半干草魚(yú)片貯藏期間優(yōu)勢(shì)腐敗菌的解析與防控策略研究一、緒論1.1研究背景與意義草魚(yú)（Ctenopharyngodonidella）作為中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，在淡水漁業(yè)中占據(jù)關(guān)鍵地位。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，2023年我國(guó)草魚(yú)產(chǎn)量高達(dá)590.48萬(wàn)噸，同比2022年增長(zhǎng)2.60%，預(yù)計(jì)2024年我國(guó)草魚(yú)產(chǎn)量將達(dá)到656.81萬(wàn)噸，同比增長(zhǎng)11.23%。其養(yǎng)殖范圍廣泛，除西藏、港、澳、臺(tái)以外的30個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）均有養(yǎng)殖，其中廣東、湖北、湖南、江西及江蘇地區(qū)是主要養(yǎng)殖區(qū)域，這些地區(qū)的草魚(yú)養(yǎng)殖總量在全國(guó)養(yǎng)殖總量中占比較大。草魚(yú)不僅是人們餐桌上的常見(jiàn)美食，具有肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及多種維生素和礦物質(zhì)，能夠?yàn)槿梭w補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，有益健康；而且在漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中扮演著重要角色，推動(dòng)著相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。半干草魚(yú)片作為一種具有特色的草魚(yú)加工制品，以其獨(dú)特的風(fēng)味和口感受到眾多消費(fèi)者的喜愛(ài)。其制作過(guò)程通常是將草魚(yú)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，進(jìn)行腌制、干燥等工藝處理，使其水分含量達(dá)到一定程度，形成半干狀態(tài)。這種加工方式既保留了草魚(yú)的部分水分，使其口感鮮嫩，又降低了水分活度，延長(zhǎng)了產(chǎn)品的保質(zhì)期。然而，在貯藏過(guò)程中，半干草魚(yú)片卻容易受到多種因素的影響而發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。由于半干草魚(yú)片仍含有一定量的水分，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了條件。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)利用魚(yú)片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝活動(dòng)，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物會(huì)改變魚(yú)片的色澤、氣味和質(zhì)地，導(dǎo)致魚(yú)片品質(zhì)下降，甚至失去食用價(jià)值。魚(yú)片自身含有的酶類(lèi)在貯藏過(guò)程中也可能會(huì)繼續(xù)發(fā)揮作用，加速魚(yú)片的變質(zhì)過(guò)程。研究半干草魚(yú)片貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌具有至關(guān)重要的意義。明確優(yōu)勢(shì)腐敗菌能夠?yàn)橹贫ㄓ行У谋ｕr措施提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)了解腐敗菌的生物學(xué)特性、生長(zhǎng)規(guī)律以及對(duì)環(huán)境條件的要求，可以有針對(duì)性地采取物理、化學(xué)或生物的保鮮方法來(lái)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，從而延長(zhǎng)半干草魚(yú)片的貨架期，保持其品質(zhì)和風(fēng)味。對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的研究有助于提升草魚(yú)加工產(chǎn)業(yè)的技術(shù)水平和產(chǎn)品質(zhì)量。在加工過(guò)程中，根據(jù)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的特點(diǎn)，可以優(yōu)化加工工藝，改進(jìn)生產(chǎn)設(shè)備，加強(qiáng)衛(wèi)生管理，減少微生物污染，提高產(chǎn)品的安全性和穩(wěn)定性。這對(duì)于推動(dòng)草魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，增加養(yǎng)殖戶和加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，滿足消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品的需求都具有積極的促進(jìn)作用。1.2草魚(yú)生物學(xué)特性與加工現(xiàn)狀草魚(yú)，隸屬鯉形目鯉科雅羅魚(yú)亞科草魚(yú)屬，俗稱草棒、鯇、油鯇、草鯇等。