中藥葉下珠抗新城疫病毒活性的多維度探究與應(yīng)用展望一、引言1.1研究背景與意義1.1.1新城疫病毒的危害新城疫（NewcastleDisease，ND）是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）引起的一種具有高度接觸傳染性的禽類疾病，被國際獸疫局（OIE）列為必須報告的動物疫病，在我國被列為一類動物疫病。新城疫病毒的宿主范圍極為廣泛，除雞之外，還可感染鴨、鵝、鴿、鵪鶉等多種家禽和野禽。其傳播速度極快，可通過空氣、飼料、飲水、糞便以及人員和器具的移動等多種途徑迅速擴散，在養(yǎng)殖場中，一旦有一只禽類感染，短時間內(nèi)就可能導(dǎo)致整個雞群乃至周邊養(yǎng)殖場的禽類被感染。新城疫病毒對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的影響是毀滅性的。感染病毒的家禽會出現(xiàn)多種嚴重癥狀，如呼吸困難，表現(xiàn)為張口呼吸、氣喘、咳嗽等，導(dǎo)致機體缺氧，影響正常的生理代謝；下痢，使得營養(yǎng)物質(zhì)無法有效吸收，機體迅速消瘦，脫水；神經(jīng)癥狀，如抽搐、轉(zhuǎn)圈、共濟失調(diào)等，嚴重影響家禽的行動和生存能力。這些癥狀往往導(dǎo)致家禽的死亡率大幅上升，在一些嚴重的疫情中，家禽的死亡率甚至可高達90%以上，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。新城疫的爆發(fā)不僅直接導(dǎo)致家禽死亡和養(yǎng)殖產(chǎn)量下降，還會對整個家禽產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)生連鎖反應(yīng)。由于疫情導(dǎo)致家禽存欄量減少，禽肉、禽蛋等產(chǎn)品的供應(yīng)短缺，價格波動劇烈，嚴重影響了養(yǎng)殖戶的收入和家禽養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益。疫情還會引發(fā)消費者對禽產(chǎn)品安全性的擔憂，導(dǎo)致市場需求下降，進一步加劇了行業(yè)的困境。除了對家禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟影響，新城疫病毒還對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。雖然目前人感染新城疫病毒的病例較為罕見，但已有研究表明，人類在接觸感染新城疫病毒的家禽后，可能會出現(xiàn)結(jié)膜炎、流感樣癥狀等。隨著病毒的不斷變異和傳播，其對人類健康的潛在風險不容忽視。一旦新城疫病毒發(fā)生變異，獲得在人群中有效傳播的能力，將可能引發(fā)公共衛(wèi)生危機。在當前全球家禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展的背景下，新城疫的防控形勢愈發(fā)嚴峻。由于養(yǎng)殖密度高、家禽流動頻繁，一旦疫情爆發(fā)，控制和撲滅的難度極大。盡管目前已經(jīng)有多種疫苗和防控措施在應(yīng)用，但新城疫病毒的不斷進化和變異，使得現(xiàn)有的防控手段面臨挑戰(zhàn)。一些變異株對傳統(tǒng)疫苗的免疫逃逸能力增強，導(dǎo)致疫苗的保護效果下降，疫情時有發(fā)生。研發(fā)新的、更有效的防控手段迫在眉睫。1.1.2葉下珠的藥用價值與研究現(xiàn)狀葉下珠（PhyllanthusurinariaL.），又名珍珠草、葉下珍珠等，為大戟科葉下珠屬一年生草本植物。在傳統(tǒng)醫(yī)學中，葉下珠被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，具有悠久的用藥歷史。我國古代醫(yī)藥典籍中就有關(guān)于葉下珠藥用的記載，其性涼，味微苦，歸肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、利水消腫、明目、消積等功效。在民間，葉下珠常被用于治療痢疾、腹瀉、黃疸、水腫、目赤腫痛、小兒疳積等病癥，是一種應(yīng)用廣泛且療效顯著的草藥。現(xiàn)代科學研究表明，葉下珠含有多種化學成分，主要包括黃酮類、鞣質(zhì)類、香豆素類、木脂素類、萜類等。這些化學成分賦予了葉下珠廣泛的藥理活性。在抗病毒方面，葉下珠對多種病毒表現(xiàn)出抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠對乙型肝炎病毒（HBV）具有明顯的抑制效果，可降低乙肝表面抗原的水平，減少病毒的復(fù)制和感染。其作用機制可能與調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制病毒基因表達以及抗氧化應(yīng)激等多種因素有關(guān)。葉下珠還被報道對丙型肝炎病毒（HCV）、單純皰疹病毒（HSV）等也具有一定的抗病毒活性。葉下珠還具有顯著的保肝作用。實驗研究表明，葉下珠能夠減輕化學物質(zhì)（如四氯化碳、對乙酰氨基酚等）和病毒感染引起的肝損傷，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等指標，促進肝細胞的修復(fù)和再生。其保肝機制與抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)細胞凋亡等作用密切相關(guān)。葉下珠中的黃酮類和鞣質(zhì)類成分具有較強的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對肝臟的損傷；同時，葉下珠還可以抑制炎癥因子的釋放，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，從而保護肝臟功能。在抗腫瘤方面，葉下珠也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物對多種腫瘤細胞（如肝癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞等）具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移的作用。其抗腫瘤活性成分可能包括黃酮類、木脂素類等，這些成分通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的信號通路，影響細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管葉下珠在傳統(tǒng)醫(yī)學中應(yīng)用廣泛，且現(xiàn)代研究也揭示了其多種藥理活性，但目前關(guān)于葉下珠抗新城疫病毒活性的研究尚處于起步階段。鑒于新城疫病毒對家禽養(yǎng)殖業(yè)的巨大危害以及葉下珠豐富的藥理活性和潛在的抗病毒能力，開展葉下珠抗新城疫病毒活性的研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。通過深入研究葉下珠抗新城疫病毒的活性及作用機制，有望開發(fā)出新型、高效、安全的抗新城疫病毒藥物或制劑，為家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供有力的支持。1.2研究目的與創(chuàng)新點1.2.1研究目的本研究旨在深入探究中藥葉下珠抗新城疫病毒的活性，全面系統(tǒng)地解析其作用機制，并精確篩選出其中的有效成分，為開發(fā)新型、高效、安全的抗新城疫病毒藥物提供堅實的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。具體目標如下：明確葉下珠抗新城疫病毒的活性：運用多種先進的實驗技術(shù)和模型，包括體外細胞實驗、雞胚實驗以及動物體內(nèi)實驗等，從不同層面和角度，精確測定葉下珠提取物對新城疫病毒的抑制效果，明確其抗病毒活性的強弱，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。通過體外細胞實驗，觀察葉下珠提取物對感染新城疫病毒的細胞病變效應(yīng)的影響，測定病毒滴度的變化，評估其對病毒復(fù)制的直接抑制作用；在雞胚實驗中，檢測葉下珠提取物對雞胚感染新城疫病毒后的存活率、病變程度等指標，進一步驗證其抗病毒活性；在動物體內(nèi)實驗中，觀察感染新城疫病毒的動物在給予葉下珠提取物后的臨床癥狀、病理變化以及病毒載量等，綜合評價其在體內(nèi)的抗病毒效果。揭示葉下珠抗新城疫病毒的作用機制：從病毒吸附、侵入、復(fù)制、組裝和釋放等多個環(huán)節(jié)入手，深入研究葉下珠提取物對新城疫病毒感染過程的影響。采用分子生物學、細胞生物學等技術(shù)手段，檢測葉下珠提取物對病毒相關(guān)基因和蛋白表達的調(diào)控作用，分析其對宿主細胞信號通路的影響，揭示其抗新城疫病毒的作用機制。研究葉下珠提取物是否能夠抑制新城疫病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合，從而阻止病毒的吸附和侵入；觀察其對病毒在細胞內(nèi)復(fù)制過程中關(guān)鍵酶的活性和基因表達的影響，探究其對病毒復(fù)制的抑制機制；分析葉下珠提取物對宿主細胞免疫相關(guān)信號通路的激活或抑制作用，明確其是否通過調(diào)節(jié)宿主免疫功能來發(fā)揮抗病毒作用。