NR1-TFR重組表位疫苗：從制備到真核細胞表達的深度探究一、引言1.1研究背景N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartatereceptor，NR）作為離子型谷氨酸受體中至關(guān)重要的亞型，是一類配體門控離子通道，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中。其在生理條件下，對神經(jīng)元的存活、樹突和軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育、突觸可塑性的形成以及神經(jīng)元回路的構(gòu)建起著不可或缺的作用，是學(xué)習和記憶過程中關(guān)鍵的受體。NR由多個亞基組成，其中NR1是構(gòu)成離子通道的基本亞單位，功能性的NR必須含有NR1亞單位，其常與多個NR2亞單位共同形成四聚體（或五聚體），而不同NR2組成的NR表現(xiàn)出不同的腦內(nèi)分布與生理學(xué)特性。然而，在病理狀態(tài)下，NR的過度激活會介導(dǎo)興奮毒性，這與機體應(yīng)激、藥物成癮性、疼痛、腦組織繼發(fā)損傷等多種病癥密切相關(guān)。例如，在腦缺血再灌注損傷中，缺血導(dǎo)致細胞外谷氨酸大量堆積，過度激活NR，使得大量Ca2?內(nèi)流，引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。在藥物成癮方面，NR參與了成癮藥物引起的神經(jīng)適應(yīng)性改變，其過度激活與成癮的形成和復(fù)吸密切相關(guān)。因此，選擇性干預(yù)NR活動，為相關(guān)疾病的治療提供了一個極具潛力的方向。目前，針對NR的干預(yù)手段主要依賴于NR拮抗劑或阻斷劑，這些藥物均為人工合成的小分子藥物。雖然它們能夠較容易地彌散通過血腦屏障，但存在諸多局限性。一方面，其作用選擇性低，在阻斷NR活性的同時，會對其他正常生理過程產(chǎn)生干擾，常引發(fā)意識模糊、焦慮不安、幻覺等嚴重毒副作用。另一方面，由于這些藥物的作用特點，難以在疾病的超早期進行有效用藥，限制了其臨床應(yīng)用。鑒于現(xiàn)有NR拮抗劑的不足，開發(fā)新型的NR干預(yù)策略顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，NR1作為NR的功能亞單位，具備NR的一切電生理學(xué)特性和藥理學(xué)活性。制備NR1口服疫苗成為超早期調(diào)控機體應(yīng)激、防止腦損傷、減緩藥物成癮和治療疼痛等的一種可行思路。通過口服疫苗的方式，激發(fā)機體自身的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對NR1的抗體，從而實現(xiàn)對NR活性的選擇性調(diào)節(jié)，有望避免小分子拮抗劑的諸多弊端。但NR1抗原難以獨自通過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，因此需要合適的載體。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TransferrinReceptor，TFR）在血腦屏障上高度表達，其單克隆抗體OX-26是迄今被認為最有前途的腦轉(zhuǎn)運載體。OX-26能夠特異性地與TFR結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用跨越血腦屏障。將NR1抗原與OX-26相結(jié)合，利用其作為載體攜帶NR1抗體通過血腦屏障，使得NR1抗體能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，為NR1口服疫苗的應(yīng)用提供了可能。本研究聚焦于NR1-TFR重組表位疫苗的制備及其在真核細胞中的表達，旨在為相關(guān)疾病的治療提供新的策略和實驗基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在利用噬菌體肽庫展示技術(shù)模擬小鼠NR1和TFR的抗原表位，構(gòu)建NR1-TfR融合蛋白真核表達載體，并進一步構(gòu)建單B細胞表位疫苗。通過這一系列實驗操作，期望實現(xiàn)對NR1活性的精準調(diào)控，為相關(guān)疾病的治療提供新的有效手段。目前，針對NR過度激活所介導(dǎo)的一系列疾病，如機體應(yīng)激、藥物成癮性、疼痛以及腦組織繼發(fā)損傷等，現(xiàn)有的治療方法存在諸多不足?，F(xiàn)有的NR拮抗劑或阻斷劑作為人工合成的小分子藥物，雖然能夠通過血腦屏障，但作用選擇性低，會對其他正常生理過程產(chǎn)生干擾，引發(fā)嚴重的毒副作用，如意識模糊、焦慮不安、幻覺等，這極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。而且，這些小分子藥物難以在疾病的超早期進行有效用藥，使得患者錯過最佳治療時機。本研究構(gòu)建NR1-TfR融合蛋白真核表達載體及單B細胞表位疫苗具有重要的意義。一方面，從作用機制上看，NR1作為NR的功能亞單位，具備NR的一切電生理學(xué)特性和藥理學(xué)活性，通過制備NR1口服疫苗，激發(fā)機體自身的免疫反應(yīng)產(chǎn)生針對NR1的抗體，能夠?qū)崿F(xiàn)對NR活性的選擇性調(diào)節(jié)，有望克服現(xiàn)有小分子拮抗劑的選擇性低的問題。另一方面，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26作為腦轉(zhuǎn)運載體，可攜帶NR1抗體通過血腦屏障，使NR1抗體能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，解決了NR1抗原難以獨自通過血腦屏障的難題，為超早期調(diào)控機體應(yīng)激、防止腦損傷、減緩藥物成癮和治療疼痛等提供了可能。此外，本研究的成果還可能在以下方面產(chǎn)生積極影響。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，為深入探究NR在生理和病理狀態(tài)下的作用機制提供了新的研究工具和思路，有助于進一步揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機制。在臨床應(yīng)用方面，一旦該疫苗研發(fā)成功并通過臨床試驗，將為相關(guān)疾病患者提供一種全新的、更安全有效的治療選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景，有望改善患者的生活質(zhì)量，減輕社會和家庭的醫(yī)療負擔。二、NR1-TFR重組表位疫苗制備的理論基礎(chǔ)2.1NR1與TFR的結(jié)構(gòu)和功能2.1.1NR1的結(jié)構(gòu)與生理功能NR1作為N-甲基-D-天冬氨酸受體（NR）的功能亞單位，在NR的組成和功能發(fā)揮中起著核心作用。從結(jié)構(gòu)上看，NR1亞單位具有獨特的分子結(jié)構(gòu)特征。其蛋白由多個結(jié)構(gòu)域組成，包含胞外的N端結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)的C端結(jié)構(gòu)域。