其身體呈圓筒形，腹部渾圓，鱗片大而圓，體色多為茶黃色，背部青綠色，腹部灰白色，胸鰭和腹鰭呈橙黃色，背鰭和尾鰭為灰色。咽部生有2行梳齒狀咽喉齒，用于切割草類(lèi)。作為典型的草食性魚(yú)類(lèi)，在自然水域中主要以高等水生植物，如鳳眼蓮、馬來(lái)眼子菜、金魚(yú)藻等為食，人工養(yǎng)殖時(shí)也喜食黑麥草、蘇丹草等陸生植物。草魚(yú)具有食量較大、生長(zhǎng)速度快、食物鏈短、耐粗食等特點(diǎn)，其飼料來(lái)源廣泛，養(yǎng)殖成本相對(duì)較低。在適宜水溫20-32℃，最適水溫27-30℃的環(huán)境下，草魚(yú)攝食旺盛，生長(zhǎng)迅速。當(dāng)水溫低于20℃時(shí)，攝食量會(huì)降低；低于5℃則停止攝食；水溫低于0.5℃或高于40℃時(shí)，草魚(yú)便會(huì)面臨生存威脅。草魚(yú)不僅肉質(zhì)鮮美，還富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多種維生素（如維生素A、B族維生素等）以及礦物質(zhì)（如鈣、磷等）。其蛋白質(zhì)含量約為16.6%，可作為人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源；脂肪主要為不飽和脂肪酸，含量達(dá)5.2%，有助于促進(jìn)血液循環(huán)，對(duì)人體健康十分有益。在加工現(xiàn)狀方面，隨著草魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量的不斷增加，草魚(yú)加工產(chǎn)業(yè)也在持續(xù)發(fā)展。目前，草魚(yú)的加工產(chǎn)品種類(lèi)繁多，涵蓋了魚(yú)糜、魚(yú)丸、魚(yú)卷、魚(yú)醬等深加工產(chǎn)品。然而，這些深加工產(chǎn)品在制作過(guò)程中往往存在制作周期長(zhǎng)、技術(shù)要求高、加工成本大等問(wèn)題。相比之下，半干草魚(yú)制品以其制作周期短、加工成本低、保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，逐漸受到市場(chǎng)關(guān)注。半干草魚(yú)制品在加工時(shí)，通常會(huì)先對(duì)草魚(yú)進(jìn)行預(yù)處理，然后經(jīng)腌制、干燥等工藝，使其水分含量達(dá)到特定范圍，形成半干狀態(tài)。這種加工方式既保留了草魚(yú)的部分水分，使其口感鮮嫩，又通過(guò)降低水分活度，延長(zhǎng)了產(chǎn)品保質(zhì)期。近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)具有特色、方便食用的水產(chǎn)品需求日益增長(zhǎng)，半干草魚(yú)制品正好契合了這一消費(fèi)趨勢(shì)，市場(chǎng)前景較為廣闊。一些企業(yè)通過(guò)改進(jìn)加工工藝，開(kāi)發(fā)出多種口味的半干草魚(yú)片，如香辣味、五香味等，進(jìn)一步豐富了產(chǎn)品種類(lèi)，滿足了不同消費(fèi)者的口味偏好。但在半干草魚(yú)片的貯藏過(guò)程中，仍存在因微生物污染、脂肪氧化等導(dǎo)致的品質(zhì)劣變問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究解決。1.3魚(yú)類(lèi)腐敗及腐敗微生物概述魚(yú)類(lèi)腐敗是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通?？煞譃樗篮蠼┲薄⒆匀芎透瘮∪齻€(gè)階段。剛捕獲的魚(yú)，由于體內(nèi)ATP分解產(chǎn)生磷酸，導(dǎo)致肌肉pH下降，肌肉收縮變硬，進(jìn)入死后僵直階段。隨著魚(yú)體自身酶類(lèi)（如蛋白酶等）的作用，肌肉蛋白質(zhì)逐漸分解，產(chǎn)生氨基酸、肽類(lèi)等物質(zhì)，肌肉開(kāi)始變軟，進(jìn)入自溶階段。在自溶階段后期，魚(yú)體中的小分子含氮物質(zhì)增多，為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)源，細(xì)菌大量繁殖，將蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)分解為氨、三甲胺、吲哚、硫化氫、組胺等低級(jí)產(chǎn)物，使魚(yú)體產(chǎn)生具有腐敗特征的臭味，完全進(jìn)入腐敗變質(zhì)階段。常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)腐敗微生物種類(lèi)繁多，包括細(xì)菌、真菌和酵母菌等，其中細(xì)菌是導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)腐敗的主要微生物類(lèi)群。在冷藏條件下，假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等是常見(jiàn)的腐敗細(xì)菌。假單胞菌屬為革蘭氏陰性桿菌，具有較強(qiáng)的嗜冷性，能在低溫下快速生長(zhǎng)繁殖，可利用多種底物進(jìn)行代謝，產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等胞外酶，分解魚(yú)體的蛋白質(zhì)和脂肪，導(dǎo)致魚(yú)體腐敗變質(zhì)。希瓦氏菌屬同樣是革蘭氏陰性菌，具有較強(qiáng)的腐敗能力，能利用魚(yú)體中的含硫化合物產(chǎn)生硫化氫等揮發(fā)性物質(zhì)，使魚(yú)體產(chǎn)生腐臭氣味。