臨床實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)操作手冊(cè)4.標(biāo)本接收與處理4.1標(biāo)本接收核對(duì)1.信息核對(duì)：接收標(biāo)本時(shí)，需核對(duì)以下信息：患者信息：姓名、病歷號(hào)、性別、年齡、科室、床號(hào)；標(biāo)本信息：標(biāo)本類型（如血液、尿液、痰液）、采集時(shí)間、采集部位、保存條件（如冷藏、室溫）；申請(qǐng)信息：檢測(cè)項(xiàng)目（如細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏、真菌培養(yǎng)）、臨床診斷。2.標(biāo)本質(zhì)量檢查：容器檢查：標(biāo)本容器是否破損、泄漏，蓋子是否擰緊；標(biāo)本量檢查：血液標(biāo)本≥2ml（成人）/1ml（兒童），尿液標(biāo)本≥10ml，痰液標(biāo)本≥1ml；保存條件檢查：需冷藏的標(biāo)本（如糞便、腦脊液）是否在采集后1小時(shí)內(nèi)冷藏（4℃），需室溫保存的標(biāo)本（如血液培養(yǎng)瓶）是否未超過(guò)2小時(shí)。3.不合格標(biāo)本處理：若標(biāo)本不符合要求（如容器破損、標(biāo)本量不足、保存不當(dāng)），需立即聯(lián)系臨床醫(yī)生，說(shuō)明原因，并建議重新采集；記錄不合格標(biāo)本信息（患者姓名、標(biāo)本類型、不合格原因、處理結(jié)果），存入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS）。4.2常見(jiàn)標(biāo)本處理方法4.2.1血液標(biāo)本（血培養(yǎng)）處理時(shí)間：收到標(biāo)本后1小時(shí)內(nèi)接種。操作步驟：1.核對(duì)血培養(yǎng)瓶信息（患者姓名、病歷號(hào)、標(biāo)本類型）；2.用75%乙醇消毒血培養(yǎng)瓶橡膠塞，待干；3.用注射器抽取血液，注入血培養(yǎng)瓶（需氧瓶/厭氧瓶），成人每瓶注入8-10ml，兒童每瓶注入1-3ml；4.輕輕顛倒血培養(yǎng)瓶5-10次，使血液與培養(yǎng)基充分混合；5.將血培養(yǎng)瓶放入血培養(yǎng)儀，設(shè)置孵育條件（35℃，連續(xù)監(jiān)測(cè)5天）。4.2.2尿液標(biāo)本處理時(shí)間：收到標(biāo)本后2小時(shí)內(nèi)處理（若無(wú)法及時(shí)處理，需冷藏4℃保存，不超過(guò)24小時(shí)）。操作步驟：1.混勻尿液標(biāo)本，用無(wú)菌吸管取10μl尿液，接種于血平板（需氧）和麥康凱平板（選擇腸道桿菌）；2.用L型涂布棒將尿液均勻涂布于平板表面，形成連續(xù)菌膜；3.35℃需氧孵育18-24小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)（CFU/ml）：≥10?CFU/ml：提示尿路感染；10?-10?CFU/ml：可疑感染（需結(jié)合臨床癥狀）；<10?CFU/ml：污染（除非有特殊臨床提示）。4.2.3痰液標(biāo)本合格標(biāo)本篩選：通過(guò)直接涂片鏡檢判斷標(biāo)本質(zhì)量，合格標(biāo)準(zhǔn)為：鱗狀上皮細(xì)胞（SqE）<10個(gè)/低倍視野（LPF），白細(xì)胞（WBC）>25個(gè)/LPF（或SqE:WBC<1:2.5）。處理步驟：1.合格標(biāo)本：用無(wú)菌生理鹽水沖洗2-3次，去除口腔雜質(zhì)，取深部痰液接種于血平板（需氧）、巧克力平板（嗜血桿菌）、麥康凱平板（腸道桿菌）；2.不合格標(biāo)本：反饋臨床，建議重新采集（如晨痰、深部咳嗽痰）。4.2.4糞便標(biāo)本處理時(shí)間：收到標(biāo)本后2小時(shí)內(nèi)處理（若無(wú)法及時(shí)處理，需冷藏4℃保存，不超過(guò)24小時(shí)）。操作步驟：1.直接涂片鏡檢：查找寄生蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)（如阿米巴滋養(yǎng)體）、白細(xì)胞（提示腸道炎癥）；2.