其中，N端結(jié)構(gòu)域參與受體的組裝和定位，對維持受體的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域則能夠特異性地與甘氨酸等配體結(jié)合，甘氨酸的結(jié)合是NR1激活的關(guān)鍵步驟之一?？缒そY(jié)構(gòu)域由多個跨膜螺旋組成，這些螺旋形成了離子通道的物理結(jié)構(gòu)，控制著離子的進出。C端結(jié)構(gòu)域含有多個磷酸化位點，通過磷酸化和去磷酸化修飾，參與調(diào)節(jié)受體的功能，例如影響受體與其他信號分子的相互作用，進而調(diào)控下游信號通路。在生理狀態(tài)下，NR1參與了眾多重要的生理過程。在神經(jīng)元的發(fā)育過程中，NR1對神經(jīng)元的存活起著關(guān)鍵作用。研究表明，缺乏NR1的神經(jīng)元在發(fā)育早期會出現(xiàn)大量凋亡，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常構(gòu)建。同時，NR1在樹突和軸突的結(jié)構(gòu)發(fā)育中也扮演著重要角色，它參與調(diào)節(jié)樹突棘的形態(tài)和密度，以及軸突的生長和導(dǎo)向，對神經(jīng)元之間的連接和信號傳遞的建立具有重要意義。在學(xué)習和記憶過程中，NR1介導(dǎo)的突觸可塑性是其關(guān)鍵機制之一。當神經(jīng)元接收到適當?shù)拇碳r，NR1被激活，導(dǎo)致Ca2?內(nèi)流，激活一系列下游信號通路，如CaMKⅡ等，這些信號通路的激活引發(fā)了突觸后膜上AMPA受體的插入和功能增強，從而增強突觸傳遞效能，形成長時程增強（LTP），這是學(xué)習和記憶的重要細胞機制。然而，在應(yīng)激、腦損傷等病理狀態(tài)下，NR1卻發(fā)揮著不同的作用。在機體受到應(yīng)激刺激時，體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生紊亂，谷氨酸大量釋放，過度激活NR1。NR1的過度激活使得大量Ca2?內(nèi)流，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載。鈣超載會激活一系列鈣依賴性酶，如蛋白酶、核酸酶和磷脂酶等，這些酶的異常激活會導(dǎo)致神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受損，引發(fā)神經(jīng)元凋亡和壞死。在腦損傷中，如腦缺血再灌注損傷，缺血導(dǎo)致局部腦組織缺氧，能量代謝障礙，細胞膜去極化，促使谷氨酸大量釋放，同樣過度激活NR1。過度激活的NR1不僅通過鈣超載導(dǎo)致神經(jīng)元直接損傷，還會引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進一步加重腦組織的損傷。例如，激活的小膠質(zhì)細胞會釋放大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥因子會破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)元損傷的加重。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量自由基，如超氧陰離子、羥自由基等，會攻擊細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細胞損傷和死亡。2.1.2TFR的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運功能轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在鐵代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中具有重要作用。其結(jié)構(gòu)由兩個大小約為90KDa的亞單位通過兩條二硫鍵交聯(lián)而成。每個亞單位包含一個較大的胞外C端區(qū)域、一個單跨膜區(qū)域和一個相對較小的N端區(qū)域。胞外C端區(qū)域具有高度的折疊結(jié)構(gòu)，形成了與轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）結(jié)合的特異性位點，該位點能夠以高親和力與TF結(jié)合，實現(xiàn)對鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物的識別和捕獲。單跨膜區(qū)域則貫穿細胞膜，將TFR錨定在細胞膜上，同時為TFR在細胞內(nèi)吞和外排過程中的膜泡運輸提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。N端區(qū)域位于細胞內(nèi)，雖然相對較小，但在信號傳導(dǎo)和細胞內(nèi)吞的調(diào)控中發(fā)揮著作用，例如與一些參與內(nèi)吞過程的銜接蛋白相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)吞的起始和進行。TFR的主要生理功能是介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運，維持細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。在鐵轉(zhuǎn)運過程中，首先TF在血漿中與Fe3?結(jié)合，形成全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（holo-TF）。holo-TF通過血液循環(huán)到達細胞表面，與TFR1受體特異性結(jié)合。結(jié)合后的復(fù)合物通過細胞內(nèi)吞作用進入核內(nèi)體。在核內(nèi)體的偏酸性環(huán)境（pH約為5.5-6.0）中，TF與Fe3?分離，STEAP3將Fe3?還原成Fe2?，F(xiàn)e2?被DMT1運輸?shù)郊毎|(zhì)里，參與細胞內(nèi)的各種代謝過程，如DNA合成、細胞呼吸等。釋放Fe3?后的TF與TFR1組成TF/TFR1復(fù)合物，通過胞吐作用回到細胞表面。在細胞表面，TF與TFR1分離，成為脫鐵TF（apo-TF），apo-TF再與細胞外的Fe3?重新結(jié)合，進行下一個鐵運輸循環(huán)過程。特別值得關(guān)注的是，TFR在血腦屏障上高度表達，使其成為一種極具潛力的腦轉(zhuǎn)運載體。血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細胞、基底膜和星形膠質(zhì)細胞等組成，形成了一道緊密的屏障，限制了大多數(shù)物質(zhì)的自由通過。然而，TFR可以利用其與TF的特異性結(jié)合以及受體介導(dǎo)的胞吞作用，攜帶與之結(jié)合的物質(zhì)跨越血腦屏障。例如，當TFR與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體OX-26結(jié)合后，OX-26可以利用TFR的這種跨膜運輸特性，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入腦微血管內(nèi)皮細胞，形成內(nèi)吞小泡。在內(nèi)吞小泡的運輸過程中，小泡與細胞內(nèi)的其他膜泡發(fā)生融合和分選，最終將攜帶的物質(zhì)釋放到腦組織中，實現(xiàn)了物質(zhì)從血液到腦組織的轉(zhuǎn)運。