EGR1對(duì)TSCs分化影響及其在腱骨愈合中作用的研究摘要本研究旨在探究早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（EGR1）對(duì)肌腱干細(xì)胞（TSCs）分化的影響及其在腱骨愈合過(guò)程中的作用機(jī)制。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，檢測(cè)EGR1在TSCs不同分化階段的表達(dá)情況，運(yùn)用基因敲低和過(guò)表達(dá)技術(shù)調(diào)控EGR1水平，觀察其對(duì)TSCs向成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等方向分化的影響，并評(píng)估在腱骨愈合過(guò)程中EGR1干預(yù)對(duì)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的作用。研究結(jié)果表明，EGR1可顯著調(diào)控TSCs的分化方向，在腱骨愈合進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為腱骨愈合相關(guān)疾病的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞EGR1；肌腱干細(xì)胞；分化；腱骨愈合；作用機(jī)制一、引言（一）研究背景腱骨連接是維持關(guān)節(jié)正常功能的重要結(jié)構(gòu)，然而在運(yùn)動(dòng)損傷、外科手術(shù)等情況下，腱骨連接部位極易受損，且由于其特殊的生物力學(xué)環(huán)境和組織結(jié)構(gòu)，損傷后的愈合過(guò)程緩慢且效果不佳，常常導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。肌腱干細(xì)胞（TSCs）作為肌腱組織中具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，在腱骨愈合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TSCs能夠分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，參與腱骨界面的修復(fù)和重建。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（EGR1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。已有研究表明，EGR1在骨骼發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但EGR1對(duì)TSCs分化的影響及其在腱骨愈合中的具體作用機(jī)制尚不明確。深入研究EGR1與TSCs分化及腱骨愈合的關(guān)系，對(duì)于揭示腱骨愈合的分子機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。（二）研究目的及意義本研究的目的是明確EGR1對(duì)TSCs分化的影響，闡明EGR1在腱骨愈合過(guò)程中的作用機(jī)制，為腱骨愈合相關(guān)疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。通過(guò)揭示EGR1與TSCs分化及腱骨愈合之間的關(guān)系，有望開(kāi)發(fā)出基于EGR1調(diào)控的新型治療方法，提高腱骨損傷的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞來(lái)源：從健康成年SD大鼠肌腱組織中分離提取肌腱干細(xì)胞（TSCs），通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志物，確保細(xì)胞純度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取6-8周齡、體重200-220g的SPF級(jí)SD大鼠，用于建立腱骨損傷動(dòng)物模型。動(dòng)物飼養(yǎng)于符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范的環(huán)境中，自由飲食飲水。主要試劑：EGR1過(guò)表達(dá)慢病毒載體、EGR1shRNA慢病毒載體、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)基、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒、茜素紅染色試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒、Westernblot相關(guān)試劑等。主要儀器：倒置相差顯微鏡、CO?培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、熒光定量PCR儀、Westernblot電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)等。（二）實(shí)驗(yàn)方法TSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定采用組織塊貼壁法從SD大鼠肌腱組織中分離TSCs，將獲取的肌腱組織剪碎后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TSCs表面標(biāo)志物CD90、CD44、CD34、CD45的表達(dá)，鑒定細(xì)胞純度。EGR1在TSCs不同分化階段的表達(dá)檢測(cè)將TSCs分別置于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、3、7、14天收集細(xì)胞。運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)EGR1在不同分化階段的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析EGR1表達(dá)與TSCs分化的關(guān)系。EGR1對(duì)TSCs分化的影響將TSCs分為對(duì)照組、EGR1過(guò)表達(dá)組和EGR1敲低組。EGR1過(guò)表達(dá)組感染EGR1過(guò)表達(dá)慢病毒載體，EGR1敲低組感染EGR1shRNA慢病毒載體，對(duì)照組感染空載慢病毒載體。感染48h后，將三組細(xì)胞分別置于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)ALP活性檢測(cè)、茜素紅染色、qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因（如Runx2、Osterix）和成纖維相關(guān)基因（如Col1a1、Fibronectin）的表達(dá)，評(píng)估EGR1對(duì)TSCs向成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化的影響。體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)建立SD大鼠腱骨損傷模型，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、EGR1過(guò)表達(dá)干預(yù)組和EGR1敲低干預(yù)組。EGR1過(guò)表達(dá)干預(yù)組在腱骨損傷部位局部注射EGR1過(guò)表達(dá)慢病毒載體，EGR1敲低干預(yù)組注射EGR1shRNA慢病毒載體，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。術(shù)后第2、4、6周處死大鼠，取腱骨愈合組織，通過(guò)組織學(xué)染色（HE染色、Masson染色）觀察腱骨愈合組織的組織結(jié)構(gòu)變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白（如骨鈣素、骨橋蛋白）和成纖維相關(guān)蛋白（如Ⅰ型膠原蛋白）的表達(dá)，評(píng)估EGR1在腱骨愈合過(guò)程中的作用。數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）TSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定結(jié)果通過(guò)組織塊貼壁法成功從SD大鼠肌腱組織中分離出TSCs，細(xì)胞呈梭形，貼壁生長(zhǎng)良好。