培養(yǎng)：接種于SS平板（沙門(mén)菌/志賀菌）、麥康凱平板（腸道桿菌）、TCBS平板（霍亂弧菌，必要時(shí)）；3.特殊檢測(cè)：若臨床懷疑艱難梭菌感染，需做艱難梭菌毒素檢測(cè)（酶聯(lián)免疫法或核酸檢測(cè)）。5.微生物培養(yǎng)5.1培養(yǎng)基選擇不同標(biāo)本類型對(duì)應(yīng)的常用培養(yǎng)基如下：標(biāo)本類型常用培養(yǎng)基目的血液血培養(yǎng)瓶（需氧/厭氧/兒童瓶）增菌培養(yǎng)，檢測(cè)血流感染尿液血平板、麥康凱平板定量培養(yǎng)，檢測(cè)尿路感染痰液血平板、巧克力平板、麥康凱平板檢測(cè)呼吸道致病菌（如肺炎鏈球菌、嗜血桿菌）糞便SS平板、麥康凱平板、TCBS平板檢測(cè)腸道致病菌（如沙門(mén)菌、志賀菌）腦脊液血平板、巧克力平板、肉湯培養(yǎng)基檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（如腦膜炎奈瑟菌）5.2培養(yǎng)條件微生物類型孵育溫度孵育時(shí)間氣體環(huán)境需氧菌35℃18-24小時(shí)空氣（21%O?）厭氧菌35℃48-72小時(shí)厭氧（<1%O?，5-10%CO?）真菌25-30℃48-72小時(shí)（酵母）/7-10天（霉菌）空氣或5%CO?嗜血桿菌35℃24-48小時(shí)5-10%CO?5.3培養(yǎng)結(jié)果觀察1.陰性結(jié)果：培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（如需氧菌24小時(shí)、厭氧菌48小時(shí)），平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，需記錄“未檢出致病菌”。2.陽(yáng)性結(jié)果：平板上有細(xì)菌生長(zhǎng)，需記錄菌落形態(tài)（如圓形、凸起、光滑、溶血情況）、顏色（如金黃色、紅色、無(wú)色）、氣味（如惡臭提示厭氧菌），并進(jìn)一步做鑒定試驗(yàn)。6.微生物鑒定6.1傳統(tǒng)鑒定方法1.形態(tài)學(xué)鑒定：通過(guò)革蘭染色鏡檢判斷細(xì)菌形態(tài)（如革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌）、排列方式（如葡萄狀、鏈狀），結(jié)合菌落形態(tài)初步分類（如金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀排列，血平板上有β溶血）。2.生化反應(yīng)鑒定：通過(guò)生化試驗(yàn)確定細(xì)菌的代謝特征，常用方法包括：碳水化合物代謝：糖發(fā)酵試驗(yàn)（如葡萄糖、乳糖）、氧化酶試驗(yàn)（區(qū)分革蘭陰性桿菌）；蛋白質(zhì)代謝：吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)（區(qū)分沙門(mén)菌）；酶類試驗(yàn)：catalase試驗(yàn)（區(qū)分葡萄球菌與鏈球菌）、coagulase試驗(yàn)（區(qū)分金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌）。示例：大腸桿菌（E.coli）的生化特征為：氧化酶（-）、乳糖發(fā)酵（+）、吲哚（+）、甲基紅（+）、VP（-）、枸櫞酸鹽（-）（IMViC試驗(yàn)++--）。6.2自動(dòng)化鑒定方法1.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）：原理：通過(guò)檢測(cè)微生物蛋白質(zhì)指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比實(shí)現(xiàn)快速鑒定（10-30分鐘）；優(yōu)勢(shì)：準(zhǔn)確率高（>95%）、速度快、適用于多種微生物（細(xì)菌、真菌、支原體）；操作步驟：挑取單個(gè)菌落→制成菌懸液→點(diǎn)樣于靶板→加基質(zhì)液→干燥→進(jìn)樣檢測(cè)→軟件分析→得出鑒定結(jié)果（如“大腸桿菌，得分2.3”，得分≥2.0為可靠鑒定）。