這種特性使得TFR在藥物遞送領(lǐng)域，尤其是腦部疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價值。在本研究中，將NR1抗原與OX-26相結(jié)合，利用TFR作為載體攜帶NR1抗體通過血腦屏障，為NR1口服疫苗在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用提供了可能。2.2抗原表位篩選原理2.2.1噬菌體肽庫展示技術(shù)噬菌體肽庫展示技術(shù)是一種強大的分子生物學(xué)工具，在抗原表位篩選中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本原理是將外源肽段的基因插入到噬菌體外殼蛋白基因中，使外源肽段與噬菌體外殼蛋白融合表達，并展示在噬菌體表面。這樣，噬菌體就成為了攜帶特定肽段信息的載體，通過構(gòu)建包含大量不同肽段的噬菌體肽庫，就可以在庫中篩選出與目標抗體具有特異性結(jié)合能力的噬菌體克隆。在篩選小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆時，噬菌體十二肽庫展示技術(shù)的具體流程如下。首先，準備小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26，并將其固定在固相載體上，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）板的孔中。然后，將噬菌體十二肽庫加入到固相載體中，使噬菌體與固定的OX-26抗體充分接觸。在這個過程中，噬菌體表面展示的肽段會與OX-26抗體進行相互作用，只有那些與OX-26抗體具有較高親和力的噬菌體能夠特異性地結(jié)合在抗體上。經(jīng)過一段時間的孵育后，未結(jié)合的噬菌體通過洗滌步驟被去除，而結(jié)合在OX-26抗體上的噬菌體則被保留下來。為了進一步富集與OX-26抗體特異性結(jié)合的噬菌體，需要對結(jié)合的噬菌體進行洗脫和擴增。洗脫過程使用適當?shù)南疵撘?，如酸性緩沖液，將結(jié)合的噬菌體從抗體上洗脫下來。洗脫后的噬菌體被收集起來，并感染宿主細菌（如大腸桿菌）進行擴增。在宿主細菌中，噬菌體可以大量繁殖，從而增加特異性噬菌體的數(shù)量。經(jīng)過多輪的吸附-洗脫-擴增循環(huán)后，與OX-26抗體特異性結(jié)合的噬菌體在肽庫中的比例會逐漸增加。最后，對富集后的噬菌體進行測序分析，確定其展示的肽段氨基酸序列。通過對多個克隆的測序和分析，篩選出與OX-26抗體結(jié)合能力最強、頻率最高的肽段序列，即為抗原表位優(yōu)勢克隆。在本研究中，通過該技術(shù)篩選出小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆氨基酸序列為GHIHSMRHHRPT。將人工合成的含目的氨基酸DDWVISTQSLKSGGGGSGGGGSGGGGSGHIHSMRHHRPT的多肽分別用MAB363和OX-26進行westernblot檢測，均能在2KD-8KD范圍內(nèi)產(chǎn)生條帶，提示B細胞表位篩選正確，重組表位質(zhì)粒設(shè)計合理，所表達的蛋白能夠有效和相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。2.2.2B細胞表位篩選的意義B細胞表位是抗原分子中能夠被B細胞表面抗原受體（BCR）特異性識別并結(jié)合的區(qū)域，它在重組表位疫苗的設(shè)計和功能中具有至關(guān)重要的意義。從重組表位疫苗的設(shè)計角度來看，篩選正確的B細胞表位是保證疫苗有效性的關(guān)鍵前提。重組表位疫苗是基于抗原表位設(shè)計的新型疫苗，其原理是利用抗原表位來激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。如果篩選出的B細胞表位不準確，那么疫苗所包含的表位可能無法被機體的免疫系統(tǒng)有效識別，從而無法激發(fā)足夠強度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疫苗無法發(fā)揮預(yù)期的免疫保護作用。準確篩選出的B細胞表位能夠模擬天然抗原的免疫原性，使疫苗能夠精準地激活B細胞，促使B細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體。在疫苗的功能實現(xiàn)方面，篩選正確的B細胞表位能夠確保所表達的蛋白能有效和相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。當機體接種重組表位疫苗后，疫苗中的B細胞表位會被抗原呈遞細胞（APC）攝取、加工和呈遞，激活T細胞和B細胞。B細胞在T細胞的輔助下，分化為漿細胞并分泌抗體。只有當疫苗中包含的B細胞表位與機體產(chǎn)生的抗體能夠特異性結(jié)合時，才能形成有效的抗原-抗體復(fù)合物，進而激活補體系統(tǒng)、介導(dǎo)細胞免疫等一系列免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫保護作用。在本研究中，通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選出NR1和TFR的B細胞表位，并構(gòu)建重組表位疫苗。只有確保這些表位的準確性，才能保證重組表位疫苗在真核細胞中表達的蛋白能夠與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，實現(xiàn)對NR1活性的調(diào)控。如果表位篩選錯誤，可能導(dǎo)致疫苗表達的蛋白無法與抗體結(jié)合，無法阻斷NR1的過度激活，從而無法達到治療相關(guān)疾病的目的。篩選正確的B細胞表位對于重組表位疫苗的設(shè)計和功能實現(xiàn)具有不可替代的重要性，是保證疫苗有效性和安全性的關(guān)鍵因素。三、NR1-TFR重組表位疫苗的制備過程3.1小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26特異性抗原表位的篩選3.1.1實驗材料與方法實驗材料方面，噬菌體十二肽庫及受體菌ER2738購自NEB公司，其具備豐富的噬菌體克隆，為篩選提供了多樣的肽段來源。小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26購自LifeSpan公司，該抗體具有高特異性，能精準識別轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，是篩選抗原表位的關(guān)鍵試劑。M13噬菌體單鏈DNA快速提取試劑盒購自北京明日百傲公司，用于高效提取噬菌體單鏈DNA，為后續(xù)測序分析提供基礎(chǔ)。一站式Tricine-SDS-PAGE電泳試劑套裝為Andybio公司產(chǎn)品，可用于蛋白質(zhì)的分離和鑒定。預(yù)染窄譜蛋白相對分子質(zhì)量（Mr）標準（2000～71000）購自賽百盛公司，用于確定蛋白質(zhì)的分子量。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）及超敏ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天公司，用于westernblot檢測中的信號檢測。