氣單胞菌屬則是一類(lèi)兼性厭氧菌，能產(chǎn)生多種毒力因子和胞外酶，不僅會(huì)引起魚(yú)類(lèi)腐敗，還可能對(duì)人體健康造成威脅。在常溫貯藏時(shí)，芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）等細(xì)菌也會(huì)大量繁殖，加速魚(yú)類(lèi)的腐敗進(jìn)程。芽孢桿菌屬能形成芽孢，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，在適宜條件下芽孢萌發(fā)，細(xì)菌迅速生長(zhǎng)，分解魚(yú)體物質(zhì)；腸桿菌科細(xì)菌種類(lèi)多樣，可利用魚(yú)體中的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等進(jìn)行代謝，產(chǎn)生有機(jī)酸、氣體等代謝產(chǎn)物，改變魚(yú)體的理化性質(zhì)。水產(chǎn)品特定腐敗菌（SpecificSpoilageOrganisms，SSO）是指在水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中，能在特定條件下迅速生長(zhǎng)繁殖，并對(duì)產(chǎn)品腐敗起主導(dǎo)作用的微生物。這些微生物在水產(chǎn)品中的生長(zhǎng)受多種因素影響，如溫度、水分活度、pH值、氣體環(huán)境等。不同種類(lèi)的水產(chǎn)品因其自身特性和貯藏條件的差異，其特定腐敗菌也有所不同。對(duì)于海水魚(yú)，在冷藏條件下，假單胞菌和希瓦氏菌常是主要的特定腐敗菌；而對(duì)于淡水魚(yú)，氣單胞菌和假單胞菌則較為常見(jiàn)。目前，對(duì)水產(chǎn)品特定腐敗菌的研究主要集中在其種類(lèi)鑒定、生長(zhǎng)特性、腐敗機(jī)制以及控制方法等方面。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)（如16SrRNA基因測(cè)序等）可以準(zhǔn)確鑒定特定腐敗菌的種類(lèi)；利用微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可以研究其在不同條件下的生長(zhǎng)規(guī)律，預(yù)測(cè)產(chǎn)品的貨架期。在控制方法上，采用低溫貯藏、氣調(diào)包裝、添加天然防腐劑等技術(shù)手段來(lái)抑制特定腐敗菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期。1.4研究?jī)?nèi)容與方法1.4.1半干草魚(yú)片貯藏過(guò)程中理化特性變化研究定期測(cè)定半干草魚(yú)片在貯藏期間的水分含量、水分活度、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、過(guò)氧化值（POV）、酸價(jià)（AV）等理化指標(biāo)的變化。其中，水分含量采用直接干燥法測(cè)定，將一定量的魚(yú)片樣品置于105℃烘箱中干燥至恒重，通過(guò)失重計(jì)算水分含量；水分活度使用水分活度儀測(cè)定，將樣品放入儀器的樣品盒中，平衡一段時(shí)間后讀取水分活度值；pH值采用玻璃電極法，將魚(yú)片勻漿后，用pH計(jì)測(cè)定其pH；TVB-N含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定，利用弱堿氧化鎂使樣品中的堿性含氮物質(zhì)游離，通過(guò)蒸餾將氨蒸出，用硼酸吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定；POV采用硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定，利用碘離子與過(guò)氧化物反應(yīng)生成碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定碘；AV采用氫氧化鉀滴定法，用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品中的游離脂肪酸，根據(jù)消耗的堿液量計(jì)算酸價(jià)。通過(guò)分析這些理化指標(biāo)的變化規(guī)律，了解半干草魚(yú)片在貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化情況。1.4.2半干草魚(yú)片貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物篩選及致腐能力研究在貯藏期間定期采集半干草魚(yú)片樣品，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)不同微生物在特定培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征進(jìn)行分離純化。例如，假單胞菌在假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（PseudomonasIsolationAgar，PIA）上生長(zhǎng)，會(huì)形成具有特殊形態(tài)和顏色的菌落；希瓦氏菌在鐵瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生黑色的硫化鐵沉淀。