2.自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)（如VITEK2、BDPhoenix）：原理：通過(guò)檢測(cè)微生物對(duì)不同底物的代謝反應(yīng)（如糖發(fā)酵、酶活性），由儀器自動(dòng)分析并給出鑒定結(jié)果；優(yōu)勢(shì)：標(biāo)準(zhǔn)化程度高、可同時(shí)進(jìn)行鑒定與藥敏試驗(yàn)；操作步驟：制備菌懸液（0.5麥?zhǔn)蠞岫龋臃N于鑒定卡→放入儀器→孵育（4-18小時(shí)）→儀器判讀結(jié)果→打印報(bào)告。6.3鑒定結(jié)果確認(rèn)對(duì)于疑難菌株（如少見(jiàn)菌、鑒定結(jié)果異常），需通過(guò)以下方法驗(yàn)證：1.重復(fù)鑒定試驗(yàn)（如重新做生化反應(yīng)或MALDI-TOFMS）；2.血清學(xué)試驗(yàn)（如沙門(mén)菌的血清分型、腦膜炎奈瑟菌的群分型）；3.分子生物學(xué)試驗(yàn)（如16SrRNA基因測(cè)序、PCR）。7.藥敏試驗(yàn)7.1試驗(yàn)方法選擇常用藥敏試驗(yàn)方法及適用場(chǎng)景如下：方法原理適用場(chǎng)景優(yōu)勢(shì)紙片擴(kuò)散法（K-B法）藥敏紙片釋放藥物，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，測(cè)量抑菌圈直徑常規(guī)藥敏檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、成本低肉湯稀釋法（MIC法）藥物梯度稀釋，檢測(cè)最低抑菌濃度（MIC）特殊病原體（如結(jié)核桿菌）、耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可量化自動(dòng)化藥敏儀（如VITEK2）比濁法或熒光法檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況批量檢測(cè)速度快、標(biāo)準(zhǔn)化程度高7.2紙片擴(kuò)散法（K-B法）操作步驟1.菌懸液制備：挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋ㄏ喈?dāng)于1.5×10?CFU/ml）。2.平板接種：用棉拭子蘸取菌懸液，均勻涂布于Mueller-Hinton（MH）平板表面（連續(xù)涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°），待干（5-10分鐘）。3.貼藥敏紙片：用紙片分配器或鑷子將藥敏紙片貼在平板上，要求：紙片間距≥24mm；紙片邊緣距平板邊緣≥15mm；每平板貼6-8張紙片（根據(jù)平板大小調(diào)整）。4.孵育：將平板倒置，35℃需氧孵育16-18小時(shí)（不可超過(guò)24小時(shí)，否則抑菌圈會(huì)縮小）。5.抑菌圈測(cè)量：用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（精確到1mm），測(cè)量范圍包括完整的抑菌圈（不包括紙片本身）。7.3結(jié)果判讀（CLSI標(biāo)準(zhǔn)）根據(jù)抑菌圈直徑，將結(jié)果判讀為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）：敏感（S）：細(xì)菌對(duì)藥物敏感，常規(guī)劑量治療有效；中介（I）：細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性降低，需加大劑量或聯(lián)合用藥；耐藥（R）：細(xì)菌對(duì)藥物耐藥，常規(guī)劑量治療無(wú)效。示例：大腸桿菌對(duì)左氧氟沙星的判讀標(biāo)準(zhǔn)（K-B法）：結(jié)果抑菌圈直徑（mm）S≥19I16-18R≤157.4藥敏報(bào)告內(nèi)容必報(bào)藥物：根據(jù)標(biāo)本類型和致病菌種類選擇，如尿路感染報(bào)喹諾酮類、頭孢菌素類，呼吸道感染報(bào)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類；避免報(bào)藥物：如糞便標(biāo)本不報(bào)道夫西?。