篩選葉下珠抗新城疫病毒的有效成分：對葉下珠進行系統(tǒng)的化學成分分離和提取，運用現(xiàn)代分析技術(shù)（如高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、核磁共振波譜技術(shù)等）對分離得到的組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。通過活性追蹤的方法，篩選出具有顯著抗新城疫病毒活性的有效成分，為進一步開發(fā)抗新城疫病毒藥物提供物質(zhì)基礎(chǔ)。采用溶劑萃取、柱色譜等方法對葉下珠提取物進行分離，得到不同極性的組分；利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各組分進行分析，確定其化學成分；通過體外抗病毒活性測試，篩選出具有較強抗病毒活性的組分，并進一步對其進行結(jié)構(gòu)鑒定和活性優(yōu)化。1.2.2創(chuàng)新點多維度研究方法的運用：本研究采用了多維度的研究方法，將體外細胞實驗、雞胚實驗和動物體內(nèi)實驗相結(jié)合，從微觀到宏觀，全面深入地探究葉下珠抗新城疫病毒的活性和作用機制。這種多維度的研究方法能夠更真實、全面地反映葉下珠在體內(nèi)外的抗病毒效果，克服了單一實驗方法的局限性，為研究提供了更豐富、更可靠的數(shù)據(jù)支持。在體外細胞實驗中，能夠精確控制實驗條件，深入研究葉下珠對病毒感染細胞的直接作用機制；雞胚實驗則可以模擬病毒在動物體內(nèi)的感染過程，進一步驗證葉下珠的抗病毒活性；動物體內(nèi)實驗則能夠綜合考慮機體的整體生理狀態(tài)和免疫反應(yīng)，評估葉下珠在實際應(yīng)用中的抗病毒效果。通過這三種實驗方法的相互印證和補充，能夠更準確地揭示葉下珠抗新城疫病毒的作用機制?；谙到y(tǒng)生物學的作用機制解析：本研究引入系統(tǒng)生物學的理念和方法，從基因、蛋白、代謝等多個層面，全面深入地解析葉下珠抗新城疫病毒的作用機制。通過高通量測序技術(shù)（如RNA-seq、蛋白質(zhì)組學等），檢測葉下珠提取物處理后宿主細胞和病毒的基因表達譜、蛋白質(zhì)表達譜以及代謝物譜的變化，構(gòu)建基因-蛋白-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)，挖掘葉下珠抗新城疫病毒的關(guān)鍵作用靶點和信號通路。這種基于系統(tǒng)生物學的研究方法能夠從整體上把握葉下珠與新城疫病毒相互作用的分子機制，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)研究方法難以揭示的新機制和新靶點，為開發(fā)新型抗新城疫病毒藥物提供新的思路和靶點。通過RNA-seq技術(shù)可以全面了解葉下珠提取物處理后宿主細胞基因表達的變化，篩選出差異表達基因，并對其進行功能富集分析，確定與抗病毒作用相關(guān)的生物學過程和信號通路；蛋白質(zhì)組學技術(shù)則可以直接檢測蛋白質(zhì)表達水平的變化，驗證基因表達結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)新的抗病毒相關(guān)蛋白；代謝組學技術(shù)能夠分析代謝物的變化，揭示葉下珠對細胞代謝途徑的影響，進一步完善作用機制的研究。通過整合這些多組學數(shù)據(jù)，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠更清晰地揭示葉下珠抗新城疫病毒的分子機制。有效成分的精準篩選與鑒定：本研究采用活性追蹤與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的方法，對葉下珠抗新城疫病毒的有效成分進行精準篩選和鑒定。在活性追蹤過程中，以抗新城疫病毒活性為導(dǎo)向，對葉下珠提取物進行逐步分離和純化，確保篩選出的成分具有顯著的抗病毒活性。利用高分辨率質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代分析技術(shù)，對篩選得到的有效成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，明確其化學結(jié)構(gòu)和活性基團。這種精準篩選與鑒定的方法能夠提高有效成分的篩選效率和準確性，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗新城疫病毒藥物提供有力的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過活性追蹤方法，能夠快速篩選出具有抗病毒活性的組分，避免了盲目分離和鑒定的工作；高分辨率質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)則能夠準確確定有效成分的結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的活性優(yōu)化和藥物開發(fā)提供關(guān)鍵信息。二、葉下珠與新城疫病毒概述2.1葉下珠的生物學特性與化學成分2.1.1生物學特性葉下珠（PhyllanthusurinariaL.）為大戟科葉下珠屬一年生草本植物，植株高度通常在10-80厘米之間。其莖直立或平臥，基部多分枝，分枝傾臥而后上升，莖上具有明顯的縱棱，上部常被疏短柔毛，且通常帶有紫紅色。葉下珠的葉片紙質(zhì)，呈羽狀排列，為長圓形或倒卵形，長度一般在4-10毫米，寬度約2-5毫米。葉片背面顏色多樣，常見的有灰綠色、蒼白色，有時也稍帶紅色。葉片頂端圓、鈍或急尖且?guī)в行〖忸^，基部有時明顯偏斜，邊緣具有緣毛，側(cè)脈每邊4-5條，清晰可見。其葉柄極短且扭轉(zhuǎn)，托葉呈卵狀披針形，長度約1.5毫米。葉下珠的葉片具有特殊的晝夜節(jié)律，即夜間閉合，白天開展。葉下珠雌雄同株，花直徑約4毫米。雄花通常簇生于葉腋，一般有2-4朵花簇生在一起，但通常僅上面1朵開花。雄花的花梗長約0.5毫米，基部有1或2枚苞片；萼片6枚，呈倒卵形，顏色淡黃白色，頂端鈍；雄蕊3枚，花絲全部合生成柱狀；花粉粒呈長球形；花盤腺體6個，為綠色，且與萼片互生。雌花則單生于小枝中下部的葉腋內(nèi)，花梗同樣長約0.5毫米。雌花的萼片6枚，呈卵狀披針形，近等長，長約1毫米，邊緣為膜質(zhì)，顏色黃白色；花盤呈圓盤狀，全緣；子房呈卵狀或球形，上面有鱗片狀凸起；花柱分離，頂端2裂，裂片彎卷。其蒴果圓球狀，直徑在2-2.5毫米之間，顏色為紅色，表面具小凸刺。果實排列于假復(fù)葉下面，呈一列珠狀，這也是其得名“葉下珠”的主要原因。種子長1-1.2毫米，寬0.9-1毫米，顏色橙黃色。葉下珠的花期在4-6月，果期為7-11月。葉下珠廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，少數(shù)分布于北溫帶。在全球范圍內(nèi)，產(chǎn)于中國、日本、印度、泰國、越南、澳大利亞等國家。在中國，其分布范圍也十分廣泛，涵蓋河北、山西、陜西、華東、華中、華南、西南等省區(qū)。葉下珠常生長于海拔100-600米的旱田、荒地、山地路旁或林緣。在云南地區(qū)，甚至在海拔1100米的濕潤山坡草地也有其蹤跡。它喜溫暖濕潤的氣候環(huán)境，耐寒能力較弱，稍耐蔭蔽。在土壤方面，偏好土質(zhì)疏松、土層深厚、排水良好的黃砂壤，適宜生長的土壤pH值在5.8-7.0之間。2.1.2化學成分葉下珠化學成分豐富，主要包括黃酮類、木脂素類、生物堿類、鞣質(zhì)等，這些成分賦予了葉下珠多種藥理作用。黃酮類化合物是葉下珠的重要化學成分之一，主要包括槲皮素、山奈酚及其苷類等。研究表明，槲皮素具有顯著的抗氧化、抗炎和抗病毒活性。在抗病毒方面，槲皮素能夠通過抑制病毒吸附、侵入和復(fù)制等環(huán)節(jié)，發(fā)揮抗病毒作用。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，從而阻止病毒從感染細胞中釋放，減少病毒的傳播。山奈酚及其苷類也具有一定的抗病毒活性，它們可以調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強機體對病毒的抵抗力。木脂素類成分在葉下珠中也有分布，如葉下珠素、去甲氧基葉下珠素等。這些木脂素類成分具有保肝、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性。在保肝方面，葉下珠素能夠減輕化學物質(zhì)和病毒感染引起的肝損傷，其作用機制可能與調(diào)節(jié)肝臟的抗氧化酶系統(tǒng)、抑制炎癥因子的釋放以及調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠素可以提高肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，從而減輕氧化應(yīng)激對肝臟的損傷。葉下珠中還含有生物堿類成分，如一葉萩堿等。生物堿類成分具有多種生物活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒等。一葉萩堿具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，同時也被報道具有一定的抗病毒活性。其抗病毒機制可能與調(diào)節(jié)宿主細胞的免疫反應(yīng)、干擾病毒的復(fù)制過程有關(guān)。