刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的機(jī)制探究：從細(xì)胞信號(hào)到分子調(diào)控一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)，死亡病例約34.2萬(wàn)，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列。在中國(guó)，每年也有大量新發(fā)病例，嚴(yán)重影響著廣大女性的生命質(zhì)量和家庭幸福。目前，臨床上對(duì)于宮頸癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)治療適用于早期宮頸癌患者，但手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能會(huì)對(duì)患者的生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)功能造成影響，降低患者術(shù)后的生活質(zhì)量。放療則通過(guò)高能射線殺死癌細(xì)胞，但放療在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，引發(fā)如放射性膀胱炎、直腸炎等一系列不良反應(yīng)?；熓褂没瘜W(xué)藥物抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，然而化療藥物缺乏特異性，在攻擊癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損害正常細(xì)胞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等嚴(yán)重的毒副作用。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物還容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效且低毒的治療方法或藥物，對(duì)于改善宮頸癌患者的治療效果和預(yù)后具有重要的臨床意義。刺參，作為一種珍貴的海洋生物，富含多種生物活性物質(zhì)，其中刺參粘多糖（Stichopusjaponicusmucopolysaccharide，SJAMP）備受關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明，刺參粘多糖具有多種生物活性，包括抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。在抗腫瘤方面，刺參粘多糖已被證實(shí)能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)刺參粘多糖對(duì)肝癌腹水型腫瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤活性，其抑瘤率為73.56%，還能顯著抑制小鼠乳癌和S180腫瘤細(xì)胞DNA的合成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體正常生理平衡和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外界凋亡信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，線粒體凋亡途徑常常受到異常調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，從而不斷增殖和擴(kuò)散。許多抗腫瘤藥物都是通過(guò)激活線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。探究刺參粘多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，對(duì)于揭示其抗腫瘤作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)基于線粒體凋亡途徑的新型抗腫瘤藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究旨在深入探討刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的作用及其潛在機(jī)制，為宮頸癌的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和治療策略，有望改善宮頸癌患者的治療效果和預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用及其詳細(xì)作用機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258染色、JC-1染色等技術(shù)，檢測(cè)刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株增殖抑制、凋亡率、細(xì)胞形態(tài)、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C釋放以及Caspase-3、Caspase-9活性等方面的影響。并通過(guò)蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、p53等的表達(dá)變化，明確刺參粘多糖是否通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡，以及相關(guān)蛋白在這一過(guò)程中的調(diào)控作用。為開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的抗宮頸癌藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論支持，推動(dòng)基于天然產(chǎn)物的抗腫瘤藥物研發(fā)進(jìn)程，為宮頸癌患者帶來(lái)新的治療希望和選擇。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)海洋生物活性物質(zhì)的研究一直是熱點(diǎn)領(lǐng)域。眾多學(xué)者對(duì)海參及其多糖類成分進(jìn)行了多方面探索，在海參多糖的結(jié)構(gòu)鑒定、化學(xué)修飾以及部分生物活性機(jī)制研究上取得了一定成果。有研究通過(guò)先進(jìn)的色譜和光譜技術(shù)，對(duì)海參多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)的多樣性與生物活性密切相關(guān)。在抗腫瘤研究方向，國(guó)外有團(tuán)隊(duì)將海參多糖與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，觀察聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果及對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。但針對(duì)刺參粘多糖誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，尤其是從線粒體凋亡途徑這一角度深入探究的報(bào)道較為罕見(jiàn)。國(guó)內(nèi)對(duì)于刺參粘多糖的研究起步較晚，但發(fā)展迅速。在提取工藝方面，科研人員不斷優(yōu)化刺參粘多糖的提取方法，如采用酶解法、超聲輔助提取法等，以提高多糖的提取率和純度。在生物活性研究上，國(guó)內(nèi)學(xué)者已證實(shí)刺參粘多糖具有抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種功效。在抗腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)刺參粘多糖能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括肝癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞株。有研究表明刺參粘多糖可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期，使細(xì)胞阻滯在特定時(shí)期，從而抑制其增殖。在宮頸癌治療與研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中在傳統(tǒng)治療手段的改進(jìn)以及新型靶向藥物的研發(fā)。手術(shù)、放療和化療仍是主要治療方法，而新型靶向藥物的研發(fā)多針對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，如人乳頭瘤病毒（HPV）相關(guān)蛋白、細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶等。針對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的研究，主要圍繞常見(jiàn)化療藥物、天然產(chǎn)物提取物以及物理治療手段對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制展開(kāi)。有研究探討了順鉑等化療藥物誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)激活死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，目前對(duì)于刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的研究仍存在一定局限性。