152024-06-14發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I油莎豆根際土壤中假單胞菌分離鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了油莎豆根際土壤中假單胞菌的菌株分離、菌本文件適用于油莎豆根際土壤中假單胞菌的分離鑒定，也可適用于其它植物根際土壤中假單胞菌GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和GB8538食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉SN/T4624.17入境環(huán)保用微生物菌劑檢測方法第17部分：惡甲胺、12g/L瓊脂的配方分別稱取試劑，加蒸餾水至1L，加入10ml甘油，攪拌均勻，調(diào)沸至完全溶解。將配制好的CN培養(yǎng)基121℃滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃~60℃后，依次加入終來博），配制成TSA培養(yǎng)基，傾注到滅菌平板上，培養(yǎng)基厚度至少高5mm，4℃避光保存，保持干燥，12做標(biāo)記，無菌采樣袋密封，并立即放入生物樣品采集箱中低溫保存(采樣箱內(nèi)提前放入冰袋)。低溫運收集根際土?xí)r，在超凈工作臺內(nèi)抖落根非根際土，附著在根部約1mm厚的土壤為根際土。將根系樣子剔除根系，剩余懸浮液4℃、6000g離心20min收集根際土壤。直接做后續(xù)實驗或置于-80℃超低溫冰箱保存。稱取1.5g根際土壤溶于25mlpH7.0的PBS緩沖液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶液)中，用無菌吸管吸取25ml該樣品溶液置于盛有225ml用無菌生理鹽水袋無菌三角瓶中，充分混勻，制成1:10樣品勻液。用1ml無菌微量移液器吸取1:10樣品勻液，注于盛有9ml無菌生理鹽水袋無菌試管中，在振蕩器上振蕩混勻，制成1:100樣品勻液，以此類推，制備1:1000和1:10000樣品勻液。選取1:1000或1:10000樣箱30℃培養(yǎng)24h(若菌落太小，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間)。該菌在TSA氣泡產(chǎn)生，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。該菌會產(chǎn)生氣泡，呈陽性反應(yīng)。將待測菌株在TSB培養(yǎng)基(不加瓊脂的TSA瓊脂培養(yǎng)基)中30℃培養(yǎng)24h,將菌液收集于2mL滅菌離心管中，6000g離心1min,棄上清液，菌體沉淀物按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明處理，獲得——rpoD(F:5'TGAAGGCGARATCGAAATCGCCAA3'R:5'YGCMGWCAGCTTYTGCTGGCA——gyrB(F:5'TCBGCRGCVGARGTSATCATGAC3'R:5'TTGTCYTTGGTCTGSGAGCTGA3——反應(yīng)體系(50μ1):DNA模板4μl,ddH?019μl,rpoD-F或gyrB-F162℃退火1min,72℃延伸1min,30個循環(huán)；72℃延伸5min,4℃冷卻。配制1.0%瓊脂糖凝膠30mL,微波爐加熱融化，待冷卻至50℃~60℃時，加入1μL核酸染料(Gold在97%以上的同源序列8～10個。使用MEG