將分離得到的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，然后分別接種到新鮮的半干草魚(yú)片模擬體系中，在相同貯藏條件下，測(cè)定模擬體系的TVB-N含量、微生物數(shù)量、感官品質(zhì)等指標(biāo)的變化，通過(guò)對(duì)比分析，篩選出對(duì)魚(yú)片腐敗起主要作用的優(yōu)勢(shì)微生物，并評(píng)估其致腐能力。1.4.3半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)觀察包括在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形狀、大小、排列方式、革蘭氏染色特性等；生理生化特性分析包括氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)等，通過(guò)這些試驗(yàn)，了解細(xì)菌對(duì)不同底物的利用能力和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生情況；分子生物學(xué)方法主要是對(duì)細(xì)菌的16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，確定細(xì)菌的種類(lèi)。1.4.4半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)特性研究研究?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌在不同溫度（如4℃、10℃、25℃等）、水分活度（通過(guò)添加不同濃度的氯化鈉或甘油調(diào)節(jié)）、pH值（用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)）條件下的生長(zhǎng)曲線，采用比濁法或平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)量，繪制生長(zhǎng)曲線，分析環(huán)境因素對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響。同時(shí)，研究不同抑菌劑（如天然抑菌劑茶多酚、殼聚糖，化學(xué)抑菌劑山梨酸鉀等）對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑制效果，通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）來(lái)評(píng)估抑菌劑的抑菌能力。二、半干草魚(yú)片貯藏過(guò)程中理化特性變化規(guī)律2.1材料與設(shè)備實(shí)驗(yàn)所用半干草魚(yú)片為市售產(chǎn)品，購(gòu)自當(dāng)?shù)卮笮统小Ｔ摪敫刹蒴~(yú)片由新鮮草魚(yú)經(jīng)宰殺、清洗、去骨、腌制、干燥等工藝制成，其生產(chǎn)工藝符合相關(guān)食品加工標(biāo)準(zhǔn)。在購(gòu)買(mǎi)時(shí)，選擇包裝完好、無(wú)破損、無(wú)異味且在保質(zhì)期內(nèi)的產(chǎn)品，確保實(shí)驗(yàn)樣品的初始質(zhì)量良好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的主要試劑包括：氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、碘化鉀、硫代硫酸鈉、冰乙酸、三氯甲烷、酚酞等，均為分析純?cè)噭?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。這些試劑主要用于水分含量、水分活度、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、過(guò)氧化值（POV）、酸價(jià)（AV）等理化指標(biāo)的測(cè)定。例如，在測(cè)定TVB-N含量時(shí)，需要使用硼酸來(lái)吸收蒸餾出的氨，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值；測(cè)定POV時(shí)，需要用到碘化鉀、硫代硫酸鈉等試劑進(jìn)行滴定反應(yīng)。所需設(shè)備有：AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），用于精確稱量樣品和試劑的質(zhì)量，其精度可達(dá)0.0001g，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)稱量精度的要求；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于測(cè)定水分含量時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理，可精確控制溫度，確保干燥過(guò)程的穩(wěn)定性；HR23水分活度儀（上海禾工科學(xué)儀器有限公司），專(zhuān)門(mén)用于測(cè)定樣品的水分活度，操作簡(jiǎn)便，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確；PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），用于測(cè)定樣品的pH值，具有高精度、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)；KDN-08C凱氏定氮儀（上海纖檢儀器有限公司），用于測(cè)定TVB-N含量，該儀器采用半微量凱氏定氮法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的含氮量；501型超級(jí)恒溫器（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），可為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，在一些需要恒溫條件的實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用；酸式滴定管、堿式滴定管等玻璃儀器，用于進(jìn)行滴定操作，以測(cè)定POV、AV等指標(biāo)。