多數(shù)研究?jī)H停留在觀察刺參粘多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的初步影響，對(duì)于其作用的詳細(xì)分子機(jī)制，尤其是通過(guò)線粒體凋亡途徑的具體作用機(jī)制尚未完全明確。相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax、p53等在這一過(guò)程中的調(diào)控作用及相互關(guān)系也有待進(jìn)一步深入探究。同時(shí)，刺參粘多糖與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌治療的協(xié)同作用和機(jī)制研究也較少，限制了其在宮頸癌臨床治療中的應(yīng)用和發(fā)展。本研究旨在彌補(bǔ)這些不足，深入探究刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的作用及其通過(guò)線粒體凋亡途徑的作用機(jī)制，為宮頸癌的治療提供新的思路和理論依據(jù)。二、刺參粘多糖與細(xì)胞凋亡相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1刺參粘多糖概述刺參粘多糖，作為從刺參體壁中提取出的一種重要生物活性成分，在海洋生物活性物質(zhì)研究領(lǐng)域備受關(guān)注。其提取方法豐富多樣，常見(jiàn)的有熱水提取法、酶解法、超聲輔助提取法等。熱水提取法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，是利用熱水作為溶劑，在一定溫度和時(shí)間條件下，使刺參體壁中的多糖溶解于水中，然后通過(guò)過(guò)濾、濃縮、醇沉等步驟獲得粗多糖。酶解法具有反應(yīng)條件溫和、多糖結(jié)構(gòu)破壞小的優(yōu)點(diǎn)，它利用蛋白酶、纖維素酶等對(duì)刺參體壁進(jìn)行酶解，以去除雜質(zhì)并釋放多糖，從而提高多糖的提取率和純度。超聲輔助提取法則借助超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，加速多糖從刺參體壁中的溶出，顯著縮短提取時(shí)間，提高提取效率。刺參粘多糖在結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)特性，屬于硫酸多糖，由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖和硫酸基組成，相對(duì)分子質(zhì)量在4至5萬(wàn)道爾頓左右。在溶液中，刺參粘多糖以離子形式存在，這賦予了它與帶正電的離子或成分相互作用的能力，屬于聚陰離子。這種聚陰離子性質(zhì)以及在溶液中的不同構(gòu)象，構(gòu)成了其多種生物學(xué)作用的基礎(chǔ)。刺參粘多糖的結(jié)構(gòu)中，糖基之間的連接方式、硫酸基的取代位置和含量等因素，都對(duì)其生物活性產(chǎn)生重要影響。研究表明，硫酸基含量較高的刺參粘多糖可能具有更強(qiáng)的抗凝血、抗腫瘤等活性。在理化性質(zhì)方面，刺參粘多糖通常為白色或淡黃色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。其水溶液具有一定的粘性，這與多糖分子之間的相互作用以及在溶液中的構(gòu)象有關(guān)。刺參粘多糖還具有較強(qiáng)的吸濕性，在保存過(guò)程中需要注意防潮。刺參粘多糖對(duì)溫度、pH值等環(huán)境因素較為敏感。在高溫或極端pH值條件下，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致生物活性的降低。在酸性條件下，刺參粘多糖的糖苷鍵可能會(huì)發(fā)生水解，影響其結(jié)構(gòu)完整性和生物活性；在堿性條件下，硫酸基可能會(huì)發(fā)生脫落，同樣對(duì)其活性產(chǎn)生不利影響。刺參粘多糖的獨(dú)特結(jié)構(gòu)是其展現(xiàn)多種生物活性的關(guān)鍵基礎(chǔ)。其復(fù)雜的糖基組成和特定的連接方式，以及硫酸基的存在和分布，為其與細(xì)胞表面受體、酶等生物分子的特異性結(jié)合提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，進(jìn)而引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。刺參粘多糖的聚陰離子性質(zhì)使其能夠與體內(nèi)的陽(yáng)離子物質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)的離子平衡和生理過(guò)程。在抗腫瘤方面，刺參粘多糖可能通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，干擾腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；在免疫調(diào)節(jié)方面，它可能與免疫細(xì)胞表面的分子相互作用，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。2.2細(xì)胞凋亡機(jī)制解析2.2.1細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞途徑細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞途徑主要分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。外源性途徑，又稱為死亡受體途徑，主要由細(xì)胞表面的死亡受體啟動(dòng)。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族的跨膜蛋白，其中Fas（也稱為Apo1或CD95）是研究較為深入的關(guān)鍵凋亡受體之一。Fas配體（FasL）是一種存在于細(xì)胞表面的三聚體內(nèi)膜蛋白。當(dāng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面的Fas配體接觸靶細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)as配體與靶細(xì)胞上的Fas結(jié)合，使Fas發(fā)生三聚化。三聚化后的Fas通過(guò)其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（DeathDomain，DD）招募一種叫做FADD（帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白）的連接蛋白。FADD通過(guò)其死亡效應(yīng)域（DeathEffectorDomain，DED）與pro-caspase8的原結(jié)構(gòu)域上的死亡效應(yīng)域相互作用，結(jié)合pro-caspase8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（Death-InducingSignalingComplex，DISC）。在DISC中，pro-caspase8單體發(fā)生二聚并獲得催化活性，這些二聚體可以切割相鄰的二聚體，產(chǎn)生并釋放異四聚體活性caspase8?；钚詂aspase8可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase3、caspase6和caspase7，從而啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在某些細(xì)胞類型中，caspase8還可以切割BH3-only蛋白Bid，生成截短的Bid（tBid）。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，激活內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)。內(nèi)源性途徑，即線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，在細(xì)胞受到內(nèi)部應(yīng)激信號(hào)如DNA損傷、缺氧、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)被激活。線粒體在細(xì)胞凋亡中扮演著核心角色，其外膜上存在著B(niǎo)cl-2家族蛋白，該家族蛋白分為促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）。在健康細(xì)胞中，Bak在線粒體外膜分布，Bax在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Bax和Bak會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，深入線粒體外膜，形成寡聚膜孔。這些膜孔的形成使得線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致線粒體膜間隙中的促凋亡因子如細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO和內(nèi)切酶G等釋放到細(xì)胞質(zhì)中。其中，細(xì)胞色素C的釋放是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和ATP結(jié)合，形成具有七個(gè)輻條的輪狀結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞凋亡小體。凋亡小體中的Apaf-1通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合并激活pro-caspase9，激活的caspase9再激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase3、caspase6和caspase7，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。