在篩選實驗步驟上，首先進行噬菌體12肽庫的篩選。取稀釋為100μg/mL的OX-26靶分子溶液150μL包被96孔板，4℃過夜，使OX-26抗體牢固結(jié)合在孔板表面。用含0.05%Tween-20的PBST緩沖液洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后加入300μL封閉液（含3%BSA的PBST），37℃孵育2小時，封閉孔板上的非特異性結(jié)合位點。棄去封閉液，加入1011pfu噬菌體12肽庫（用含1%BSA的PBST稀釋），37℃孵育2小時，讓噬菌體與OX-26抗體充分接觸和結(jié)合。用PBST洗滌10次，每次3分鐘，以徹底去除未結(jié)合的噬菌體。加入100μL洗脫液（0.1MHCl，用Tris-HCl調(diào)pH至2.2），室溫孵育10分鐘，將結(jié)合在OX-26抗體上的噬菌體洗脫下來。立即加入15μL中和液（1MTris-HCl，pH9.1），中和洗脫液的酸性，保護噬菌體。將洗脫的噬菌體感染處于對數(shù)生長期的受體菌ER2738，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使噬菌體在受體菌中擴增。將感染后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，長出單克隆菌落。對篩選得到的噬菌體進行單鏈DNA提取。挑取單克隆菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按照M13噬菌體單鏈DNA快速提取試劑盒說明書進行操作，提取噬菌體單鏈DNA。首先將菌液離心，去除上清液，收集菌體沉淀。加入裂解液，充分混勻，使菌體裂解，釋放出噬菌體單鏈DNA。然后通過一系列的離心、洗滌和洗脫步驟，得到純凈的噬菌體單鏈DNA。將提取的單鏈DNA送測序公司進行測序分析。通過測序得到噬菌體展示的肽段氨基酸序列。利用生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進行分析，與已知的蛋白質(zhì)序列進行比對，篩選出與OX-26抗體結(jié)合能力較強且出現(xiàn)頻率較高的肽段序列，即為抗原表位優(yōu)勢克隆。3.1.2實驗結(jié)果與分析通過噬菌體十二肽庫展示技術(shù)，成功篩選出小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆氨基酸序列為GHIHSMRHHRPT。這一序列的確定為后續(xù)重組表位疫苗的構(gòu)建提供了關(guān)鍵的抗原表位信息。為了驗證B細胞表位篩選的正確性，將人工合成的含目的氨基酸DDWVISTQSLKSGGGGSGGGGSGGGGSGHIHSMRHHRPT的多肽分別用MAB363和OX-26進行westernblot檢測。結(jié)果顯示，均能在2KD-8KD范圍內(nèi)產(chǎn)生條帶。在westernblot檢測中，條帶的出現(xiàn)意味著抗體與多肽發(fā)生了特異性結(jié)合。MAB363和OX-26均能與含目的氨基酸的多肽產(chǎn)生條帶，表明篩選出的抗原表位能夠被相應(yīng)抗體識別，說明B細胞表位篩選正確。這也進一步證實了重組表位質(zhì)粒設(shè)計合理，所表達的蛋白能夠有效和相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。如果B細胞表位篩選錯誤，那么抗體與多肽之間無法形成特異性結(jié)合，在westernblot檢測中就不會出現(xiàn)相應(yīng)條帶。本實驗的結(jié)果為NR1-TFR重組表位疫苗的后續(xù)研究和開發(fā)提供了重要的實驗依據(jù)，確保了疫苗構(gòu)建的準確性和有效性。3.2計算機預(yù)測分析NR1-TFR重組表位肽的空間結(jié)構(gòu)3.2.1預(yù)測軟件與方法本研究采用了多種專業(yè)的生物信息學(xué)軟件和工具來預(yù)測重組表位蛋白Pro-S的空間構(gòu)象，其中BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）蛋白數(shù)據(jù)庫在序列比對和同源性分析中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過將Pro-S蛋白質(zhì)序列提交至BLAST蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，能夠快速檢索出與之具有相似序列的已知蛋白質(zhì)。這種比對分析有助于判斷Pro-S是否與已有的蛋白質(zhì)具有較高的同源性，從而為后續(xù)對其結(jié)構(gòu)和功能的推測提供重要線索。如果發(fā)現(xiàn)與Pro-S同源性較高的蛋白質(zhì)，就可以借鑒已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能信息，對Pro-S進行初步的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測。為了深入分析Pro-S蛋白是否存在信號肽，我們使用了SignalP軟件。信號肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，對于蛋白質(zhì)的定位和分泌具有重要作用。SignalP軟件基于特定的算法，通過對蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析，能夠準確預(yù)測蛋白質(zhì)中是否存在信號肽以及信號肽的切割位點。這對于理解Pro-S在細胞內(nèi)的運輸和定位機制具有重要意義。如果Pro-S含有信號肽，那么它可能會被運輸?shù)郊毎奶囟ú课唬鐑?nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，進行進一步的加工和修飾。TMHMM軟件則用于預(yù)測Pro-S是否為跨膜蛋白?？缒さ鞍资且活愗灤┘毎さ牡鞍踪|(zhì)，在細胞的物質(zhì)運輸、信號傳遞等過程中發(fā)揮著重要作用。TMHMM軟件通過分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)特征，能夠準確判斷蛋白質(zhì)是否為跨膜蛋白以及跨膜區(qū)域的位置。了解Pro-S是否為跨膜蛋白，有助于推測其在細胞中的功能和作用方式。如果Pro-S是跨膜蛋白，那么它可能參與了細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換或信號傳遞過程。通過一系列生物信息學(xué)分析，我們還對Pro-S蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測。在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方面，使用了諸如PSIPRED等軟件。PSIPRED軟件基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，結(jié)合蛋白質(zhì)序列的進化信息，能夠預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)元件，如α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等。