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，分離的細(xì)胞高表達(dá)CD90（95.6%±2.3%）和CD44（92.1%±1.8%），低表達(dá)CD34（1.2%±0.5%）和CD45（0.8%±0.3%），符合TSCs的表面標(biāo)志物特征，細(xì)胞純度較高。（二）EGR1在TSCs不同分化階段的表達(dá)情況qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，EGR1的mRNA和蛋白表達(dá)水平在第3天開(kāi)始顯著升高（P<0.05），并在第7天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；在成纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，EGR1的表達(dá)水平在第7天出現(xiàn)顯著升高（P<0.05），并在第14天維持較高水平。這表明EGR1的表達(dá)與TSCs向成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分化過(guò)程密切相關(guān)。（三）EGR1對(duì)TSCs分化的影響成骨分化：EGR1過(guò)表達(dá)組在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ALP活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）；而EGR1敲低組的ALP活性、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這表明EGR1能夠促進(jìn)TSCs向成骨細(xì)胞方向分化。成纖維分化：EGR1過(guò)表達(dá)組在成纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)后，成纖維相關(guān)基因Col1a1、Fibronectin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；EGR1敲低組的成纖維相關(guān)基因表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這說(shuō)明EGR1也能夠促進(jìn)TSCs向成纖維細(xì)胞方向分化。（四）EGR1在腱骨愈合過(guò)程中的作用組織學(xué)觀察：HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，術(shù)后第2周，模型組腱骨愈合組織中纖維組織排列紊亂，新生骨組織較少；EGR1過(guò)表達(dá)干預(yù)組的纖維組織排列相對(duì)整齊，新生骨組織數(shù)量較多；EGR1敲低干預(yù)組的纖維組織排列更加紊亂，新生骨組織明顯少于模型組。術(shù)后第6周，EGR1過(guò)表達(dá)干預(yù)組的腱骨界面結(jié)構(gòu)更加清晰，膠原纖維與骨組織連接緊密；而EGR1敲低干預(yù)組的腱骨界面結(jié)構(gòu)仍不清晰，膠原纖維與骨組織連接疏松。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：EGR1過(guò)表達(dá)干預(yù)組中骨鈣素、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的陽(yáng)性表達(dá)面積和表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于模型組（P<0.05）；EGR1敲低干預(yù)組的這些蛋白的陽(yáng)性表達(dá)面積和表達(dá)強(qiáng)度均顯著低于模型組（P<0.05）。這表明EGR1能夠促進(jìn)腱骨愈合過(guò)程中骨組織和纖維組織的形成，改善腱骨愈合質(zhì)量。四、討論（一）EGR1對(duì)TSCs分化的調(diào)控機(jī)制本研究結(jié)果表明，EGR1能夠顯著促進(jìn)TSCs向成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞方向分化。在成骨分化過(guò)程中，EGR1可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路或BMP/Smad信號(hào)通路，上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix的表達(dá)，從而促進(jìn)TSCs的成骨分化。已有研究報(bào)道，EGR1可以與Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，增強(qiáng)β-catenin的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活下游成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在成纖維分化過(guò)程中，EGR1可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維相關(guān)基因Col1a1、Fibronectin的表達(dá)，推動(dòng)TSCs向成纖維細(xì)胞分化。TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞外基質(zhì)合成和纖維組織形成中發(fā)揮著重要作用，EGR1可能通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的活性，影響TSCs的成纖維分化進(jìn)程。（二）EGR1在腱骨愈合中的作用機(jī)制在腱骨愈合過(guò)程中，良好的骨組織和纖維組織形成是實(shí)現(xiàn)腱骨有效連接的關(guān)鍵。本研究通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGR1能夠促進(jìn)腱骨愈合過(guò)程中骨組織和纖維組織的形成，改善腱骨愈合質(zhì)量。EGR1促進(jìn)骨組織形成可能與其促進(jìn)TSCs成骨分化密切相關(guān)，通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，增加新生骨組織的數(shù)量，促進(jìn)骨組織與肌腱組織的連接。同時(shí)，EGR1促進(jìn)纖維組織形成有助于維持腱骨界面的力學(xué)穩(wěn)定性，其通過(guò)調(diào)控TSCs向成纖維細(xì)胞分化，增加膠原纖維的合成和沉積，使纖維組織排列更加有序，增強(qiáng)腱骨界面的連接強(qiáng)度。此外，EGR1可能還通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血管生成，為腱骨愈合創(chuàng)造有利的微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)腱骨愈合進(jìn)程。（三）研究的局限性與展望本研究初步揭示了EGR1對(duì)TSCs分化的影響及其在腱骨愈合中的作用機(jī)制，但仍存在一些局限性。在體外實(shí)驗(yàn)中，僅研究了EGR1對(duì)TSCs向成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化的影響，未涉及其他可能的分化方向；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，僅觀察了EGR1干預(yù)后腱骨愈合組織的組織結(jié)構(gòu)和部分蛋白表達(dá)變化，對(duì)于EGR1調(diào)控腱骨愈合的具體分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步拓展EGR1對(duì)TSCs分化方向的研究范圍，深入探討EGR1在腱骨愈合過(guò)程中與其他信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，為基于EGR1調(diào)控的腱骨愈合治療策略提供更全面的理論依據(jù)。五、結(jié)論本研究證實(shí)EGR1能夠顯著促進(jìn)TSCs向成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞方向分化，在腱骨愈合過(guò)