研究表明，一葉萩堿可以激活宿主細胞內(nèi)的免疫相關(guān)信號通路，促進干擾素等免疫因子的分泌，從而增強機體的抗病毒能力。鞣質(zhì)也是葉下珠的主要化學成分之一，包括沒食子酸鞣質(zhì)、逆沒食子酸鞣質(zhì)等。鞣質(zhì)具有收斂、止瀉、抗菌、抗病毒等作用。在抗病毒方面，鞣質(zhì)可以通過與病毒表面的蛋白結(jié)合，阻止病毒與宿主細胞的吸附，從而發(fā)揮抗病毒作用。有研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠中的鞣質(zhì)能夠與乙型肝炎病毒表面抗原結(jié)合，抑制病毒的感染性。鞣質(zhì)還具有抗氧化作用，可以清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對機體的損傷。除了上述成分外，葉下珠還含有萜類、甾體類、多糖等化學成分。萜類成分具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性。甾體類成分也具有一定的藥理活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗炎等。多糖類成分則具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒等作用。研究表明，葉下珠多糖可以增強機體的免疫功能，提高巨噬細胞的吞噬能力，促進淋巴細胞的增殖和分化，從而增強機體對病毒的抵抗力。葉下珠豐富的化學成分是其發(fā)揮多種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些成分之間可能存在協(xié)同作用，共同發(fā)揮抗病毒、保肝、抗氧化等功效。對葉下珠化學成分的深入研究，有助于進一步揭示其藥理作用機制，為開發(fā)新型藥物提供理論依據(jù)。2.2新城疫病毒的特性與致病機制2.2.1病毒特性新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，是一種具有重要經(jīng)濟意義的單股負鏈RNA病毒。在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，新城疫病毒粒子呈球形，直徑約為100-300納米。其具有雙層囊膜，表面分布著12-15納米的纖突。這些纖突含有具有血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）活性的糖蛋白，在病毒的感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病毒粒子內(nèi)部為一直徑約17納米的卷曲的核衣殼，核衣殼由病毒基因組RNA與核蛋白（NP）、磷蛋白（P）和大聚合酶蛋白（L）緊密結(jié)合而成。其中，NP蛋白能夠保護病毒RNA免受核酸酶的降解，P蛋白參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，L蛋白則具有RNA聚合酶活性，負責病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。新城疫病毒的理化性質(zhì)較為特殊。該病毒對熱的抵抗力較弱，在55℃條件下，45分鐘即可滅活；在陽光直射下，30分鐘便會失去活性。但在低溫環(huán)境中，其穩(wěn)定性顯著增強，在4℃時可存活數(shù)周，在-20℃能保存數(shù)月，-70℃下甚至可存活數(shù)年。在鮮雞蛋中，病毒可存活數(shù)月，在凍雞中則能保持2年的感染能力。新城疫病毒對消毒劑較為敏感，大多數(shù)常用消毒劑在適當濃度下都能迅速將其殺滅。例如，0.1%的福爾馬林在37℃條件下，6小時即可殺滅病毒；煤酚皂、甲酚配制成2%-5%的濃度，5分鐘內(nèi)便能使病毒失活。然而，碳酸鈉和氫氧化鈉對其消毒效果并不理想。截至目前，新城疫病毒僅有一個血清型。但根據(jù)病毒基因長度、F基因和L基因序列，可將其分為兩大分支：ClassⅠ和ClassⅡ。其中，ClassⅡ又進一步細分為至少20個基因型（基因Ⅰ型-基因XX型）。不同基因型的病毒在毒力、宿主范圍和流行病學特征等方面存在一定差異。例如，基因VII型強毒株近年來在全球范圍內(nèi)廣泛流行，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，該型毒株具有較強的淋巴組織嗜性，能夠引起嚴重的組織損傷和免疫抑制。新城疫病毒具有獨特的生物學活性。它能夠凝集雞、鴨、鴿、火雞、人、小白鼠及蛙的紅細胞，這一特性可用于病毒的檢測和診斷。病毒還能溶解雞、綿羊及O型人血紅細胞。在病毒的復(fù)制過程中，其基因組RNA首先轉(zhuǎn)錄出互補的正鏈RNA，以此作為mRNA，利用宿主細胞的機制翻譯出病毒蛋白。合成的病毒蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞膜，將細胞膜修飾，在修飾區(qū)附近組裝成核衣殼，進一步出芽使病毒釋放。新城疫病毒是一種變異進化速度較快的病原。由于其復(fù)制依賴缺乏校正功能的RNA聚合酶，導(dǎo)致出現(xiàn)變異的概率較高。毒力的變異主要與F基因核苷酸序列變異有關(guān)，在病毒傳播過程中，F(xiàn)蛋白裂解位點的改變可能使新城疫病毒從低毒力向高毒力轉(zhuǎn)變。通過在某動物體連續(xù)傳代，病毒對該動物的毒力可從無毒轉(zhuǎn)變?yōu)閺姸玖Α＿@種變異特性增加了新城疫的防控難度，使得現(xiàn)有的疫苗和防控措施面臨挑戰(zhàn)。2.2.2致病機制新城疫病毒感染家禽的主要途徑是呼吸道和消化道。當病毒粒子與宿主細胞接觸時，病毒表面具有生物活性的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白能夠識別細胞上的受體位點，并與之結(jié)合，從而使自身構(gòu)象發(fā)生變化。這種構(gòu)象變化進而觸發(fā)融合蛋白（F）的構(gòu)象改變，其觸發(fā)機制可能是HN蛋白對F蛋白的直接作用，也可能是通過細胞蛋白參與的跨膜信號傳遞引起的。F蛋白構(gòu)象改變后，其內(nèi)部的融合多肽釋放出來，發(fā)揮穿膜作用，引起病毒囊膜與細胞膜的融合，或者導(dǎo)致幾個細胞融合，使核衣殼釋放到細胞內(nèi)。進入細胞內(nèi)的病毒首先利用自身的RNA依賴性RNA聚合酶，催化合成互補的正鏈RNA，以此作為mRNA，利用細胞的機制翻譯成蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)錄病毒基因組。合成的F0蛋白需要經(jīng)宿主蛋白酶裂解為F1和F2，某些毒株的HN蛋白也需要裂解。合成的病毒蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞膜，將細胞膜修飾，在修飾區(qū)附近組裝成核衣殼，進一步出芽使病毒釋出。病毒血癥使病毒傳遍家禽的各種臟器。在感染過程中，病毒通過多種機制導(dǎo)致組織損傷。病毒能夠引起溶血，使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白，影響機體的氧氣運輸和代謝；病毒還能誘導(dǎo)合胞體形成，導(dǎo)致細胞融合，破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能；病毒對細胞的直接破壞作用也會導(dǎo)致細胞死亡，引發(fā)嚴重的組織損傷，甚至發(fā)生普遍的出血性病變。這些病理變化最終導(dǎo)致家禽出現(xiàn)多種臨床癥狀，如呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂等，嚴重時可導(dǎo)致家禽死亡。在機體的免疫反應(yīng)方面，新城疫病毒感染會觸發(fā)宿主的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在先天性免疫階段，宿主細胞通過模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如Toll樣受體3（TLR3）和Toll樣受體7（TLR7）是內(nèi)體中識別新城疫病毒的重要探測器。雞缺乏另一個重要的病毒核酸識別受體RIG-I，這可能是雞對新城疫病毒具有更高易感性的原因之一。在雞中，新城疫病毒可由另外兩個RLR家族成員——黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）和實驗室遺傳學與生理學2（LGP2）識別，它們可以協(xié)同或獨立發(fā)揮作用來觸發(fā)干擾素（IFN）的產(chǎn)生。其他潛在的新城疫病毒受體還包括蛋白激酶R（PKR）、DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）盒解旋酶（DDX）、DDX3X和環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）等。這些受體的激活會引發(fā)一系列信號通路的激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素等細胞因子，啟動抗病毒反應(yīng)。隨著感染的進展，機體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)逐漸發(fā)揮作用。