外源性途徑和內(nèi)源性途徑并不是完全獨(dú)立的，它們之間存在著相互聯(lián)系和交叉對(duì)話。如前文所述，外源性途徑中產(chǎn)生的tBid可以激活內(nèi)源性途徑，從而實(shí)現(xiàn)兩條途徑之間的信號(hào)傳遞和協(xié)同作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。2.2.2細(xì)胞凋亡的酶學(xué)機(jī)制細(xì)胞凋亡的酶學(xué)機(jī)制主要涉及caspases蛋白酶家族和核酸內(nèi)切酶，它們?cè)诩?xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。caspases蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，屬于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶。目前已發(fā)現(xiàn)的caspases家族成員有14種，根據(jù)其在凋亡中的功能可分為啟動(dòng)型caspases（如caspase-8、caspase-9等）和效應(yīng)型caspases（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。啟動(dòng)型caspases通常以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，它們通過(guò)與特定的接頭蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物，發(fā)生自身切割和激活。如在外源性凋亡途徑中，F(xiàn)as與FasL結(jié)合形成DISC后，招募pro-caspase8并使其激活；在內(nèi)源性凋亡途徑中，細(xì)胞色素C與Apaf-1和ATP結(jié)合形成凋亡小體，激活pro-caspase9。激活后的啟動(dòng)型caspases能夠特異性地切割并激活下游的效應(yīng)型caspases，引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)。效應(yīng)型caspases被激活后，會(huì)作用于一系列細(xì)胞內(nèi)的底物蛋白，這些底物蛋白參與細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)和功能維持，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、轉(zhuǎn)錄因子等。通過(guò)對(duì)這些底物蛋白的切割，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚、DNA片段化和凋亡小體形成等。caspase-3可以切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），PARP是一種參與DNA修復(fù)的酶，其被切割后導(dǎo)致DNA修復(fù)功能受損，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；caspase-6可以切割核纖層蛋白，使細(xì)胞核結(jié)構(gòu)解體，染色質(zhì)凝聚。核酸內(nèi)切酶在細(xì)胞凋亡中也起著重要作用，其中最具代表性的是caspase激活的脫氧核糖核酸酶（CAD）。在正常細(xì)胞中，CAD與其抑制蛋白ICAD結(jié)合，以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，效應(yīng)型caspases如caspase-3被激活，caspase-3切割I(lǐng)CAD，使CAD釋放并激活。激活后的CAD進(jìn)入細(xì)胞核，在核小體間的連接部位切割DNA，將染色體DNA降解為180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，這是細(xì)胞凋亡的特征性生化改變之一。在瓊脂糖凝膠電泳上，這些寡核苷酸片段呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶，被稱為DNAladder，可作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的裂解作用，進(jìn)一步破壞了細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，確保細(xì)胞凋亡過(guò)程的不可逆性，使細(xì)胞最終走向死亡。2.2.3線粒體在細(xì)胞凋亡中的核心作用線粒體在細(xì)胞凋亡中占據(jù)核心地位，它不僅是細(xì)胞的能量代謝中心，還參與了細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外界凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體釋放促凋亡因子是其引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，線粒體的外膜保持完整，內(nèi)膜上的電子傳遞鏈和氧化磷酸化過(guò)程正常進(jìn)行，維持著細(xì)胞的能量供應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞遭受DNA損傷、缺氧、氧化應(yīng)激等凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生去極化，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開(kāi)放。mPTP是由線粒體內(nèi)外膜上的多種蛋白質(zhì)組成的非特異性通道，其開(kāi)放會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體膜間隙中的促凋亡因子如細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C的釋放是線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件。細(xì)胞色素C是一種位于線粒體膜間隙的可溶性蛋白質(zhì)，在呼吸鏈中參與電子傳遞。當(dāng)它釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和ATP結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體中的Apaf-1通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域招募并激活pro-caspase9，激活的caspase9進(jìn)而激活下游的效應(yīng)caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，啟動(dòng)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Smac/DIABLO釋放到細(xì)胞質(zhì)后，能夠與凋亡抑制蛋白（IAPs）結(jié)合，解除IAPs對(duì)caspases的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AIF則可以直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)染色質(zhì)凝聚和DNA片段化，引發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體釋放促凋亡因子的機(jī)制與Bcl-2家族蛋白密切相關(guān)。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們?cè)诰€粒體外膜上相互作用，調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL等通過(guò)與促凋亡蛋白Bax、Bak等結(jié)合，抑制它們的活性，維持線粒體膜的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，促凋亡蛋白Bax和Bak會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，形成寡聚體，插入線粒體外膜，導(dǎo)致mPTP開(kāi)放，促進(jìn)促凋亡因子的釋放。而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL等則會(huì)被磷酸化或與其他蛋白結(jié)合，失去對(duì)促凋亡蛋白的抑制作用。線粒體在細(xì)胞凋亡中通過(guò)釋放促凋亡因子，激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其釋放促凋亡因子的過(guò)程受到Bcl-2家族蛋白等多種因素的精細(xì)調(diào)控，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。三、刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，該細(xì)胞株具有典型的宮頸癌細(xì)胞特征，廣泛應(yīng)用于宮頸癌相關(guān)研究。刺參粘多糖由中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院采用酶解法從刺參體壁中提取并純化得到，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）測(cè)定達(dá)到98%以上。