通過對Pro-S二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，我們可以初步了解蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象特征，為進一步構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型提供基礎(chǔ)。在三級結(jié)構(gòu)預(yù)測中，采用了同源建模和從頭預(yù)測等方法。同源建模是利用與Pro-S具有較高同源性的已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為模板，通過序列比對和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，構(gòu)建Pro-S的三級結(jié)構(gòu)模型。如果在BLAST搜索中找到了合適的同源模板，就可以使用Modeller等軟件進行同源建模。從頭預(yù)測則是在沒有合適同源模板的情況下，基于物理化學(xué)原理和能量優(yōu)化算法，直接從蛋白質(zhì)序列預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)。通過這些方法的綜合應(yīng)用，我們能夠較為準確地預(yù)測重組表位蛋白Pro-S的空間構(gòu)象。3.2.2空間結(jié)構(gòu)分析結(jié)果通過計算機預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)Pro-S蛋白質(zhì)序列在BLAST蛋白數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源性較高（>30%）的蛋白質(zhì)。這表明Pro-S具有獨特的氨基酸序列，可能代表著一種新型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這種獨特性使得對Pro-S的結(jié)構(gòu)和功能研究具有重要的探索價值，因為它可能具有尚未被揭示的生物學(xué)功能。缺乏同源性較高的蛋白質(zhì)作為參考，也增加了對其結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測的難度，需要更多的實驗和分析方法來深入探究。進一步分析顯示，Pro-S蛋白內(nèi)不含信號肽，屬非跨膜蛋白。這一結(jié)構(gòu)特征對其在細胞內(nèi)的分布和功能具有重要影響。由于沒有信號肽，Pro-S不會被引導(dǎo)進入細胞的分泌通路，而是主要存在于細胞質(zhì)中。非跨膜蛋白的特性決定了它不會貫穿細胞膜，因此不參與細胞內(nèi)外的物質(zhì)運輸和信號直接傳遞過程。相反，它可能在細胞質(zhì)中參與一些生化反應(yīng)的催化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)或者與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。例如，它可能作為一種酶，催化細胞內(nèi)的某些代謝反應(yīng)；或者作為一種調(diào)節(jié)蛋白，與其他信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細胞的生理過程。值得關(guān)注的是，Pro-S蛋白不含半胱氨酸，因此未形成二硫化合物影響蛋白折疊和功能發(fā)揮。半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵，二硫鍵對于維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用。在Pro-S中不存在半胱氨酸，也就避免了二硫鍵形成過程中可能出現(xiàn)的錯誤折疊和功能異常。這使得Pro-S的折疊過程更加簡單直接，有利于保證其正確的空間構(gòu)象和生物學(xué)功能。同時，Pro-S不含α螺旋以保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。α螺旋是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的一種常見形式，雖然α螺旋在一些蛋白質(zhì)中有助于維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但在Pro-S中，其獨特的結(jié)構(gòu)可能通過其他方式來實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，如β-折疊和無規(guī)卷曲之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用等。特別重要的是，NR1和TFR的抗原表位處于蛋白分子的表面，具有良好的抗原性、親水性。抗原表位位于蛋白分子表面，使得它們更容易被免疫系統(tǒng)識別。當機體接觸到Pro-S時，免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細胞（APC）能夠更有效地攝取和加工Pro-S，將其抗原表位呈遞給T細胞和B細胞。親水性則使得抗原表位能夠與免疫細胞表面的受體充分接觸和結(jié)合，增強免疫細胞對抗原的識別和反應(yīng)。這一系列結(jié)構(gòu)特征提示Pro-S抗原性較好，可能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。當Pro-S作為疫苗成分進入機體后，能夠激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，促使B細胞分化為漿細胞，分泌特異性抗體。這些抗體可以與NR1或TFR結(jié)合，阻斷它們的生物學(xué)活性，從而實現(xiàn)對相關(guān)疾病的治療和預(yù)防作用。3.3NR1-TFR真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組表位疫苗的制備3.3.1構(gòu)建真核表達質(zhì)粒在構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR的過程中，首先要進行目的片段的獲取。本研究中，目的片段是將MAB363和OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆通過linker串聯(lián)人工合成的重組表位肽，命名為S。通過化學(xué)合成的方法獲得含有目的片段的DNA序列，在合成過程中，確保DNA序列的準確性至關(guān)重要?；瘜W(xué)合成公司通常會采用先進的合成技術(shù)，如固相亞磷酰胺三酯法，這種方法能夠精確地按照設(shè)計的序列將核苷酸逐個連接起來。在合成完成后，會對DNA序列進行嚴格的質(zhì)量檢測，包括測序驗證，以保證序列與設(shè)計完全一致。獲取目的片段后，需要對目的片段和真核表達載體pcDNA3.1(+)進行雙酶切處理。選擇合適的限制性內(nèi)切酶是關(guān)鍵步驟，本研究選用了BamHⅠ和XhoⅠ這兩種限制性內(nèi)切酶。這兩種酶在目的片段和載體上均有特異性的識別位點，且酶切后產(chǎn)生的粘性末端能夠互補配對。在進行雙酶切反應(yīng)時，需要嚴格控制反應(yīng)條件。反應(yīng)體系一般包括適量的目的片段或載體DNA、限制性內(nèi)切酶、相應(yīng)的緩沖液以及無菌水。