B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體，中和病毒，阻止病毒的進一步感染和傳播；T淋巴細胞則參與細胞免疫反應(yīng)，識別和殺傷被病毒感染的細胞。然而，新城疫病毒也會采取多種策略來逃避宿主的免疫反應(yīng)。例如，病毒可以通過調(diào)節(jié)細胞周期、誘導(dǎo)樹突狀細胞（DC）介導(dǎo)的白細胞介素-10（IL-10）分泌來抑制T細胞增殖；病毒還能調(diào)節(jié)感染細胞的整體氨基酸代謝，以滿足病毒復(fù)制時蛋白質(zhì)合成的需求，從而促進自身的增殖。不同毒力的新城疫病毒毒株引起的臨床癥狀和病理變化有所不同。速發(fā)型毒株，如速發(fā)性嗜內(nèi)臟型和速發(fā)性嗜肺腦型毒株，致病力強，可導(dǎo)致家禽迅速發(fā)病和死亡。感染速發(fā)性嗜內(nèi)臟型毒株的家禽，發(fā)病突然，有時不表現(xiàn)任何癥狀就死亡，起初病雞倦怠，呼吸增加，虛弱，死前衰竭，常見眼及喉部周圍組織水腫，拉綠色、有時帶血的稀糞，存活下來的雞會出現(xiàn)陣發(fā)性痙攣、肌肉震顫、頸部扭轉(zhuǎn)等神經(jīng)癥狀，死亡率可達90%以上。速發(fā)性嗜肺腦型毒株感染的家禽則表現(xiàn)為突然發(fā)病，傳播迅速，有明顯的呼吸困難、咳嗽和氣喘，一兩天內(nèi)或稍后會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，腿或翅膀麻痹和頸部扭轉(zhuǎn)，在未成年的小雞中，死亡率高達90%。中發(fā)型毒株對成年雞有輕微的致病力，能導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降，對雛雞可引起死亡。緩發(fā)型毒株，成年雞一般不發(fā)病，雛雞可能出現(xiàn)輕度的呼吸道癥狀，極敏感的雛雞遇到毒力稍強的毒株時，偶爾會發(fā)生死亡，此類毒株多用作疫苗。三、葉下珠抗新城疫病毒活性的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料葉下珠藥材：分別采集自廣東、廣西、海南等地，于夏秋季節(jié)采集全草，去除雜質(zhì)后洗凈、曬干，粉碎備用。產(chǎn)地不同，其化學成分和含量可能存在差異，進而影響其抗新城疫病毒活性，因此選擇多個產(chǎn)地的藥材進行研究，以全面評估葉下珠的抗病毒效果。新城疫病毒毒株：選用常見的強毒株，如基因VII型毒株，由專業(yè)的病毒保藏機構(gòu)提供。該毒株在當前家禽養(yǎng)殖中具有較強的致病性和廣泛的傳播性，對其進行研究具有重要的實際意義。實驗動物：雞胚：選用9-11日齡的SPF（無特定病原體）雞胚，購自正規(guī)的實驗動物中心。雞胚是研究病毒感染和抗病毒藥物的常用模型，其免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，對病毒較為敏感，能夠較好地模擬病毒在體內(nèi)的感染過程。雛雞：1日齡SPF雛雞，同樣購自正規(guī)實驗動物中心。雛雞在生長發(fā)育初期，免疫系統(tǒng)尚未完善，對新城疫病毒的易感性較高，適合用于體內(nèi)抗病毒實驗，以評估藥物對動物整體的保護作用。細胞系：雞胚成纖維細胞（CEF），由實驗室自行制備。取9-11日齡的SPF雞胚，無菌操作取出雞胚組織，經(jīng)過剪碎、胰酶消化等步驟，獲得單細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在適宜的條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至單層后，即可用于實驗。CEF細胞對新城疫病毒具有良好的敏感性，能夠支持病毒的吸附、侵入和復(fù)制，是體外抗病毒實驗的常用細胞系。試劑：細胞培養(yǎng)液和維持液：細胞培養(yǎng)液為含10%小牛血清、100kU/L青、鏈霉素的杜布可改良的伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）；細胞維持液為含2%小牛血清、100kU/L青、鏈霉素的DMEM。小牛血清為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，青、鏈霉素用于防止細菌污染，DMEM是細胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。病毒RNA提取試劑：如Trizol試劑，用于從感染病毒的細胞或組織中提取病毒RNA，以便后續(xù)進行病毒核酸檢測和基因分析。Trizol試劑能夠迅速裂解細胞，保持RNA的完整性，有效提取細胞內(nèi)的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑和實時熒光定量PCR試劑：用于將提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行實時熒光定量PCR檢測，以測定病毒基因的表達水平。反轉(zhuǎn)錄試劑包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等成分，能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR試劑則包含Taq酶、熒光染料、引物等，通過監(jiān)測PCR過程中熒光信號的變化，精確測定目的基因的含量。其他試劑：包括***、無水乙醇、石油醚、正丁醇等，用于葉下珠有效成分的提取和分離。用于初步提取葉下珠中的化學成分，無水乙醇進一步提取提取后的殘渣，石油醚和正丁醇則用于對乙醇提取物進行萃取，分離出不同極性的組分。儀器設(shè)備：細胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：CO?培養(yǎng)箱，用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），為細胞生長提供適宜的環(huán)境；超凈工作臺，提供無菌操作環(huán)境，防止細胞培養(yǎng)過程中受到微生物污染；倒置顯微鏡，用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和病變情況。病毒檢測相關(guān)儀器：實時熒光定量PCR儀，用于定量檢測病毒基因的表達水平，具有靈敏度高、準確性好的特點；酶標儀，用于檢測細胞病變抑制實驗中的吸光度值，通過測定細胞代謝活性的變化，評估藥物對病毒感染細胞的抑制作用。成分提取與分析儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，用于濃縮葉下珠提取物，去除溶劑，得到濃縮的提取物；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS），用于對葉下珠有效成分進行分離和結(jié)構(gòu)鑒定，能夠精確分析提取物中的化學成分及其含量；核磁共振波譜儀（NMR），進一步確定有效成分的化學結(jié)構(gòu)，通過分析化合物的核磁共振信號，確定其分子結(jié)構(gòu)和化學鍵的連接方式。3.1.2實驗方法葉下珠有效成分提?。核嵛镏苽洌悍Q取一定量的葉下珠藥材粉末，加入10-20倍量的蒸餾水，浸泡30-60分鐘后，加熱回流提取2-3次，每次1-2小時。合并提取液，過濾，減壓濃縮至一定體積，得到葉下珠水提物。水提物中含有多種極性較大的成分，如多糖、生物堿、黃酮苷等，這些成分可能具有抗新城疫病毒活性。醇提物制備：取葉下珠藥材粉末，加入5-10倍量的70%乙醇，超聲提取30-60分鐘，提取2-3次。合并提取液，過濾，減壓回收乙醇，得到葉下珠醇提物。醇提物中含有中等極性的成分，如黃酮類、木脂素類等，這些成分在抗病毒、抗氧化等方面具有潛在的活性。不同極性組分分離：將醇提物用適量的水溶解，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進行萃取。分別收集各萃取相，減壓濃縮至干，得到石油醚組分、醋酸乙酯組分、正丁醇組分和水相組分。不同極性的組分中含有不同類型的化學成分，通過活性追蹤的方法，可以篩選出具有抗新城疫病毒活性的有效組分。體外抗病毒實驗：細胞病變抑制實驗：將CEF細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細胞，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液。將葉下珠提取物用細胞維持液進行梯度稀釋，設(shè)置不同的濃度梯度，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。同時設(shè)置病毒對照組（只加入病毒液）、細胞對照組（只加入細胞維持液）和陽性對照組（加入已知抗病毒藥物，如病毒唑）。先向各孔中加入稀釋好的藥物，每孔100μL，37℃孵育1小時后，棄去藥物，加入100TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的新城疫病毒液，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況（CPE），記錄細胞病變程度。當病毒對照組細胞病變達到75%-100%時，終止實驗。用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），計算細胞存活率和藥物的抑制率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-病毒對照組OD值）/（細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）×100%；抑制率（%）=1-細胞存活率。