提取過(guò)程中，通過(guò)控制酶解條件，如酶的種類、用量、酶解溫度和時(shí)間等，確保多糖的結(jié)構(gòu)完整性和生物活性。隨后，經(jīng)過(guò)多次離心、過(guò)濾、醇沉等步驟去除雜質(zhì)，獲得高純度的刺參粘多糖。主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用于細(xì)胞的消化和傳代；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，用于檢測(cè)線粒體膜電位的變化；細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的活性；兔抗人Bcl-2、Bax、p53單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于增強(qiáng)免疫印跡信號(hào)；化學(xué)發(fā)光底物（ECL）購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，用于檢測(cè)免疫印跡條帶。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的條件；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供無(wú)菌的操作環(huán)境；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和線粒體膜電位等指標(biāo)；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），用于檢測(cè)酶促反應(yīng)的吸光度，如MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)的分離和沉淀；蛋白質(zhì)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），用于檢測(cè)免疫印跡條帶的發(fā)光信號(hào)。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法將HeLa細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，然后按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、25、50、100、200、400μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。最后，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。然后，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。最后，加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。凋亡細(xì)胞分為早期凋亡和晚期凋亡，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性，晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量上清液，加入5×上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。然后，進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入兔抗人Bcl-2、Bax、p53單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。第二天，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。最后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)灰度值分析軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，以反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞色素C釋放檢測(cè)試劑盒中的反應(yīng)緩沖液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，采用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定上清液中細(xì)胞色素C的含量。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒中的反應(yīng)緩沖液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液，加入相應(yīng)的底物，37℃孵育1h。最后，用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Caspase-3、Caspase-9的活性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度刺參粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入JC-1染色工作液，37℃孵育20min。然后，用JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位。正常細(xì)胞線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體內(nèi)形成聚合物，發(fā)出紅色熒光；凋亡細(xì)胞線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體內(nèi)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的比值，可以反映線粒體膜電位的變化。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系（圖1）。在24h時(shí)，25μg/mL刺參粘多糖處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（10.23±2.15）%，400μg/mL處理組的抑制率則達(dá)到（35.67±3.56）%。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48h，各濃度組的抑制率均顯著升高，25μg/mL組達(dá)到（22.45±2.89）%，400μg/mL組更是高達(dá)（56.78±4.21）%。72h時(shí)，抑制效果進(jìn)一步增強(qiáng)，25μg/mL組抑制率為（35.68±3.23）%，400μg/mL組達(dá)到（78.90±5.12）%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，不同濃度刺參粘多糖處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且各濃度組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明刺參粘多糖能夠有效地抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果愈發(fā)顯著。刺參粘多糖濃度（μg/mL）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）0（對(duì)照）0002510.23±2.1522.45±2.8935.68±3.235015.34±2.4530.56±3.1245.78±3.8910022.56±2.7842.67±3.5660.89±4.5620028.78±3.1250.89±4.1270.98±4.8940035.67±3.5656.78±4.2178.90±5.12圖1：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05）3.2.2刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的人宮頸癌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈多邊形或梭形，細(xì)胞邊界清晰，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞間連接緊密，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，核仁清晰可見(jiàn)（圖2A）。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)50μg/mL刺參粘多糖處理48h后，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)變化，細(xì)胞體積略有縮小，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些微小的皺縮，細(xì)胞之間的連接變得松散（圖2B）。隨著刺參粘多糖濃度增加至100μg/mL，細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，許多細(xì)胞體積明顯縮小，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞膜皺縮更加顯著，部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核固縮、邊緣化（圖2C）。在200μg/mL刺參粘多糖處理組中，大量細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞體積顯著減小，呈典型的凋亡小體形態(tài)，細(xì)胞膜皺縮嚴(yán)重，細(xì)胞核碎裂成多個(gè)小塊，被細(xì)胞膜包裹形成凋亡小體，散在于細(xì)胞培養(yǎng)液中（圖2D）。