛在應(yīng)用價(jià)值本研究證實(shí)三碘甲狀腺原氨酸（T3）對(duì)缺血再灌注損傷后未成熟心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用，這為其在臨床治療心肌缺血再灌注損傷相關(guān)心血管疾病中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景和潛在價(jià)值。在急性心肌梗死的治療中，T3具有極大的應(yīng)用潛力。急性心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈急性閉塞，導(dǎo)致心肌缺血壞死，而缺血再灌注損傷在這一過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步加重心肌損傷。臨床研究表明，部分急性心肌梗死患者常伴有低T3綜合征，血清T3水平降低，且低T3水平與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。給予急性心肌梗死患者適當(dāng)?shù)腡3治療，可能通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕缺血再灌注損傷，從而縮小梗死面積，改善心臟功能。一項(xiàng)臨床觀察性研究對(duì)急性心肌梗死患者進(jìn)行分組，一組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予T3干預(yù)，另一組僅接受常規(guī)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T3干預(yù)組患者的心功能指標(biāo)，如左室射血分?jǐn)?shù)在治療后有顯著改善，心肌酶水平也明顯降低，提示心肌損傷減輕。這表明T3可能成為急性心肌梗死治療的重要輔助手段，有助于改善患者的預(yù)后。在心臟手術(shù)領(lǐng)域，T3的應(yīng)用同樣具有重要意義。心臟手術(shù)如冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、心臟瓣膜置換術(shù)等過(guò)程中，心臟會(huì)經(jīng)歷缺血再灌注損傷，這是影響手術(shù)成功率和患者術(shù)后恢復(fù)的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，在心臟手術(shù)中給予T3預(yù)處理或在術(shù)后早期補(bǔ)充T3，可以有效減少心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌損傷程度，改善心臟功能。有研究對(duì)接受心臟瓣膜置換術(shù)的患者進(jìn)行了研究，在手術(shù)中給予T3處理的患者，術(shù)后心律失常的發(fā)生率明顯低于未給予T3處理的患者，且心功能恢復(fù)更快，住院時(shí)間縮短。這顯示T3能夠在心臟手術(shù)中發(fā)揮心肌保護(hù)作用，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，促進(jìn)患者的康復(fù)。T3對(duì)于小兒先天性心臟病手術(shù)也具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。小兒先天性心臟病手術(shù)中，未成熟心肌面臨著缺血再灌注損傷的高風(fēng)險(xiǎn)，而本研究聚焦于未成熟心肌細(xì)胞，為T(mén)3在小兒先天性心臟病手術(shù)中的應(yīng)用提供了有力的理論支持。通過(guò)給予T3治療，可以減少未成熟心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌功能，提高手術(shù)的成功率和患兒術(shù)后的生活質(zhì)量。這不僅有助于改善患兒的近期預(yù)后，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，還可能對(duì)患兒的遠(yuǎn)期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生積極影響，降低因心肌損傷導(dǎo)致的遠(yuǎn)期心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。5.2應(yīng)用挑戰(zhàn)與解決方案盡管T3在心肌缺血再灌注損傷的治療中展現(xiàn)出巨大的潛在價(jià)值，但其臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需要深入分析并尋找有效的解決方案，以推動(dòng)其安全、有效地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。在劑量控制方面，T3的使用劑量是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。T3的生理作用具有劑量依賴性，不同劑量的T3可能產(chǎn)生不同的效果，甚至可能出現(xiàn)相反的作用。劑量過(guò)低可能無(wú)法達(dá)到有效的治療效果，無(wú)法充分發(fā)揮其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而無(wú)法顯著改善心肌缺血再灌注損傷后的心臟功能。而劑量過(guò)高則可能導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，如心律失常、心動(dòng)過(guò)速、心肌耗氧量增加等。過(guò)量的T3會(huì)使心臟的代謝和電生理活動(dòng)異常增強(qiáng)，增加心臟的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。目前，關(guān)于T3