152023-12-29發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC1I1判定。由銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近會出現(xiàn)爛霉變，并發(fā)生壞死，根莖出現(xiàn)中空，側(cè)根出現(xiàn)大量腐爛壞死5.1.6凝膠電泳試劑：瓊脂糖，TAE,LoadingBuffer,DL2000DNAMarker。5.2.1水瓊脂培養(yǎng)基(WA:WaterAgar):瓊脂粉15g,加蒸餾水定容至1000mL,122滅菌20min。5.2.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA:PotatoDextroseAgar):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g,加蒸餾水定容至1000mL,121℃高壓滅菌20min。5.2.3馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB:PotatoDextroseBroth):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,加蒸餾水定容至1000mL,121℃高壓滅菌20min。5.2.4綠豆瓊脂培養(yǎng)基(MBA:MungBeanAgar):綠豆粉60g,瓊脂粉15g,加蒸餾水定容至1000約0.5cm×0.5cm的小組織塊，用75%酒精和1%次氯酸鈉分別處理3min和5min,無菌水清洗5次。把表收集菌絲，液氮下研磨，使用真菌基因組提取試劑盒提取病原菌DNACRTGGATCTTRTCRTCSACC-3'）以及鐮刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5'-ATGCARGGYATYGTHGT-3')和Fusphoo-r(5'-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3')進行PC聚類分析結(jié)果表明，以ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的三線鐮刀菌(JX989827.1)、燕麥鐮刀菌（KX058547.1）、銳頂鐮刀菌（MT557673.1）聚為同一類，見附錄A中的圖A.5。以fRPB2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見附錄A中的圖A.6。以PHO序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的銳頂鐮刀菌(KJ200247.1)聚于同一類，見附錄A中的圖A.7。選取形態(tài)特征與F.acuminatum形態(tài)特征相符且PCR檢測鑒定陽性的分離菌株，在綠豆培養(yǎng)基上培養(yǎng)接種發(fā)病的苜蓿根部再做病原菌分離、培養(yǎng)，觀察是否與F.acuminatum的形態(tài)特征一致，并對分離菌相符，PCR擴增鑒定為F.acuminatum，且苜蓿致病性測試的分34(資料性)苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程苜蓿根腐病銳頂鐮刀菌的分離鑒定過程見圖A.1~圖A.7。取取樣清洗分離涂板搖菌搖菌鏡檢再次分離Gen3arkGuaphicsDislance暖ofrsulsNnMSAMeweFueaniusLESkimiNauCuve提取測序比對圖A.1苜蓿根腐病病原菌的分離純化圖A.2PDA培養(yǎng)基銳頂鐮刀菌生長形態(tài)5注：A:小型分生孢子B:大型分生孢子C:菌絲。圖A.3銳頂鐮刀菌孢子與菌絲形態(tài)6FusariumacuminatFusariumoxysporumMKB2937FusariumsolaniMH582400.1圖A.5系統(tǒng)發(fā)育樹—ITS序列FusariumtreinchumK43Fusarunavena圖A.6系統(tǒng)發(fā)育樹—fPRB2