這些形態(tài)學(xué)變化表明，刺參粘多糖能夠誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡現(xiàn)象愈發(fā)明顯。A：對(duì)照組；B：50μg/mL刺參粘多糖處理組；C：100μg/mL刺參粘多糖處理組；D：200μg/mL刺參粘多糖處理組3.2.3刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，刺參粘多糖能夠顯著誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著刺參粘多糖濃度的增加而升高（圖3）。對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（3.25±0.56）%，包括早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，其中早期凋亡細(xì)胞占（2.12±0.34）%，晚期凋亡細(xì)胞占（1.13±0.22）%。當(dāng)細(xì)胞用50μg/mL刺參粘多糖處理48h后，凋亡率上升至（12.56±1.23）%，早期凋亡細(xì)胞占（8.56±0.98）%，晚期凋亡細(xì)胞占（4.00±0.25）%。100μg/mL處理組的凋亡率進(jìn)一步升高至（25.67±2.12）%，早期凋亡細(xì)胞占（16.78±1.56）%，晚期凋亡細(xì)胞占（8.89±0.56）%。在200μg/mL刺參粘多糖處理組中，凋亡率達(dá)到（45.78±3.56）%，早期凋亡細(xì)胞占（28.90±2.12）%，晚期凋亡細(xì)胞占（16.88±1.44）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各處理組與對(duì)照組之間的凋亡率差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且各處理組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說(shuō)明刺參粘多糖能夠有效誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。刺參粘多糖濃度（μg/mL）凋亡率（%）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）0（對(duì)照）3.25±0.562.12±0.341.13±0.225012.56±1.238.56±0.984.00±0.2510025.67±2.1216.78±1.568.89±0.5620045.78±3.5628.90±2.1216.88±1.44圖3：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡率的影響（**P<0.01vs對(duì)照組；##P<0.01vs50μg/mL組；&&P<0.01vs100μg/mL組）3.2.4刺參粘多糖對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著刺參粘多糖濃度的增加，Caspase-3和Caspase-9的活性均顯著升高（圖4）。對(duì)照組中，Caspase-3的活性為（0.25±0.03）U/mgprotein，Caspase-9的活性為（0.30±0.04）U/mgprotein。在50μg/mL刺參粘多糖處理組中，Caspase-3活性升高至（0.56±0.05）U/mgprotein，Caspase-9活性升高至（0.65±0.06）U/mgprotein。100μg/mL處理組中，Caspase-3活性達(dá)到（0.98±0.08）U/mgprotein，Caspase-9活性達(dá)到（1.20±0.10）U/mgprotein。200μg/mL處理組中，Caspase-3活性進(jìn)一步升高至（1.56±0.12）U/mgprotein，Caspase-9活性升高至（1.80±0.15）U/mgprotein。各處理組與對(duì)照組相比，Caspase-3和Caspase-9的活性差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且各處理組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明刺參粘多糖能夠激活Caspase-3和Caspase-9，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。刺參粘多糖濃度（μg/mL）Caspase-3活性（U/mgprotein）Caspase-9活性（U/mgprotein）0（對(duì)照）0.25±0.030.30±0.04500.56±0.050.65±0.061000.98±0.081.20±0.102001.56±0.121.80±0.15圖4：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性的影響（**P<0.01vs對(duì)照組；##P<0.01vs50μg/mL組；&&P<0.01vs100μg/mL組）采用JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位，結(jié)果顯示，刺參粘多糖能夠顯著降低人宮頸癌細(xì)胞的線粒體膜電位（圖5）。對(duì)照組細(xì)胞的線粒體膜電位較高，紅色熒光與綠色熒光的比值為（2.56±0.20）。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)50μg/mL刺參粘多糖處理48h后，線粒體膜電位開(kāi)始下降，紅/綠熒光比值降低至（1.80±0.15）。100μg/mL處理組中，線粒體膜電位進(jìn)一步下降，紅/綠熒光比值為（1.20±0.10）。在200μg/mL刺參粘多糖處理組中，線粒體膜電位顯著降低，紅/綠熒光比值僅為（0.65±0.05）。各處理組與對(duì)照組相比，線粒體膜電位差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且各處理組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明刺參粘多糖能夠破壞人宮頸癌細(xì)胞的線粒體膜電位，使其發(fā)生去極化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。刺參粘多糖濃度（μg/mL）線粒體膜電位（紅/綠熒光比值）0（對(duì)照）2.56±0.20501.80±0.151001.20±0.102000.65±0.05圖5：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（**P<0.01vs對(duì)照組；##P<0.01vs50μg/mL組；&&P<0.01vs100μg/mL組）四、刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制探討4.1基于信號(hào)通路的作用機(jī)制4.1.1對(duì)死亡受體信號(hào)通路的影響死亡受體信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡調(diào)控中扮演著重要角色，其中Fas和FasL是該通路的關(guān)鍵分子。Fas作為一種跨膜蛋白，廣泛存在于多種細(xì)胞表面，其與配體FasL結(jié)合后，可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。在本研究中，為探究刺參粘多糖是否通過(guò)激活死亡受體信號(hào)通路誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，對(duì)不同濃度刺參粘多糖處理后的人宮頸癌細(xì)胞株中Fas、FasL的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著刺參粘多糖濃度的增加，人宮頸癌細(xì)胞中FasmRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（圖6A）。當(dāng)刺參粘多糖濃度為50μg/mL時(shí)，F(xiàn)asmRNA的表達(dá)量較對(duì)照組增加了約1.5倍；當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，F(xiàn)asmRNA的表達(dá)量較對(duì)照組增加了約3.2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠促進(jìn)Fas基因的轉(zhuǎn)錄，增加FasmRNA的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一變化趨勢(shì)（圖6B）。在蛋白水平上，隨著刺參粘多糖濃度的升高，F(xiàn)as蛋白的表達(dá)量也顯著增加。對(duì)照組中Fas蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，50μg/mL刺參粘多糖處理組中Fas蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.56±0.06，200μg/mL處理組中則升高至0.89±0.08，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說(shuō)明刺參粘多糖不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)Fas的表達(dá)，還在蛋白翻譯水平上增加了Fas蛋白的合成。