ㄒ蚰c道細(xì)菌對(duì)其天然耐藥），兒童不報(bào)喹諾酮類（因影響骨骼發(fā)育）；報(bào)告格式：“大腸桿菌：頭孢呋辛（S）、左氧氟沙星（S）、慶大霉素（I）、氨芐西林（R）”。8.質(zhì)量控制8.1室內(nèi)質(zhì)控（IQC）室內(nèi)質(zhì)控旨在監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程的穩(wěn)定性，確保結(jié)果可靠，需每日進(jìn)行。1.培養(yǎng)基質(zhì)控：無(wú)菌試驗(yàn)：每批培養(yǎng)基滅菌后，取10%量接種肉湯，35℃孵育24小時(shí)，無(wú)生長(zhǎng)為合格；生長(zhǎng)試驗(yàn)：每批培養(yǎng)基接種標(biāo)準(zhǔn)菌株（如血平板接種金黃色葡萄球菌ATCC____，應(yīng)生長(zhǎng)良好并產(chǎn)生β溶血）；生化反應(yīng)試驗(yàn)：每批麥康凱平板接種大腸桿菌ATCC____，應(yīng)生長(zhǎng)為紅色菌落（乳糖發(fā)酵陽(yáng)性）。2.藥敏試驗(yàn)質(zhì)控：質(zhì)控菌株：每日用標(biāo)準(zhǔn)菌株做藥敏試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性，常用質(zhì)控菌株如下：菌株名稱ATCC編號(hào)用途大腸桿菌____革蘭陰性桿菌藥敏質(zhì)控金黃色葡萄球菌____革蘭陽(yáng)性球菌藥敏質(zhì)控銅綠假單胞菌____非發(fā)酵菌藥敏質(zhì)控流感嗜血桿菌____嗜血桿菌藥敏質(zhì)控結(jié)果判斷：質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑需在CLSI規(guī)定的允許范圍內(nèi)（如大腸桿菌ATCC____對(duì)左氧氟沙星的抑菌圈直徑允許范圍為20-26mm），若超出范圍，需查找原因（如培養(yǎng)基質(zhì)量、試劑失效、操作錯(cuò)誤）并糾正。3.鑒定試驗(yàn)質(zhì)控：每日用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證鑒定方法的準(zhǔn)確性（如MALDI-TOFMS檢測(cè)金黃色葡萄球菌ATCC____，得分應(yīng)≥2.0）。8.2室間質(zhì)評(píng)（EQA）室間質(zhì)評(píng)旨在比較不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，確保結(jié)果的一致性，需每年參加國(guó)家或省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心組織的質(zhì)評(píng)計(jì)劃。1.參加要求：每年至少參加1次，覆蓋細(xì)菌鑒定、藥敏試驗(yàn)等項(xiàng)目；2.結(jié)果處理：若質(zhì)評(píng)結(jié)果不合格（如鑒定錯(cuò)誤、藥敏判讀錯(cuò)誤），需分析原因（如人員培訓(xùn)不足、試劑問(wèn)題），制定糾正措施并重新驗(yàn)證；質(zhì)評(píng)結(jié)果需記錄并存檔，作為實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)估的依據(jù)。9.結(jié)果報(bào)告與解釋9.1報(bào)告內(nèi)容微生物檢測(cè)報(bào)告需包含以下信息：患者信息：姓名、病歷號(hào)、科室、床號(hào)；標(biāo)本信息：標(biāo)本類型、采集時(shí)間、接收時(shí)間；檢測(cè)項(xiàng)目：如“細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏”；培養(yǎng)結(jié)果：陽(yáng)性（如“大腸桿菌”）或陰性（如“未檢出致病菌”）；鑒定結(jié)果：菌名（拉丁名+中文名）、鑒定方法（如“MALDI-TOFMS”）；藥敏結(jié)果：藥物名稱、判讀結(jié)果（S/I/R）；臨床意義：簡(jiǎn)要說(shuō)明結(jié)果的臨床價(jià)值（如“提示尿路感染，建議選用敏感藥物治療”）；實(shí)驗(yàn)室信息：檢測(cè)者、審核者、報(bào)告時(shí)間。