2.2實(shí)驗(yàn)方法將市售新鮮草魚(yú)去鱗、去內(nèi)臟、洗凈后，沿脊背將魚(yú)體對(duì)半切開(kāi)，再切成厚度約為1cm的魚(yú)片。采用自然風(fēng)干與熱風(fēng)干燥相結(jié)合的方式進(jìn)行干制。先將魚(yú)片置于通風(fēng)良好的室內(nèi)自然風(fēng)干6h，使魚(yú)片表面水分初步散失；然后將魚(yú)片放入DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在40℃條件下熱風(fēng)干燥4h，直至魚(yú)片的水分含量達(dá)到30%-35%，制成半干草魚(yú)片。將制作好的半干草魚(yú)片裝入聚乙烯塑料袋中，每袋500g，密封后置于常溫（25℃）條件下貯藏。每隔3天隨機(jī)抽取3袋樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。感官評(píng)價(jià)由10名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的人員組成評(píng)價(jià)小組，依據(jù)GB/T16860-1997《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》對(duì)貯藏過(guò)程中的半干草魚(yú)片進(jìn)行感官評(píng)定。從色澤、氣味、質(zhì)地和滋味四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分為20分，其中色澤（5分）：新鮮的半干草魚(yú)片應(yīng)具有草魚(yú)本身的自然色澤，無(wú)明顯變色，得分4-5分；若色澤稍有暗淡，得3分；若出現(xiàn)明顯黃變或褐變，得分1-2分。氣味（5分）：具有半干草魚(yú)片特有的香味，無(wú)異味，得分4-5分；若有輕微不愉快氣味，得3分；若有明顯腐臭味，得分1-2分。質(zhì)地（5分）：肉質(zhì)緊密有彈性，切片完整，得分4-5分；若質(zhì)地稍軟，彈性略有下降，得3分；若質(zhì)地軟爛，切片易破碎，得分1-2分。滋味（5分）：滋味鮮美，具有該產(chǎn)品應(yīng)有的風(fēng)味，得分4-5分；若滋味稍有變淡，得3分；若有明顯異味，得分1-2分。最后計(jì)算感官評(píng)分的平均值。pH的測(cè)定參照GB5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》執(zhí)行。準(zhǔn)確稱取5g半干草魚(yú)片樣品，加入45mL蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min。將勻漿液在室溫下靜置30min，然后用PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值。在測(cè)定前，需用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=4.00、pH=6.86、pH=9.18）對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。TVB-N值的測(cè)定按照GB5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量凱氏定氮法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取10g勻漿后的半干草魚(yú)片樣品，加入100mL水，振蕩提取30min，然后過(guò)濾，取濾液進(jìn)行蒸餾。向蒸餾瓶中加入10mL濾液、10mL氧化鎂混懸液（10g/L），迅速連接好蒸餾裝置，以硼酸溶液（20g/L）為吸收液，蒸餾5min。蒸餾結(jié)束后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.01mol/L）滴定吸收液至終點(diǎn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。根據(jù)公式X=(V1-V2)×c×14.01×100/m計(jì)算TVB-N值，其中X為樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量（mg/100g），V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L），m為樣品質(zhì)量（g），14.01為氮的摩爾質(zhì)量（g/mol）。TBA值的測(cè)定參考文獻(xiàn)方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取5g半干草魚(yú)片樣品，加入50mL7.5%三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸二鈉），勻漿3min，然后在4000r/min條件下離心10min，取上清液備用。