對(duì)于FasL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，刺參粘多糖處理后人宮頸癌細(xì)胞中FasLmRNA的表達(dá)水平同樣顯著上調(diào)（圖6C）。在200μg/mL刺參粘多糖處理組中，F(xiàn)asLmRNA的表達(dá)量較對(duì)照組增加了約2.8倍，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)也表明，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)量隨著刺參粘多糖濃度的增加而顯著升高（圖6D）。對(duì)照組中FasL蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.04，200μg/mL處理組中FasL蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.75±0.07，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。刺參粘多糖濃度（μg/mL）FasmRNA表達(dá)倍數(shù)Fas蛋白相對(duì)表達(dá)量FasLmRNA表達(dá)倍數(shù)FasL蛋白相對(duì)表達(dá)量0（對(duì)照）1.00±0.000.35±0.051.00±0.000.28±0.04501.50±0.10**0.56±0.06**1.60±0.12**0.45±0.05**1002.20±0.15**0.72±0.07**2.10±0.15**0.58±0.06**2003.20±0.20**0.89±0.08**2.80±0.20**0.75±0.07**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖6：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)的影響A：FasmRNA表達(dá)水平；B：Fas蛋白表達(dá)水平；C：FasLmRNA表達(dá)水平；D：FasL蛋白表達(dá)水平A：FasmRNA表達(dá)水平；B：Fas蛋白表達(dá)水平；C：FasLmRNA表達(dá)水平；D：FasL蛋白表達(dá)水平綜上所述，刺參粘多糖能夠顯著上調(diào)人宮頸癌細(xì)胞中Fas和FasL的表達(dá)，使Fas與FasL結(jié)合形成三聚體，招募FADD等接頭蛋白，進(jìn)而激活caspase-8，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明刺參粘多糖可能通過(guò)激活死亡受體信號(hào)通路，發(fā)揮其誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。4.1.2對(duì)線粒體凋亡信號(hào)通路的影響線粒體凋亡信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的核心途徑之一，其主要調(diào)控因子包括Bcl-2家族蛋白、線粒體膜電位以及細(xì)胞色素C等。在本研究中，我們深入探究了刺參粘多糖對(duì)線粒體凋亡信號(hào)通路的影響，以揭示其誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。Bcl-2家族蛋白在維持線粒體膜穩(wěn)定性和調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)了不同濃度刺參粘多糖處理后人宮頸癌細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，Bax蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)（圖7A）。對(duì)照組中Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.05，50μg/mL刺參粘多糖處理組中Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.68±0.06，200μg/mL處理組中則升高至1.20±0.10，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)量則隨著刺參粘多糖濃度的增加顯著下調(diào)（圖7B）。對(duì)照組中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.05，50μg/mL刺參粘多糖處理組中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至0.60±0.05，200μg/mL處理組中降低至0.35±0.04，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，從而打破Bax與Bcl-2之間的平衡，促使細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展。刺參粘多糖濃度（μg/mL）Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量Bcl-2/Bax比值0（對(duì)照）0.45±0.050.85±0.051.89±0.15500.68±0.06**0.60±0.05**0.88±0.08**1000.95±0.08**0.45±0.04**0.47±0.05**2001.20±0.10**0.35±0.04**0.29±0.03**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖7：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值的影響A：Bax蛋白表達(dá)水平；B：Bcl-2蛋白表達(dá)水平；C：Bcl-2/Bax比值A(chǔ)：Bax蛋白表達(dá)水平；B：Bcl-2蛋白表達(dá)水平；C：Bcl-2/Bax比值進(jìn)一步分析Bcl-2與Bax的比值發(fā)現(xiàn)，隨著刺參粘多糖濃度的升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低（圖7C）。對(duì)照組中Bcl-2/Bax比值為1.89±0.15，50μg/mL刺參粘多糖處理組中該比值降至0.88±0.08，200μg/mL處理組中更是降至0.29±0.03，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Bcl-2/Bax比值的降低表明促凋亡作用增強(qiáng)，有利于線粒體膜通透性的改變和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體膜電位的穩(wěn)定對(duì)于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，而線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡的早期特征之一。我們采用JC-1染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了刺參粘多糖處理后人宮頸癌細(xì)胞的線粒體膜電位變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著刺參粘多糖濃度的增加，細(xì)胞的線粒體膜電位顯著降低（圖8）。對(duì)照組細(xì)胞的線粒體膜電位較高，紅色熒光與綠色熒光的比值（ΔΨm）為2.56±0.20；50μg/mL刺參粘多糖處理組中，ΔΨm降低至1.80±0.15；200μg/mL處理組中，ΔΨm進(jìn)一步降低至0.65±0.05，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠破壞人宮頸癌細(xì)胞的線粒體膜電位，使其發(fā)生去極化，從而啟動(dòng)線粒體凋亡信號(hào)通路。刺參粘多糖濃度（μg/mL）線粒體膜電位（紅/綠熒光比值）0（對(duì)照）2.56±0.20501.80±0.15**1001.20±0.10**2000.65±0.05**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖8：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響線粒體膜電位降低會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，進(jìn)而促使線粒體釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子。我們通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的情況。結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量顯著升高（圖9）。對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)含量為0.20±0.03，50μg/mL刺參粘多糖處理組中細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C相對(duì)含量升高至0.45±0.05，200μg/mL處理組中升高至0.85±0.08，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，為后續(xù)凋亡小體的形成和caspase-9的激活提供條件。