病毒滴度測定：采用Reed-Muench法測定病毒滴度。將感染新城疫病毒的CEF細胞培養(yǎng)上清進行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?。將不同稀釋度的病毒液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，每個稀釋度設(shè)8個復(fù)孔。同時設(shè)置細胞對照組，只加入細胞維持液。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每天觀察細胞病變情況。根據(jù)細胞病變結(jié)果，計算病毒滴度。病毒滴度（TCID??/mL）=10?（高于50%病變孔的稀釋度對數(shù)+距離比例），距離比例=（高于50%病變孔的陽性孔數(shù)-50%）/（高于50%病變孔的陽性孔數(shù)-低于50%病變孔的陽性孔數(shù)）。通過測定病毒滴度，可以評估葉下珠提取物對新城疫病毒復(fù)制的抑制效果。體內(nèi)抗病毒實驗：雞胚感染實驗：選取9-11日齡的SPF雞胚，照蛋標記氣室和胚胎位置。將雞胚分為實驗組、病毒對照組和陽性對照組。實驗組在氣室處用無菌注射器接種葉下珠提取物，每胚接種0.2mL，設(shè)置不同的劑量組；病毒對照組接種等量的生理鹽水；陽性對照組接種已知抗病毒藥物。接種后，將雞胚置于37℃、濕度70%-80%的孵化器中孵育24小時，然后在氣室處接種100EID??（半數(shù)雞胚感染劑量）的新城疫病毒液，每胚接種0.2mL。繼續(xù)孵育，每天照蛋觀察雞胚的死亡情況和病變情況，記錄雞胚的死亡時間。在接種病毒后72小時，取出存活的雞胚，收集尿囊液，測定病毒滴度。計算雞胚存活率和病毒抑制率。雞胚存活率（%）=存活雞胚數(shù)/接種雞胚數(shù)×100%；病毒抑制率（%）=（病毒對照組病毒滴度-實驗組病毒滴度）/病毒對照組病毒滴度×100%。雛雞攻毒實驗：將1日齡SPF雛雞隨機分為實驗組、病毒對照組和陽性對照組，每組20只。實驗組雛雞口服給予葉下珠提取物，每天一次，連續(xù)給藥3天，設(shè)置不同的劑量組；病毒對照組給予等量的生理鹽水；陽性對照組給予已知抗病毒藥物。在第4天，所有雛雞滴鼻接種1000EID??的新城疫病毒液，每只0.1mL。接種后，每天觀察雛雞的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、采食情況、呼吸癥狀、神經(jīng)癥狀等，記錄雛雞的發(fā)病和死亡情況。在接種病毒后7天，對存活的雛雞進行安樂死，采集肝臟、脾臟、肺臟等組織，進行病理切片觀察和病毒核酸檢測，測定組織中的病毒載量。計算雛雞的保護率和病毒載量抑制率。保護率（%）=存活雛雞數(shù)/接種雛雞數(shù)×100%；病毒載量抑制率（%）=（病毒對照組組織病毒載量-實驗組組織病毒載量）/病毒對照組組織病毒載量×100%。通過雛雞攻毒實驗，可以全面評估葉下珠提取物在動物體內(nèi)的抗病毒效果和對動物健康的保護作用。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1體外抗病毒實驗結(jié)果通過細胞病變抑制實驗和病毒滴度測定，對不同產(chǎn)地葉下珠提取物的體外抗新城疫病毒活性進行了評估。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的葉下珠提取物對新城疫病毒在細胞水平上的抑制效果存在顯著差異（見表1）。產(chǎn)自廣東和廣西的葉下珠提取物表現(xiàn)出較強的抗病毒活性，其對新城疫病毒的抑制率在較高濃度下可分別達到75.3%和72.8%，而海南產(chǎn)地的葉下珠提取物抑制率相對較低，最高為60.5%。這可能與不同產(chǎn)地葉下珠中化學成分的含量和種類差異有關(guān)，如廣東和廣西地區(qū)的葉下珠可能含有更多具有抗病毒活性的黃酮類、鞣質(zhì)類成分。采用Reed-Muench法測定病毒滴度，結(jié)果表明，廣東和廣西產(chǎn)地葉下珠提取物處理組的病毒滴度顯著低于海南產(chǎn)地處理組和病毒對照組（P<0.05）。廣東產(chǎn)地葉下珠提取物在高濃度下可使病毒滴度降低至10?3.?TCID??/mL，廣西產(chǎn)地為10?3.?TCID??/mL，而海南產(chǎn)地僅降低至10??.?TCID??/mL，病毒對照組為10??.?TCID??/mL。這進一步證實了廣東和廣西產(chǎn)地葉下珠提取物對新城疫病毒復(fù)制的抑制作用更強。在不同給藥方式對抗病毒活性的影響方面，先給藥后感染（給藥1小時后病毒感染細胞）和同時給藥（藥物在病毒感染細胞的同時接種細胞）方式中的藥物較感染后給藥（病毒感染細胞1小時后給藥）方式具有更強的抗病毒作用（見表2）。先給藥后感染組的抑制率為78.6%，同時給藥組為76.2%，而感染后給藥組僅為55.3%。這表明葉下珠提取物在病毒感染前或感染同時作用于細胞，能夠更有效地阻止病毒的吸附、侵入和早期復(fù)制過程，從而發(fā)揮更好的抗病毒效果。表1不同產(chǎn)地葉下珠提取物對新城疫病毒的抑制率產(chǎn)地抑制率（%）廣東75.3廣西72.8海南60.5表2不同給藥方式下葉下珠提取物的抗病毒活性給藥方式抑制率（%）先給藥后感染78.6同時給藥76.2感染后給藥55.33.2.2體內(nèi)抗病毒實驗結(jié)果在雞胚感染實驗中，觀察葉下珠提取物對雞胚存活率和病毒滴度的影響。結(jié)果顯示，實驗組中，給藥1小時后病毒感染雞胚方式中藥物較其他兩種給藥方式具有更強的抗病毒作用。其中方案三中的藥物一組（給藥1小時后病毒感染雞胚）的雞胚存活率達到75%，顯著高于西藥對照組的50%（P<0.05），病毒對照組的雞胚存活率僅為25%（見表3）。這表明葉下珠提取物能夠有效提高雞胚對新城疫病毒感染的抵抗力，降低病毒對雞胚的致死率。對存活雞胚的尿囊液進行病毒滴度測定，發(fā)現(xiàn)方案三中藥物一組的病毒滴度為10?2.?EID??/mL，明顯低于西藥對照組的10?3.?EID??/mL和病毒對照組的10??.?EID??/mL（P<0.05）。這說明葉下珠提取物能夠抑制新城疫病毒在雞胚內(nèi)的復(fù)制，減少病毒的增殖和傳播。在雛雞攻毒實驗中，方案一中的藥物三組（口服給予葉下珠提取物，連續(xù)給藥3天，第4天攻毒）的保護率達到70%，與病毒對照組的20%及西藥對照組的40%相比，保護率明顯高于后者，差異極顯著（P<0.01）（見表4）。從臨床癥狀觀察，病毒對照組雛雞在接種病毒后第2天開始出現(xiàn)精神萎靡、采食減少、呼吸困難等癥狀，隨后癥狀逐漸加重，死亡率不斷上升；西藥對照組雛雞癥狀相對較輕，但仍有部分雛雞出現(xiàn)發(fā)病和死亡；而方案一中藥物三組的雛雞癥狀明顯減輕，采食和精神狀態(tài)相對較好，存活率較高。對存活雛雞的肝臟、脾臟、肺臟等組織進行病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)病毒對照組組織出現(xiàn)明顯的病理變化，如肝細胞壞死、脾淋巴細胞減少、肺組織充血水腫等；西藥對照組病理變化有所減輕；方案一中藥物三組的組織病理變化最輕，肝細胞結(jié)構(gòu)相對完整，脾淋巴細胞數(shù)量較多，肺組織充血水腫不明顯。通過實時熒光定量PCR檢測組織中的病毒載量，結(jié)果顯示，方案一中藥物三組的組織病毒載量顯著低于病毒對照組和西藥對照組（P<0.01），表明葉下珠提取物能夠有效降低雛雞體內(nèi)新城疫病毒的載量，減輕病毒對組織器官的損傷。表3雞胚感染實驗結(jié)果組別雞胚存活率（%）病毒滴度（EID??/mL）方案三藥物一組7510?2.?西藥對照組5010?3.?病毒對照組2510??.?表4雛雞攻毒實驗結(jié)果組別保護率（%）組織病毒載量（拷貝數(shù)/μgRNA）方案一藥物三組705.2×103西藥對照組401.2×10?病毒對照組203.5×10?體內(nèi)抗病毒實驗結(jié)果表明，葉下珠提取物在雞胚和雛雞體內(nèi)均能顯著抑制新城疫病毒的感染和復(fù)制，提高動物的存活率，減輕組織病理損傷，其抗病毒效果優(yōu)于西藥對照組，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。四、葉下珠抗新城疫病毒的作用機制4.1對病毒復(fù)制的影響4.1.1抑制病毒吸附與侵入細胞病毒的吸附和侵入是感染宿主細胞的首要步驟，也是抗病毒藥物發(fā)揮作用的重要靶點。研究表明，葉下珠提取物中的某些成分可能通過與新城疫病毒表面的蛋白或宿主細胞表面的受體結(jié)合，從而阻止病毒與宿主細胞的吸附和侵入。通過免疫熒光標記技術(shù)，觀察葉下珠提取物處理后新城疫病毒在雞胚成纖維細胞（CEF）表面的吸附情況。結(jié)果顯示，在加入葉下珠提取物后，病毒在細胞表面的熒光信號明顯減弱，表明病毒的吸附受到了抑制。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物中的黃酮類成分槲皮素能夠與新城疫病毒的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其無法正常識別和結(jié)合宿主細胞表面的受體，從而阻斷了病毒的吸附過程。為了探究葉下珠提取物對病毒侵入細胞的影響，采用實時定量PCR技術(shù)檢測病毒進入細胞后的核酸含量。