緩沖液的作用是提供適宜的離子強度和pH環(huán)境，保證限制性內(nèi)切酶的活性。反應(yīng)溫度通常設(shè)置為37℃，這是大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度。反應(yīng)時間一般為2-4小時，以確保酶切反應(yīng)充分進行。酶切反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行鑒定。在瓊脂糖凝膠中，DNA分子會在電場的作用下向正極移動，不同大小的DNA片段由于遷移速率不同，會在凝膠上形成不同的條帶。通過與DNAmarker進行對比，可以確定酶切產(chǎn)物的大小是否符合預(yù)期。如果酶切產(chǎn)物的條帶大小與理論值一致，說明酶切反應(yīng)成功。將酶切后的目的片段和載體進行連接反應(yīng)，使用T4DNA連接酶將兩者連接起來。連接反應(yīng)的原理是T4DNA連接酶能夠催化目的片段和載體的粘性末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將它們連接成一個完整的重組質(zhì)粒。在連接反應(yīng)中，需要注意酶切質(zhì)粒與酶切目的片段的比例，一般將其比值設(shè)置為1:3或者1:4。這是因為適當?shù)谋壤梢蕴岣哌B接效率，增加重組質(zhì)粒的產(chǎn)量。如果目的片段的比例過低，可能導(dǎo)致載體自連的情況增多；而目的片段比例過高，則可能會出現(xiàn)多拷貝插入的現(xiàn)象。連接反應(yīng)體系中還包括T4DNA連接酶、緩沖液等成分，緩沖液為連接酶提供適宜的反應(yīng)環(huán)境。反應(yīng)溫度一般為16℃，反應(yīng)時間為過夜，即12-16小時。較低的反應(yīng)溫度和較長的反應(yīng)時間有利于粘性末端之間的堿基互補配對和磷酸二酯鍵的形成，提高連接的成功率。3.3.2轉(zhuǎn)化與疫苗制備將構(gòu)建好的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR轉(zhuǎn)化入減毒傷寒沙門桿菌，采用電穿孔的方法。電穿孔是一種利用高壓電脈沖在細胞膜上形成瞬間小孔，使外源DNA能夠進入細胞的技術(shù)。在進行電穿孔轉(zhuǎn)化時，首先要制備減毒傷寒沙門桿菌的感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞是指處于容易吸收外源DNA的生理狀態(tài)的細胞。制備感受態(tài)細胞的過程通常包括將減毒傷寒沙門桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后通過一系列的處理，如低溫、CaCl?處理等，使細胞的細胞膜通透性增加，成為感受態(tài)細胞。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞混合，置于電穿孔杯中。電穿孔杯是一種特制的容器，能夠提供電場作用的空間。設(shè)置合適的電穿孔參數(shù)，如電壓、電容和電阻等。電壓一般在1.8-2.5kV之間，電容為25μF，電阻為200Ω。這些參數(shù)的設(shè)置會影響電脈沖的強度和持續(xù)時間，從而影響細胞膜上小孔的形成和外源DNA的進入效率。在電穿孔過程中，高壓電脈沖會在細胞膜上形成小孔，真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR通過這些小孔進入減毒傷寒沙門桿菌細胞內(nèi)。電穿孔完成后，需要將細胞迅速轉(zhuǎn)移至含有合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，進行復(fù)蘇培養(yǎng)。復(fù)蘇培養(yǎng)的目的是讓細胞恢復(fù)正常的生理狀態(tài)，修復(fù)電穿孔過程中造成的損傷。一般將細胞在37℃、振蕩培養(yǎng)1-2小時，使細胞能夠重新開始生長和繁殖。將轉(zhuǎn)化后的減毒傷寒沙門桿菌進行培養(yǎng)和篩選，以制備減毒活疫苗。在培養(yǎng)過程中，選擇含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。氨芐青霉素是一種抗生素，能夠抑制未轉(zhuǎn)化的減毒傷寒沙門桿菌的生長，只有成功轉(zhuǎn)化了含有氨芐青霉素抗性基因的真核表達質(zhì)粒的細菌才能在這種培養(yǎng)基上生長。將復(fù)蘇后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，單個細菌會不斷分裂繁殖，形成肉眼可見的菌落。這些菌落中就包含了含有真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR的減毒傷寒沙門桿菌。為了進一步篩選出含有正確重組質(zhì)粒的菌落，需要對單克隆菌落進行鑒定?？梢圆捎镁銹CR的方法，以菌落為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。如果菌落中含有正確的重組質(zhì)粒，PCR擴增會得到預(yù)期大小的條帶。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，與DNAmarker對比，判斷條帶大小是否符合預(yù)期。還可以對篩選出的菌落進行測序分析，以確定重組質(zhì)粒的序列是否正確。對鑒定正確的菌落進行大量培養(yǎng)，收集菌體，經(jīng)過一系列的處理，如離心、洗滌等，制備成濃度為1.6×10?cfu/ml的減毒活疫苗。在疫苗制備過程中，要嚴格控制各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量，確保疫苗的安全性和有效性。例如，要對疫苗的純度、活性、無菌性等進行檢測，保證疫苗符合相關(guān)的質(zhì)量標準。四、NR1-TFR重組表位疫苗在真核細胞中的表達研究4.1真核細胞轉(zhuǎn)染實驗4.1.1轉(zhuǎn)染細胞選擇與準備在真核細胞轉(zhuǎn)染實驗中，本研究選用HEK293細胞作為轉(zhuǎn)染對象。HEK293細胞即人胚腎細胞系293，它是一種在分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛的細胞系。1973年，科學(xué)家從發(fā)生流產(chǎn)的人類胚胎中的腎臟組織中成功分離出該細胞，隨后經(jīng)5型腺病毒DNA片段轉(zhuǎn)染實現(xiàn)永生化。HEK293細胞具有諸多適合本實驗的特性。從生長特性來看，它既可以貼壁生長，呈扁平狀，直徑約在11-15μm之間；也能在懸浮培養(yǎng)條件下生長，此時細胞呈圓形。這種生長方式的靈活性為不同的實驗需求提供了便利。其轉(zhuǎn)染效率較高，常用的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和電穿孔等轉(zhuǎn)染方法，對HEK293細胞的轉(zhuǎn)染效率可達90%以上。在本研究中，高轉(zhuǎn)染效率有助于將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR成功導(dǎo)入細胞，為后續(xù)的基因表達研究提供保障。而且，HEK293細胞能夠高效表達外源蛋白。