9.2報(bào)告時(shí)間急診標(biāo)本：24小時(shí)內(nèi)出初步結(jié)果（如“血培養(yǎng)陽(yáng)性，革蘭陽(yáng)性球菌”），48小時(shí)內(nèi)出最終結(jié)果（鑒定+藥敏）；普通標(biāo)本：48-72小時(shí)內(nèi)出最終結(jié)果（如尿液、痰液培養(yǎng)）；真菌培養(yǎng)：7-10天內(nèi)出結(jié)果（因真菌生長(zhǎng)緩慢）。9.3結(jié)果解釋陽(yáng)性結(jié)果：需結(jié)合臨床癥狀判斷是否為感染（如血液培養(yǎng)陽(yáng)性提示血流感染，痰液培養(yǎng)陽(yáng)性需排除污染）；陰性結(jié)果：不能完全排除感染（如標(biāo)本采集不當(dāng)、抗生素使用后），需建議臨床重新采集或做其他檢測(cè)（如核酸檢測(cè)）；耐藥結(jié)果：需提示耐藥機(jī)制（如“金黃色葡萄球菌：甲氧西林（R），提示MRSA感染，建議用萬(wàn)古霉素治療”）。10.實(shí)驗(yàn)室安全管理10.1生物安全等級(jí)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室通常為BSL-2級(jí)（生物安全二級(jí)），需滿足以下要求：實(shí)驗(yàn)室入口處張貼“生物安全”標(biāo)志；配備生物安全柜（BSC），處理標(biāo)本、接種培養(yǎng)時(shí)必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；配備高壓滅菌器，用于處理感染性廢棄物。10.2個(gè)人防護(hù)（PPE）操作時(shí)需穿防護(hù)服、戴手套（一次性乳膠手套）、口罩（醫(yī)用外科口罩或N95口罩）、護(hù)目鏡（防止標(biāo)本濺入眼睛）；操作后需用75%乙醇消毒雙手，脫去防護(hù)服后需再次洗手。10.3應(yīng)急處理1.標(biāo)本溢出：立即用吸水紙覆蓋溢出物；用含氯消毒液（有效氯500mg/L）噴灑，作用30分鐘；清理溢出物，消毒臺(tái)面（用75%乙醇或含氯消毒液）；記錄溢出事件（時(shí)間、地點(diǎn)、處理方法）。2.銳器傷：立即擠出傷口血液（從近心端向遠(yuǎn)心端擠壓）；用肥皂水沖洗傷口10分鐘；用75%乙醇消毒傷口；報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，評(píng)估感染風(fēng)險(xiǎn)（如接觸乙肝、HIV陽(yáng)性標(biāo)本），必要時(shí)注射疫苗或抗病毒藥物。11.廢棄物處理11.1感染性廢棄物定義：含有病原微生物的廢棄物（如標(biāo)本、培養(yǎng)物、污染的耗材）；處理方法：用黃色垃圾袋收集，扎口后貼上“感染性廢棄物”標(biāo)簽，高壓滅菌（121℃，20分鐘）后，交給有資質(zhì)的醫(yī)療廢物處理單位。11.2化學(xué)廢棄物定義：含有化學(xué)試劑的廢棄物（如染液、甲醛、乙醇）；處理方法：用紅色垃圾袋收集，貼上“化學(xué)廢棄物”標(biāo)簽，交給有資質(zhì)的化學(xué)廢物處理單位。11.3銳器定義：尖銳的廢棄物（如針頭、吸管、玻片）；處理方法：用銳器盒收集，裝滿3/4后封閉，高壓滅菌后處理。12.儀器與試劑管理12.1儀器維護(hù)培養(yǎng)箱：每日檢查溫度（35℃±1℃），每月校準(zhǔn)1次；生物安全柜：每6個(gè)月檢測(cè)1次風(fēng)速（垂直風(fēng)速≥0.3m/s），每年更換1次高效過(guò)濾器（HEPA）；血培養(yǎng)儀：每日檢查儀器狀態(tài)（如溫度、報(bào)警功能），每月清潔1次。12.2試劑與培養(yǎng)基儲(chǔ)存試劑：按說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存（如酶類試劑需冷藏4℃