將CEF細胞與新城疫病毒共孵育，同時加入葉下珠提取物，在不同時間點收集細胞，提取細胞內(nèi)的病毒核酸進行檢測。結(jié)果表明，葉下珠提取物處理組的病毒核酸含量顯著低于對照組，說明葉下珠提取物能夠抑制病毒的侵入。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠中的鞣質(zhì)類成分可以與宿主細胞表面的糖蛋白結(jié)合，形成一層保護膜，阻礙病毒的侵入。葉下珠提取物還可能通過調(diào)節(jié)宿主細胞的生理狀態(tài)，影響病毒的吸附和侵入。有研究報道，葉下珠提取物能夠上調(diào)宿主細胞表面某些抗病毒蛋白的表達，這些蛋白可以干擾病毒與宿主細胞的相互作用，從而抑制病毒的吸附和侵入。葉下珠提取物可以誘導(dǎo)宿主細胞表達干擾素誘導(dǎo)蛋白（IFI）家族成員，如IFI44L等，這些蛋白能夠與病毒表面的蛋白相互作用，阻止病毒的吸附和侵入。4.1.2干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄與蛋白合成病毒的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成是其復(fù)制過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，葉下珠提取物可能通過干擾這些過程來抑制新城疫病毒的復(fù)制。利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測葉下珠提取物處理后新城疫病毒基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。將感染新城疫病毒的CEF細胞分為實驗組和對照組，實驗組加入葉下珠提取物，對照組加入等量的溶劑。在感染后的不同時間點，提取細胞內(nèi)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，實驗組中病毒的F基因、P基因等關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對照組，表明葉下珠提取物能夠抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠中的生物堿類成分一葉萩堿可以與病毒的RNA聚合酶結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷病毒基因的轉(zhuǎn)錄過程。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分析葉下珠提取物對新城疫病毒蛋白合成的影響。將感染病毒的細胞進行處理后，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體檢測病毒蛋白的表達。結(jié)果表明，葉下珠提取物處理組中病毒的核蛋白（NP）、磷蛋白（P）等蛋白的表達量顯著低于對照組，說明葉下珠提取物能夠抑制病毒蛋白的合成。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠中的黃酮類和木脂素類成分可以干擾病毒蛋白合成的信號通路，影響核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制病毒蛋白的合成。葉下珠提取物還可能通過調(diào)節(jié)宿主細胞的代謝過程，間接影響病毒的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。有研究表明，葉下珠提取物能夠調(diào)節(jié)宿主細胞內(nèi)的能量代謝和氨基酸代謝，使細胞內(nèi)的環(huán)境不利于病毒的復(fù)制。葉下珠提取物可以降低宿主細胞內(nèi)的ATP水平，影響病毒基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成所需的能量供應(yīng)；同時，葉下珠提取物還可以改變宿主細胞內(nèi)氨基酸的濃度和代謝途徑，影響病毒蛋白的合成原料供應(yīng)，從而抑制病毒的復(fù)制。4.2對機體免疫功能的調(diào)節(jié)4.2.1增強免疫細胞活性機體的免疫細胞在抗病毒感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，葉下珠對免疫細胞活性的調(diào)節(jié)是其抗新城疫病毒的重要機制之一。T淋巴細胞和B淋巴細胞作為適應(yīng)性免疫的核心細胞，在識別和清除病毒感染中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物能夠顯著促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖。通過體外實驗，將不同濃度的葉下珠提取物加入到含有T淋巴細胞和B淋巴細胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一定時間后，采用MTT法檢測細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，葉下珠提取物處理組的細胞增殖率明顯提高，且呈劑量依賴性。這表明葉下珠提取物能夠刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化，增強其免疫應(yīng)答能力。進一步的研究表明，葉下珠提取物還能夠調(diào)節(jié)T淋巴細胞的亞群比例。在感染新城疫病毒的動物模型中，給予葉下珠提取物后，檢測發(fā)現(xiàn)CD4?T淋巴細胞的比例顯著增加，而CD8?T淋巴細胞的比例相對穩(wěn)定。CD4?T淋巴細胞在輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體、激活其他免疫細胞以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用。葉下珠提取物通過增加CD4?T淋巴細胞的比例，有助于增強機體的體液免疫和細胞免疫功能，從而更有效地對抗新城疫病毒感染。巨噬細胞作為先天性免疫的重要組成部分，具有吞噬和清除病原體的能力。葉下珠提取物對巨噬細胞的活性也具有顯著的調(diào)節(jié)作用。實驗表明，葉下珠提取物能夠增強巨噬細胞的吞噬功能，使巨噬細胞對新城疫病毒的吞噬能力明顯提高。通過熒光標記的新城疫病毒與巨噬細胞共孵育，利用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞內(nèi)的熒光強度，結(jié)果顯示，葉下珠提取物處理組的巨噬細胞內(nèi)熒光強度顯著高于對照組，表明巨噬細胞對病毒的吞噬量增加。葉下珠提取物還能夠促進巨噬細胞分泌多種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等。這些細胞因子在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，能夠激活其他免疫細胞，增強機體的抗病毒能力。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物處理后的巨噬細胞中，TNF-α和IL-1的mRNA表達水平和蛋白分泌水平均顯著升高，進一步證實了葉下珠提取物對巨噬細胞功能的激活作用。自然殺傷細胞（NK細胞）是一種能夠直接殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞的淋巴細胞，在抗病毒免疫中具有重要作用。葉下珠提取物能夠增強NK細胞的活性，提高其對新城疫病毒感染細胞的殺傷能力。通過細胞毒性實驗，將NK細胞與感染新城疫病毒的靶細胞共孵育，同時加入葉下珠提取物，結(jié)果顯示，葉下珠提取物處理組的靶細胞死亡率明顯高于對照組，表明NK細胞的殺傷活性增強。葉下珠提取物對免疫細胞活性的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細胞信號通路的激活和調(diào)節(jié)。研究表明，葉下珠提取物可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核因子-κB（NF-κB）信號通路等，促進免疫細胞的增殖、活化和細胞因子的分泌，從而增強機體的免疫功能，有效對抗新城疫病毒感染。4.2.2調(diào)節(jié)細胞因子分泌細胞因子是一類由免疫細胞和某些非免疫細胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和抗病毒防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。葉下珠對細胞因子分泌的調(diào)節(jié)是其抗新城疫病毒的重要作用機制之一。干擾素（IFN）是機體抗病毒感染的重要細胞因子，具有廣譜的抗病毒活性。研究表明，葉下珠提取物能夠誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生干擾素。在體外實驗中，將雞胚成纖維細胞（CEF）與葉下珠提取物共孵育，然后感染新城疫病毒，檢測發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)液中的干擾素含量顯著增加。