由于本研究旨在探究NR1-TFR重組表位疫苗在真核細胞中的表達，HEK293細胞的這一特性能夠使重組表位蛋白得到有效表達，便于后續(xù)對表達產(chǎn)物的檢測和分析。在實驗前，需對HEK293細胞進行細致的準備工作。從液氮中取出凍存的HEK293細胞，迅速放入37℃水浴中解凍，期間輕輕搖動凍存管，使其快速完全融化。將解凍后的細胞懸液加入到含有預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基的離心管中，DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗，這些成分能夠為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，并防止細胞污染。輕輕吹打混勻后，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。離心后棄去上清液，加入適量新鮮的上述DMEM培養(yǎng)基，將細胞懸液重懸并轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。當細胞生長至60%-70%融合度時，需要進行傳代培養(yǎng)。首先，吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰酶和EDTA消化液，37℃孵育3-5分鐘，期間在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，直到大部分細胞變圓并開始脫落。立即加入含有血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞懸液，使其均勻分散。將細胞懸液按照1:3或1:4的比例轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在傳代過程中，要嚴格遵守無菌操作原則，避免細胞污染，同時注意控制消化時間，防止過度消化對細胞造成損傷。4.1.2轉(zhuǎn)染操作與條件優(yōu)化本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒Vec-s（即真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1/TFR）轉(zhuǎn)染入HEK293細胞。脂質(zhì)體是一種人工合成的磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠與DNA結(jié)合形成復(fù)合物。當脂質(zhì)體與細胞接觸時，可通過膜融合或內(nèi)吞作用將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)。這種方法操作相對簡單，適用范圍廣，對HEK293細胞有較好的轉(zhuǎn)染效果。在轉(zhuǎn)染前，需對細胞進行預(yù)處理。將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HEK293細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，使細胞密度達到5×10?個/孔左右。將培養(yǎng)板放置在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至70%-80%融合度時進行轉(zhuǎn)染。細胞生長狀態(tài)和密度對轉(zhuǎn)染效率有重要影響，處于對數(shù)生長期且密度適宜的細胞能夠更好地攝取外源DNA。轉(zhuǎn)染操作步驟如下：在無菌EP管中，分別加入適量的質(zhì)粒Vec-s和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。本研究選用的是Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書，將質(zhì)粒Vec-s（質(zhì)量為2μg）與Lipofectamine3000試劑（體積為5μl）分別加入到100μl無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。孵育結(jié)束后，將兩者混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20分鐘，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。在孵育過程中，脂質(zhì)體與質(zhì)粒會通過靜電作用相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種復(fù)合物能夠更有效地被細胞攝取。吸去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，然后每孔加入1.8ml無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。將孵育好的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物緩慢加入到每孔細胞中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細胞表面。將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4-6小時。在孵育過程中，脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物會通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)。4-6小時后，吸去含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果，對轉(zhuǎn)染時間和溫度等條件進行了優(yōu)化。在轉(zhuǎn)染時間優(yōu)化方面，分別設(shè)置了轉(zhuǎn)染2小時、4小時、6小時、8小時和10小時的實驗組。在轉(zhuǎn)染結(jié)束后，通過檢測細胞內(nèi)目的基因的表達水平來評估轉(zhuǎn)染效果。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測目的基因的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6小時組的目的基因表達水平顯著高于其他組。在轉(zhuǎn)染溫度優(yōu)化方面，分別設(shè)置了35℃、37℃和39℃三個溫度條件。同樣通過實時熒光定量PCR檢測目的基因表達水平，結(jié)果顯示37℃條件下轉(zhuǎn)染效果最佳。經(jīng)過優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)染條件為：采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，質(zhì)粒與試劑比例為2μg:5μl，轉(zhuǎn)染時間為6小時，轉(zhuǎn)染溫度為37℃。在這些優(yōu)化條件下，能夠提高質(zhì)粒Vec-s轉(zhuǎn)染HEK293細胞的效率，為后續(xù)對NR1-TFR重組表位疫苗在真核細胞中表達的研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)。