152022-08-30發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定牟英男、韓平安、聶利珍、牛素清、常悅、唐寬剛、梁晨、I1向日葵根尖染色體制片和核型分析技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了向日葵根尖染色體玻片標(biāo)本制備的儀器和設(shè)備、試劑配制、制備方法及核型分析方法。本文件適用于向日葵根尖染色體玻片標(biāo)本制備和核型分析。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的遺傳物質(zhì)深度壓縮形成的聚合體，一般呈棒狀，因易被堿性染料染色，故稱染色體。通過次縊痕與染色體主要部分相連，位于染色體末端的、圓形或橢圓形的染色體片段，稱為隨體。具隨體的染色體稱為隨體染色體，用sat表示。染色體組在有絲分裂中期的表型，包括染色體數(shù)目、大小、形態(tài)等特征。核型分析karyotypeanalysis利用染色體制片對體細(xì)胞分裂中期的染色體直接進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)、分組，并對每個(gè)染色體形態(tài)特征進(jìn)行定量和定性的描述，即為核型分析。4儀器和設(shè)備4.1電子分析天平：精度0.001g。4.2冰箱。24.4光學(xué)顯微鏡(配有100倍油鏡、成像系統(tǒng))。無水乙醇：冰醋酸=3:1(體積比),現(xiàn)用現(xiàn)配?？▽毱芳t染液：取B液45mL,加入6mL37%的甲醛，6mL冰乙酸，充分混勻(可長期保存)。5.5酶液將溶液過濾，在濾液中加入25mL甘油和25mL甲醇，保存在密閉玻璃瓶內(nèi)，靜置30d～60d,待液體顏挑選向日葵籽粒飽滿、大小一致的種子，于溫水中浸泡1h～2h后，均勻擺放在鋪有3層浸當(dāng)幼根長到1.5cm左右時(shí)，于上午9:30～10:00切取根尖，用0.002m從70%乙醇中取出根尖，ddH2O沖洗2～3次后，用無菌濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)入離心管中，加入1mol/L上蓋玻片，吸去多余染液，用竹簽輕輕垂直敲打，并用拇指均力壓片，使材料分散在染色體分散較好的載玻片上滴一滴中性樹膠封片，貼上標(biāo)簽注明，制成永久制片。從70%乙醇中取出根尖，ddH2O沖洗生區(qū))，去掉根冠，轉(zhuǎn)移到ddH2O中，常溫下取出前低滲后的材料，用無菌濾紙吸干水分，移入酶液中(實(shí)驗(yàn)材料與酶液的體積比控制在1:20~小心洗去酶液，轉(zhuǎn)入ddH2O中，常溫下后低滲將后低滲的材料用卡諾氏固定液固定10min～13用竹簽輕輕垂直敲打，用拇指均力壓片，使材料用光學(xué)顯微鏡觀察制片。先在40倍物鏡下找到清晰的細(xì)胞，再轉(zhuǎn)換至100倍物鏡，滴上松柏油進(jìn)行以體細(xì)胞染色體數(shù)目為準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)30個(gè)以上染色體分散良好以體細(xì)胞分裂中期的染色體作為基本形態(tài)。統(tǒng)計(jì)5個(gè)以利用AdobePhotoshop圖片處理軟件進(jìn)行染色體的剪貼、排列和同源染色體的配對，測量染色體長分比(％)表示；相對長度系數(shù)為每條染色體長度/單倍體組染色體平均長度；染色體長度比為最長染色4依據(jù)染色體相對系數(shù)值確定，按照附錄B中根據(jù)染色體的長度比和臂比主要特征區(qū)分核型的對稱和不對稱程度，分為12種類型，按照附錄B中為同源染色體，然后按染色體序號順序排列，即為該細(xì)胞的染色體核型圖。具體步驟見附將核型的主要特征，如染色體數(shù)目、臂比、著絲點(diǎn)位置、隨體等以公式表示。5A.1染色體長度測量步驟取5張形態(tài)清晰、分散好的染色體標(biāo)本片圖像，打開Photoshop7.0，從文件下拉菜單中打開染色體A.2染色體參數(shù)計(jì)算將染色體參數(shù)的相對長度數(shù)據(jù)輸入到Excel工作表中，注意輸入數(shù)據(jù)時(shí)短臂的數(shù)據(jù)為正，長臂的數(shù)6MmtSL127注意：拼接前要將2條染色體的尺寸調(diào)整成一樣大，以不影響后續(xù)的測C.2.2作圖時(shí)先將長臂負(fù)數(shù)區(qū)域選定，然后右鍵設(shè)置單元格格式，在數(shù)字分類選項(xiàng)中選定數(shù)值，小數(shù)選擇堆積柱形圖，然后按照自己的需要編輯標(biāo)題、X、YC.2.4圖表完成后還要對圖表區(qū)進(jìn)行設(shè)置，雙擊坐標(biāo)軸彈出“坐標(biāo)軸格式”對話框，