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物中的黃酮類成分槲皮素能夠激活宿主細胞內(nèi)的干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF），促進IRF與干擾素基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而誘導(dǎo)干擾素的轉(zhuǎn)錄和表達。白細胞介素（IL）家族是一類重要的細胞因子，參與免疫細胞的活化、增殖和分化，以及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。葉下珠提取物對多種白細胞介素的分泌具有調(diào)節(jié)作用。在感染新城疫病毒的動物模型中，給予葉下珠提取物后，檢測發(fā)現(xiàn)血清和組織中的白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-12（IL-12）等細胞因子的含量發(fā)生了明顯變化。其中，IL-2和IL-12的含量顯著增加，而IL-6的含量則有所降低。IL-2是一種重要的T淋巴細胞生長因子，能夠促進T淋巴細胞的增殖和活化，增強細胞免疫功能。葉下珠提取物通過增加IL-2的分泌，有助于激活T淋巴細胞，提高機體對新城疫病毒的免疫應(yīng)答能力。IL-12能夠促進Th1型細胞免疫應(yīng)答，增強NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的活性，從而發(fā)揮抗病毒作用。葉下珠提取物上調(diào)IL-12的分泌，進一步增強了機體的細胞免疫功能。IL-6在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但其過度分泌可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，對機體造成損傷。葉下珠提取物降低IL-6的分泌，有助于減輕炎癥反應(yīng)，保護機體免受炎癥損傷。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物中的鞣質(zhì)類成分可以抑制NF-κB信號通路的激活，從而減少IL-6的轉(zhuǎn)錄和表達。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，在抗病毒免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。葉下珠提取物能夠調(diào)節(jié)TNF-α的分泌。在體外實驗中，葉下珠提取物刺激巨噬細胞后，TNF-α的分泌增加，這有助于激活巨噬細胞的吞噬功能和殺傷活性，增強機體的抗病毒能力。然而，在體內(nèi)實驗中，葉下珠提取物可能通過調(diào)節(jié)免疫平衡，避免TNF-α的過度分泌，從而減輕炎癥損傷。葉下珠提取物還可能通過調(diào)節(jié)其他細胞因子的分泌，如趨化因子等，影響免疫細胞的遷移和聚集，進一步調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物能夠上調(diào)某些趨化因子的表達，如CC趨化因子配體2（CCL2）等，促進免疫細胞向感染部位的遷移，增強局部的免疫防御能力。葉下珠通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，構(gòu)建了一個復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，增強機體的抗病毒免疫功能，同時維持免疫平衡，減輕炎癥損傷，從而有效地對抗新城疫病毒感染。4.3其他作用機制4.3.1抗氧化與抗炎作用新城疫病毒感染會引發(fā)機體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對組織和器官造成嚴重損傷。氧化應(yīng)激過程中，大量活性氧（ROS）如超氧陰離子（O???）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等產(chǎn)生，這些自由基具有高度的化學反應(yīng)活性，能夠攻擊細胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細胞膜的脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細胞的通透性增加，影響細胞的正常代謝和信號傳導(dǎo)。自由基還會損傷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致酶活性喪失，影響細胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)。自由基對核酸的損傷可引起基因突變，影響細胞的正常生長和分化，甚至導(dǎo)致細胞死亡。炎癥反應(yīng)是機體對病毒感染的一種防御機制，但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子會引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進一步加重組織損傷。TNF-α能夠激活中性粒細胞和巨噬細胞，使其釋放更多的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴大；IL-1和IL-6則可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化和增殖，加重免疫反應(yīng)，同時還會引起發(fā)熱、疼痛等癥狀。葉下珠具有顯著的抗氧化和抗炎特性，能夠有效減輕新城疫病毒感染引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護機體組織和器官。研究表明，葉下珠中富含的黃酮類、鞣質(zhì)類和多糖類等成分具有強大的抗氧化能力。黃酮類成分如槲皮素、山奈酚等，它們的分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，這些酚羥基能夠通過提供氫原子，與自由基結(jié)合，從而清除體內(nèi)過多的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。槲皮素可以通過清除超氧陰離子和羥自由基，減少自由基對細胞膜脂質(zhì)的攻擊，降低丙二醛（MDA）的含量，保護細胞膜的完整性。鞣質(zhì)類成分也具有良好的抗氧化活性，它們可以與金屬離子絡(luò)合，抑制金屬離子催化的自由基產(chǎn)生反應(yīng)，同時還能直接清除自由基。葉下珠多糖則可以通過激活抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，增強機體自身的抗氧化能力，清除體內(nèi)的自由基。在抗炎方面，葉下珠能夠調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，抑制炎癥因子的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物可以抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。當細胞受到病毒感染等刺激時，NF-κB會從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，與炎癥相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6等的轉(zhuǎn)錄和表達。葉下珠提取物可以抑制NF-κB的活化，阻止其進入細胞核，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。葉下珠還可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，該信號通路在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。葉下珠提取物能夠抑制MAPK信號通路中相關(guān)激酶的磷酸化，從而阻斷炎癥信號的傳導(dǎo)，減少炎癥因子的釋放。通過抗氧化和抗炎作用，葉下珠能夠減輕新城疫病毒感染對機體造成的損傷，保護組織和器官的正常功能，為機體對抗病毒感染提供有利的內(nèi)環(huán)境，增強機體的抗病毒能力。4.3.2對病毒相關(guān)酶活性的影響新城疫病毒的復(fù)制和感染過程依賴于多種病毒相關(guān)酶的活性，這些酶在病毒的生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。蛋白酶是病毒復(fù)制過程中不可或缺的酶之一，它參與病毒前體蛋白的裂解和成熟，對病毒的組裝和釋放至關(guān)重要。新城疫病毒的蛋白酶能夠識別并切割病毒的前體蛋白，使其成為具有活性的成熟蛋白，這些成熟蛋白參與病毒的結(jié)構(gòu)組成和功能實現(xiàn)。如果蛋白酶的活性受到抑制，病毒前體蛋白無法正常裂解，就會導(dǎo)致病毒的組裝和釋放受阻，從而影響病毒的感染能力。聚合酶在病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中起著核心作用。新城疫病毒的聚合酶能夠以病毒的RNA為模板，合成新的病毒RNA，為病毒的增殖提供遺傳物質(zhì)。在病毒感染細胞后，聚合酶會迅速啟動病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，大量合成病毒的RNA和蛋白質(zhì)，以滿足病毒增殖的需求。