取5mL上清液于試管中，加入5mL0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液，混合均勻后，在95℃水浴中加熱40min，冷卻后于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的TBA值，結(jié)果以mg丙二醛/kg樣品表示。TMA值的測(cè)定采用頂空氣相色譜法。準(zhǔn)確稱取3g半干草魚(yú)片樣品，放入20mL頂空瓶中，加入5mL10%三氯乙酸溶液，密封后振蕩10min，然后在40℃條件下平衡30min。取1mL頂空氣體注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，色譜條件為：色譜柱為DB-5毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度280℃；柱溫采用程序升溫，初始溫度40℃，保持3min，以10℃/min的速率升溫至200℃，保持5min；載氣為氮?dú)猓魉?.0mL/min；分流比10:1。以三甲胺鹽酸鹽為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的TMA值，結(jié)果以mg/kg樣品表示。菌落總數(shù)的測(cè)定依據(jù)GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取25g半干草魚(yú)片樣品，加入225mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器均質(zhì)1min，制成1:10的樣品勻液。然后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x擇2-3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別注入無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。向平皿中加入冷卻至46℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基15-20mL，迅速混勻，待瓊脂凝固后，將平皿倒置，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并根據(jù)公式N=ΣC/(n1+0.1n2)×d計(jì)算菌落總數(shù)，其中N為樣品中菌落總數(shù)，ΣC為平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，d為稀釋因子（第一稀釋度）。2.3結(jié)果與分析在貯藏前期（0-6天），半干草魚(yú)片的色澤呈現(xiàn)出較為自然的淡黃色，與剛制作完成時(shí)差異較小，魚(yú)片表面干燥，無(wú)明顯的濕潤(rùn)感，這是因?yàn)樵谥谱鬟^(guò)程中通過(guò)干燥工藝去除了部分水分，使得魚(yú)片表面的水分含量較低，減少了微生物滋生的可能性。氣味方面，具有淡淡的魚(yú)香味和腌制后的咸香味，未出現(xiàn)明顯的異味，這是由于腌制過(guò)程中鹽的作用抑制了一些微生物的生長(zhǎng)，減少了異味物質(zhì)的產(chǎn)生。質(zhì)地緊密有彈性，手指按壓后能迅速恢復(fù)原狀，切片完整，不易破碎，這表明此時(shí)魚(yú)片的肌肉組織仍保持著較好的結(jié)構(gòu)完整性。滋味鮮美，具有半干草魚(yú)片應(yīng)有的風(fēng)味，口感良好。感官評(píng)分保持在16-18分之間，處于較高水平，說(shuō)明此時(shí)魚(yú)片的品質(zhì)良好，符合消費(fèi)者的接受標(biāo)準(zhǔn)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)至中期（6-12天），魚(yú)片的色澤逐漸變深，呈現(xiàn)出深黃色，這可能是由于魚(yú)片表面的脂肪發(fā)生氧化，產(chǎn)生了一些有色物質(zhì)，導(dǎo)致色澤改變。氣味中魚(yú)香味有所減弱，同時(shí)出現(xiàn)了輕微的不愉快氣味，這是因?yàn)槲⑸镩_(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)生了一些揮發(fā)性的異味物質(zhì)。質(zhì)地開(kāi)始變軟，彈性下降，手指按壓后恢復(fù)速度變慢，切片時(shí)容易出現(xiàn)破碎現(xiàn)象，這是因?yàn)槲⑸锓置诘拿割?lèi)開(kāi)始分解魚(yú)片的蛋白質(zhì)和其他成分，破壞了肌肉組織的結(jié)構(gòu)。滋味也逐漸變淡，風(fēng)味變差，感官評(píng)分降至12-14分，表明魚(yú)片的品質(zhì)有所下降。到了貯藏后期（12-18天），魚(yú)片的色澤進(jìn)一步加深，變?yōu)辄S褐色，甚至出現(xiàn)了黑斑，這是脂肪氧化和微生物污染加劇的結(jié)果。氣味中腐臭味明顯，令人難以接受，此時(shí)微生物大量繁殖，分解魚(yú)片產(chǎn)生了大量的腐敗產(chǎn)物，如硫化氫、吲哚等，導(dǎo)致氣味惡化。質(zhì)地軟爛，幾乎沒(méi)有彈性，切片嚴(yán)重破碎，無(wú)法保持完整形狀，說(shuō)明魚(yú)片的肌肉組織已被嚴(yán)重破壞。滋味中充滿了異味，完全失去了半干草魚(yú)片應(yīng)有的風(fēng)味，感官評(píng)分低于8分，此時(shí)魚(yú)片已嚴(yán)重腐敗變質(zhì)，失去了食用價(jià)值。