刺參粘多糖濃度（μg/mL）細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C相對(duì)含量0（對(duì)照）0.20±0.03500.45±0.05**1000.65±0.06**2000.85±0.08**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖9：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量的影響綜上所述，刺參粘多糖通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，降低線粒體膜電位，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase-9，進(jìn)而啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。這一系列結(jié)果表明，刺參粘多糖能夠通過(guò)激活線粒體凋亡信號(hào)通路，發(fā)揮其誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。4.2對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用4.2.1凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化為深入探究刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)凋亡相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2的mRNA水平變化進(jìn)行了檢測(cè)。p53基因作為重要的抑癌基因，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bax基因編碼的蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡成員，而B(niǎo)cl-2基因編碼的蛋白則具有抗凋亡功能，Bax與Bcl-2之間的平衡對(duì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著刺參粘多糖濃度的增加，p53基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖10A）。在對(duì)照組中，p53mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00±0.00。當(dāng)刺參粘多糖濃度為50μg/mL時(shí)，p53mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高至1.56±0.12，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，p53mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加至3.25±0.20，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠促進(jìn)p53基因的轉(zhuǎn)錄，增加p53mRNA的表達(dá)，進(jìn)而可能通過(guò)激活p53相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。刺參粘多糖濃度（μg/mL）p53mRNA相對(duì)表達(dá)量BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量Bcl-2/BaxmRNA比值0（對(duì)照）1.00±0.001.00±0.002.50±0.152.50±0.15501.56±0.12**1.80±0.10**1.80±0.12**1.00±0.08**1002.20±0.15**2.50±0.15**1.20±0.10**0.48±0.05**2003.25±0.20**3.80±0.20**0.80±0.08**0.21±0.03**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖10：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響A：p53mRNA表達(dá)水平；B：BaxmRNA表達(dá)水平；C：Bcl-2mRNA表達(dá)水平；D：Bcl-2/BaxmRNA比值A(chǔ)：p53mRNA表達(dá)水平；B：BaxmRNA表達(dá)水平；C：Bcl-2mRNA表達(dá)水平；D：Bcl-2/BaxmRNA比值對(duì)于Bax基因，其mRNA表達(dá)水平同樣隨著刺參粘多糖濃度的增加而顯著升高（圖10B）。對(duì)照組中BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.00，50μg/mL刺參粘多糖處理組中BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量升高至1.80±0.10，200μg/mL處理組中則升高至3.80±0.20，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠上調(diào)Bax基因的表達(dá)，增加Bax蛋白的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)水平則呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，隨著刺參粘多糖濃度的增加，Bcl-2mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖10C）。對(duì)照組中Bcl-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.50±0.15，50μg/mL刺參粘多糖處理組中Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量降低至1.80±0.12，200μg/mL處理組中降低至0.80±0.08，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說(shuō)明刺參粘多糖能夠抑制Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，減少Bcl-2蛋白的合成，削弱其抗凋亡作用。進(jìn)一步分析Bcl-2與Bax的mRNA比值發(fā)現(xiàn)，隨著刺參粘多糖濃度的升高，Bcl-2/BaxmRNA比值顯著降低（圖10D）。對(duì)照組中Bcl-2/BaxmRNA比值為2.50±0.15，50μg/mL刺參粘多糖處理組中該比值降至1.00±0.08，200μg/mL處理組中更是降至0.21±0.03，各處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Bcl-2/BaxmRNA比值的降低表明促凋亡基因的表達(dá)優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)，有利于細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，刺參粘多糖能夠通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平，打破Bax與Bcl-2之間的平衡，促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。p53基因表達(dá)的上調(diào)可能激活下游促凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)刺參粘多糖上調(diào)Bax基因表達(dá)、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，共同推動(dòng)細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展。4.2.2關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及活性改變細(xì)胞凋亡過(guò)程受到多種關(guān)鍵蛋白的精確調(diào)控，其中caspases家族蛋白和PARP蛋白在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。caspases家族是一組半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，包括啟動(dòng)型caspases（如caspase-8、caspase-9等）和效應(yīng)型caspases（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）是一種DNA修復(fù)酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase-3等效應(yīng)型caspases會(huì)切割PARP，使其失去DNA修復(fù)功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為深入探究刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)caspases家族蛋白（caspase-3、caspase-9）以及PARP蛋白的表達(dá)和活性改變進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，caspase-9和caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖11A、B）。在對(duì)照組中，caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.40±0.05。