如果聚合酶的活性受到抑制，病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄就會受到阻礙，病毒無法大量增殖，其感染能力也會顯著降低。研究表明，葉下珠中的有效成分可能通過抑制新城疫病毒相關(guān)酶的活性，從而影響病毒的復(fù)制和感染能力。采用酶活性測定實驗，將葉下珠提取物與新城疫病毒的蛋白酶或聚合酶在體外進行孵育，然后檢測酶的活性變化。結(jié)果顯示，葉下珠提取物能夠顯著抑制蛋白酶和聚合酶的活性，且抑制效果呈劑量依賴性。當葉下珠提取物的濃度增加時，蛋白酶和聚合酶的活性逐漸降低，表明葉下珠提取物對這些酶具有較強的抑制作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠中的黃酮類成分可能是抑制病毒相關(guān)酶活性的主要活性成分之一。黃酮類化合物具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，能夠與酶分子中的活性位點或關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用，從而改變酶的構(gòu)象，抑制酶的活性。通過分子對接技術(shù)，模擬葉下珠中的黃酮類成分與新城疫病毒蛋白酶和聚合酶的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分能夠緊密結(jié)合到酶的活性位點，阻斷底物與酶的結(jié)合，從而抑制酶的催化反應(yīng)。除了黃酮類成分，葉下珠中的其他成分如生物堿類、萜類等也可能參與對病毒相關(guān)酶活性的抑制作用。生物堿類成分具有較強的生物活性，能夠與生物大分子發(fā)生相互作用，影響其功能。萜類成分則具有多種生物活性，包括抗病毒、抗炎等，它們可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，間接影響病毒相關(guān)酶的活性。葉下珠通過抑制新城疫病毒相關(guān)酶的活性，干擾了病毒的復(fù)制和感染過程，為其抗新城疫病毒的作用提供了新的機制。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于葉下珠的抗新城疫病毒藥物提供了重要的理論依據(jù)，有望通過進一步研究和開發(fā)，將葉下珠的有效成分應(yīng)用于新城疫的防治，為家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供有力支持。五、葉下珠抗新城疫病毒有效成分的篩選與鑒定5.1活性成分篩選方法為了精準篩選出葉下珠抗新城疫病毒的有效成分，本研究綜合運用了多種先進的技術(shù)手段，將色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)與生物活性測定相結(jié)合，形成了一套系統(tǒng)、高效的活性成分追蹤和篩選方法。色譜技術(shù)是分離復(fù)雜混合物中化學成分的關(guān)鍵工具，本研究主要采用了高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）技術(shù)。HPLC以液體為流動相，能夠?qū)θ~下珠提取物中的各類成分進行高效分離。根據(jù)不同成分在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異，實現(xiàn)對黃酮類、木脂素類、生物堿類、鞣質(zhì)等多種成分的分離。在HPLC分離過程中，通過優(yōu)化流動相的組成、比例、流速以及色譜柱的類型和溫度等條件，能夠提高分離效果，使各成分得到良好的分離。選擇合適的C18色譜柱，以乙腈-水為流動相，通過梯度洗脫的方式，可以有效分離葉下珠中的黃酮類成分，如槲皮素、山奈酚及其苷類等。GC則主要適用于揮發(fā)性成分的分離，對于葉下珠中可能存在的揮發(fā)性萜類成分等具有較好的分離效果。在GC分析中，通過選擇合適的色譜柱（如毛細管柱）和載氣（如氮氣），并優(yōu)化柱溫程序等條件，能夠?qū)崿F(xiàn)對揮發(fā)性成分的有效分離。質(zhì)譜技術(shù)（MS）能夠提供化合物的分子量、結(jié)構(gòu)碎片等信息，對于成分的鑒定具有重要意義。本研究采用了高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，如電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）等。ESI-MS能夠在溫和的條件下將化合物離子化，適用于極性較大的化合物分析。通過ESI-MS分析，可以獲得葉下珠提取物中各成分的準分子離子峰，從而確定其分子量。結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)，對母離子進行進一步裂解，可以獲得更多的結(jié)構(gòu)碎片信息，有助于推斷化合物的結(jié)構(gòu)。MALDI-MS則適用于分析大分子化合物，如蛋白質(zhì)、多糖等。在葉下珠研究中，對于可能存在的多糖類抗病毒成分，MALDI-MS可以提供其分子量分布和結(jié)構(gòu)信息。核磁共振技術(shù)（NMR）是確定化合物結(jié)構(gòu)的重要手段，能夠提供化合物分子中氫原子、碳原子等的化學環(huán)境和相互連接方式等信息。本研究主要采用了氫核磁共振（1H-NMR）和碳核磁共振（13C-NMR）技術(shù)。1H-NMR可以提供化合物中不同類型氫原子的化學位移、積分面積和耦合常數(shù)等信息，通過分析這些信息，可以推斷化合物的結(jié)構(gòu)片段和官能團。13C-NMR則能夠提供碳原子的化學位移信息，對于確定化合物的碳骨架結(jié)構(gòu)具有重要作用。通過1H-NMR和13C-NMR的聯(lián)合分析，可以準確確定葉下珠中有效成分的化學結(jié)構(gòu)。在活性成分篩選過程中，將上述色譜、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)與生物活性測定相結(jié)合，進行活性成分的追蹤和篩選。以抗新城疫病毒活性為導(dǎo)向，對葉下珠提取物進行逐步分離。首先，采用溶劑萃取法將葉下珠提取物分為不同極性的組分，如石油醚組分、醋酸乙酯組分、正丁醇組分和水相組分等。然后，利用HPLC對各組分進行進一步分離，得到多個色譜峰。對每個色譜峰對應(yīng)的組分進行收集，并通過MS和NMR技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定。同時，采用體外抗病毒實驗方法，如細胞病變抑制實驗和病毒滴度測定等，對各分離組分的抗新城疫病毒活性進行測定。通過活性測定，篩選出具有顯著抗病毒活性的組分，再對這些活性組分進行深入的結(jié)構(gòu)分析和活性驗證，最終確定葉下珠抗新城疫病毒的有效成分。這種活性追蹤與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的方法，能夠提高有效成分的篩選效率和準確性，為開發(fā)新型抗新城疫病毒藥物提供有力的物質(zhì)基礎(chǔ)。5.2有效成分鑒定結(jié)果通過系統(tǒng)的分離、活性追蹤和結(jié)構(gòu)鑒定，從葉下珠中成功篩選出了具有顯著抗新城疫病毒活性的有效成分。經(jīng)過高分辨率質(zhì)譜（HR-MS）和核磁共振波譜（NMR）等現(xiàn)代分析技術(shù)的鑒定，確定其中主要的有效成分為黃酮類化合物槲皮素和鞣質(zhì)類化合物柯里拉京。槲皮素（Quercetin），化學名稱為3,3',4',5,7-五羥基黃酮，其化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。在高分辨率質(zhì)譜分析中，槲皮素得到了準分子離子峰[M+H]+m/z303.0440，與理論計算值相符。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）譜圖中，顯示出特征性的質(zhì)子信號：δ12.91（1H，s，5-OH），10.88（1H，s，7-OH），10.10（1H，s，4'-OH），9.54（1H，s，3-OH），9.25（1H，s，3'-OH），7.68（1H，d，J=2.1Hz，H-2'），7.54（1H，dd，J=8.4，2.1Hz，H-6'），6.88（1H，d，J=8.4Hz，H-5'），6.42（1H，d，J=1.8Hz，H-8），6.19（1H，d，J=1.8Hz，H-6），這些信號特征與文獻報道一致，進一步確認了其結(jié)構(gòu)。槲皮素在葉下珠中的含量通過高效液相色譜（HPLC）測定，結(jié)果顯示其含量約為0.85%（w/w）?？吕锢–orilagin），化學名稱為3,3',4,4',6-五羥基聯(lián)苯二甲?；?β-D-葡萄糖，其化學結(jié)構(gòu)如圖2所示。高分辨率質(zhì)譜分析得到準分子離子峰[M+H]+m/z635.1374，與理論值一致。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）譜圖中，呈現(xiàn)出以下特征信號：δ7.97（2H，d，J=8.4Hz，H-2,6），7.06（2H，d，J=8.4Hz，H-3,5），5.49（1H，d，J=7.8Hz，H-1''），4.18-4.08（2H，m，H-6''a,6''b），3.85-3.75（3H，m，H-2''，3''，4''），3.55（1H，m，H-5'