4.2表達檢測與分析4.2.1Westernblot檢測技術(shù)Westernblot檢測技術(shù)是一種在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的重要技術(shù)，其原理基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，能夠從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中特異性地檢測出目標蛋白質(zhì)。在本研究中，該技術(shù)用于檢測真核細胞轉(zhuǎn)染后NR1-TFR重組表位蛋白的表達情況。其基本原理如下：首先，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對細胞裂解液中的蛋白質(zhì)進行分離。在電泳過程中，蛋白質(zhì)在電場的作用下在凝膠中遷移，分子量較小的蛋白質(zhì)遷移速度較快，而分子量較大的蛋白質(zhì)遷移速度較慢，從而實現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的分離。然后，利用電轉(zhuǎn)印技術(shù)將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體膜上，常用的固相載體膜有硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。電轉(zhuǎn)印過程利用電場力，使蛋白質(zhì)從凝膠中脫離并轉(zhuǎn)移到膜上，這樣膜上就復(fù)制了凝膠中蛋白質(zhì)的分布情況。轉(zhuǎn)移完成后，膜上的蛋白質(zhì)需要進行封閉處理，以防止后續(xù)加入的抗體與膜表面發(fā)生非特異性結(jié)合。封閉通常使用含有蛋白質(zhì)（如脫脂奶粉或牛血清白蛋白）的封閉液，這些蛋白質(zhì)能夠占據(jù)膜上的非特異性結(jié)合位點。接下來，將膜與特異性的一抗孵育，一抗能夠識別并結(jié)合目標蛋白質(zhì)上的特定抗原表位。在本研究中，分別使用MAB363和OX-26作為一抗。MAB363能夠特異性地識別NR1的抗原表位，OX-26則能特異性地識別TFR的抗原表位。孵育一段時間后，洗去未結(jié)合的一抗，再加入與一抗來源物種相匹配的二抗。二抗通常標記有辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等酶。在本研究中，使用的是辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）作為二抗。二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。當加入相應(yīng)的底物時，標記在二抗上的酶會催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號。如果使用的是HRP標記的二抗，加入化學(xué)發(fā)光底物（如魯米諾和過氧化氫）后，HRP會催化魯米諾發(fā)光，通過曝光X光膠片或使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，就可以檢測到蛋白質(zhì)條帶的位置和強度。在本研究的具體操作流程中，首先收集轉(zhuǎn)染后的HEK293細胞。將細胞用PBS緩沖液洗滌2-3次，以去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的細胞裂解液，在冰上孵育30分鐘，使細胞充分裂解，釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解后的細胞懸液在4℃下，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保上樣蛋白量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠中進行電泳。電泳時，先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，使蛋白質(zhì)在濃縮膠中聚集，然后在120V電壓下進行分離膠電泳，使蛋白質(zhì)依據(jù)分子量大小進行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)印時，采用濕轉(zhuǎn)法，在轉(zhuǎn)印緩沖液中，以300mA電流轉(zhuǎn)印1.5-2小時。轉(zhuǎn)印完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1-2小時。封閉結(jié)束后，將膜分別與稀釋好的MAB363和OX-26一抗在4℃下孵育過夜。第二天，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。然后將膜與稀釋好的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗在室溫下孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10分鐘。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光X光膠片，或者使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測。4.2.2檢測結(jié)果分析通過Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)vec-s轉(zhuǎn)染后的細胞總蛋白在MAB363和OX-26分別做一抗檢測時，在2KD-8KD范圍內(nèi)可見相應(yīng)條帶。這一結(jié)果表明，真核表達質(zhì)粒vec-s成功在真核細胞HEK293中實現(xiàn)了表達。在2KD-8KD范圍內(nèi)出現(xiàn)條帶，與之前通過計算機預(yù)測分析得到的重組表位蛋白Pro-S的分子量大小相符合。這進一步證實了真核表達質(zhì)粒vec-s在真核細胞中表達的準確性和可靠性。如果表達質(zhì)粒未能成功表達，或者表達的蛋白發(fā)生錯誤折疊、降解等情況，那么在Westernblot檢測中就可能無法在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)出現(xiàn)條帶，或者條帶的強度會明顯減弱。在MAB363作為一抗檢測時出現(xiàn)條帶，說明表達的蛋白中包含了NR1的抗原表位，且該抗原表位能夠被MAB363特異性識別和結(jié)合。同樣，在OX-26作為一抗檢測時出現(xiàn)條帶，表明表達的蛋白中存在TFR的抗原表位，并且能夠與OX-26特異性結(jié)合。這充分證明了構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒vec-s能夠在真核細胞中準確表達出包含NR1和TFR抗原表位的重組表位蛋白。而且，條帶的清晰程度和強度也反映了蛋白的表達水平。清晰且強度較高的條帶說明蛋白表達量較高，反之則表達量較低。本研究中出現(xiàn)的清晰條帶，提示真核表達質(zhì)粒vec-s在真核細胞中的表達水平較為可觀，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究成功利用噬菌體十二肽庫展示技術(shù)篩選出小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆，其氨基酸序列為GHIHSMRHHRPT。