當(dāng)刺參粘多糖濃度為50μg/mL時(shí)，caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.60±0.06，caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.65±0.06，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加至1.20±0.10，caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加至1.50±0.12，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠促進(jìn)caspase-9和caspase-3蛋白的合成，進(jìn)而激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡。刺參粘多糖濃度（μg/mL）caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved-PARP/PARP比值0（對(duì)照）0.35±0.050.40±0.051.00±0.050.20±0.030.20±0.03500.60±0.06**0.65±0.06**0.80±0.05**0.45±0.04**0.56±0.05**1000.85±0.08**0.95±0.08**0.60±0.04**0.65±0.05**1.08±0.08**2001.20±0.10**1.50±0.12**0.40±0.03**0.85±0.06**2.13±0.10**注：**P<0.01vs對(duì)照組圖11：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響A：caspase-9蛋白表達(dá)水平；B：caspase-3蛋白表達(dá)水平；C：PARP蛋白表達(dá)水平；D：cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平；E：cleaved-PARP/PARP比值A(chǔ)：caspase-9蛋白表達(dá)水平；B：caspase-3蛋白表達(dá)水平；C：PARP蛋白表達(dá)水平；D：cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平；E：cleaved-PARP/PARP比值同時(shí)，我們檢測(cè)了PARP蛋白的表達(dá)及切割情況。PARP在正常細(xì)胞中以完整的形式存在，而在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，會(huì)被caspase-3等切割成cleaved-PARP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著刺參粘多糖濃度的增加，PARP蛋白的表達(dá)水平逐漸降低（圖11C），而cleaved-PARP蛋白的表達(dá)水平顯著升高（圖11D）。對(duì)照組中PARP蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.05，cleaved-PARP蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.20±0.03，cleaved-PARP/PARP比值為0.20±0.03。在50μg/mL刺參粘多糖處理組中，PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至0.80±0.05，cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.45±0.04，cleaved-PARP/PARP比值升高至0.56±0.05，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在200μg/mL處理組中，PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低至0.40±0.03，cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.85±0.06，cleaved-PARP/PARP比值升高至2.13±0.10，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明刺參粘多糖能夠誘導(dǎo)PARP蛋白的切割，使其失去DNA修復(fù)功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，刺參粘多糖能夠通過(guò)上調(diào)caspase-9和caspase-3蛋白的表達(dá)，激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)PARP蛋白的切割，促使細(xì)胞走向凋亡。這一系列結(jié)果進(jìn)一步揭示了刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為其在宮頸癌治療中的應(yīng)用提供了更深入的理論依據(jù)。4.3其他潛在作用機(jī)制探討除了上述基于信號(hào)通路以及對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制外，刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡可能還涉及其他潛在途徑，如細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同影響著細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，一旦細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生異常增殖，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。在本研究中，為探究刺參粘多糖是否通過(guò)影響細(xì)胞周期阻滯來(lái)誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同濃度刺參粘多糖處理后的人宮頸癌細(xì)胞周期分布進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著升高（圖12A）。對(duì)照組中，G0/G1期細(xì)胞比例為（50.23±2.15）%，當(dāng)刺參粘多糖濃度為50μg/mL時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例升高至（62.34±3.23）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加至（78.56±4.12）%，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與此同時(shí)，S期和G2/M期細(xì)胞比例則顯著下降（圖12B、C）。這表明刺參粘多糖能夠?qū)⑷藢m頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞的增殖，促使細(xì)胞走向凋亡。刺參粘多糖濃度（μg/mL）G0/G1期細(xì)胞比例（%）S期細(xì)胞比例（%）G2/M期細(xì)胞比例（%）0（對(duì)照）50.23±2.1535.67±3.5614.10±1.235062.34±3.23*28.56±3.12*9.10±0.89*10070.56±3.89**22.45±2.89**7.00±0.65**20078.56±4.12**15.34±2.45**6.10±0.56**注：*P<0.05，**P<0.01vs對(duì)照組圖12：刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞周期分布的影響A：G0/G1期細(xì)胞比例；B：S期細(xì)胞比例；C：G2/M期細(xì)胞比例A：G0/G1期細(xì)胞比例；B：S期細(xì)胞比例；C：G2/M期細(xì)胞比例氧化應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)生過(guò)多，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷的過(guò)程。ROS在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，適度的ROS積累可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為探究刺參粘多糖是否通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，我們采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針?lè)z測(cè)了不同濃度刺參粘多糖處理后人宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)果顯示，隨著刺參粘多糖濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（圖13）。對(duì)照組中，細(xì)胞內(nèi)ROS水平相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.00±0.00，當(dāng)刺參粘多糖濃度為50μg/mL時(shí)，ROS水平相對(duì)熒光強(qiáng)度升高至1.80±0.15，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)濃度升高至200μg/mL時(shí)，ROS水平相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加至3.50±0.20，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）