貯藏過(guò)程中半干草魚(yú)片的pH變化情況，在貯藏初期，pH值為6.5左右，這是由于草魚(yú)本身的生理特性以及腌制過(guò)程中添加的鹽分等因素共同作用的結(jié)果。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值逐漸下降，在第6天左右降至6.2左右，這可能是因?yàn)樵谫A藏初期，魚(yú)片內(nèi)的微生物開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，它們利用魚(yú)片的糖類(lèi)等物質(zhì)進(jìn)行代謝，產(chǎn)生了一些有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等，這些有機(jī)酸的積累導(dǎo)致pH值下降。此后，pH值又逐漸上升，到貯藏末期（第18天）達(dá)到7.0左右，這是因?yàn)殡S著貯藏時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，微生物對(duì)魚(yú)片的蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)分解作用增強(qiáng)，產(chǎn)生了大量的堿性物質(zhì)，如氨等，使得pH值升高。TVB-N是衡量水產(chǎn)品新鮮度和腐敗程度的重要指標(biāo)之一，它主要是指水產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中，由于微生物和酶的作用，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類(lèi)等揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)的總量。貯藏初期，半干草魚(yú)片的TVB-N值較低，為10mg/100g左右，這是因?yàn)榇藭r(shí)魚(yú)片的新鮮度較高，微生物數(shù)量較少，蛋白質(zhì)分解程度低。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N值逐漸上升，在第12天左右達(dá)到20mg/100g左右，此時(shí)微生物大量繁殖，它們分泌的蛋白酶等酶類(lèi)將魚(yú)片的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，氨基酸進(jìn)一步脫氨、脫羧等反應(yīng)，產(chǎn)生了更多的氨和胺類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致TVB-N值升高。到貯藏末期（第18天），TVB-N值達(dá)到35mg/100g以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的TVB-N值標(biāo)準(zhǔn)（一般淡水魚(yú)類(lèi)TVB-N值超過(guò)20mg/100g被認(rèn)為開(kāi)始腐敗變質(zhì)），表明此時(shí)魚(yú)片已嚴(yán)重腐敗。TBA值主要用于衡量脂肪氧化的程度，它反映了脂肪氧化過(guò)程中產(chǎn)生的丙二醛等醛類(lèi)物質(zhì)的含量。貯藏初期，半干草魚(yú)片的TBA值較低，為0.5mg丙二醛/kg樣品左右，這是因?yàn)樵谥谱靼敫刹蒴~(yú)片的過(guò)程中，雖然經(jīng)過(guò)了干燥等處理，但脂肪氧化反應(yīng)仍處于較低水平。隨著貯藏時(shí)間的增加，TBA值逐漸升高，在第9天左右達(dá)到1.0mg丙二醛/kg樣品左右，這是由于貯藏過(guò)程中，魚(yú)片內(nèi)的脂肪在氧氣、光照、溫度以及微生物產(chǎn)生的脂肪酶等因素的作用下，發(fā)生了氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了丙二醛等醛類(lèi)物質(zhì)，且隨著時(shí)間的推移，氧化程度逐漸加深。到貯藏末期（第18天），TBA值達(dá)到2.0mg丙二醛/kg樣品以上，表明脂肪氧化程度嚴(yán)重，魚(yú)片的品質(zhì)受到了極大的影響。TMA是水產(chǎn)品在微生物作用下，三甲胺氧化物還原產(chǎn)生的一種具有腥味的物質(zhì)，其含量高低可以反映水產(chǎn)品的新鮮程度。貯藏開(kāi)始時(shí)，半干草魚(yú)片的TMA值較低，為2mg/kg樣品左右，這是因?yàn)榇藭r(shí)微生物數(shù)量較少，三甲胺氧化物的還原反應(yīng)較弱。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TMA值逐漸增加，在第15天左右達(dá)到8mg/kg樣品左右，這是因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)繁殖過(guò)程中，分泌的三甲胺氧化物還原酶將魚(yú)片內(nèi)的三甲胺氧化物還原為三甲胺，導(dǎo)致TMA值升高。到貯藏后期，TMA值繼續(xù)上升，使得魚(yú)片的腥味越來(lái)越重，嚴(yán)重影響了魚(yú)片的風(fēng)味和品質(zhì)。貯藏初期，半干草魚(yú)片的菌落總數(shù)較低，為103CFU/g左右，這是因?yàn)樵谥谱鬟^(guò)程中的腌制和干燥工藝對(duì)微生物有一定的抑制作用，減少了初始微生物的數(shù)量。在貯藏的前6天，菌落總數(shù)增長(zhǎng)較為緩慢，到第6天達(dá)到104CFU/g左右，此時(shí)環(huán)境條件相對(duì)較為穩(wěn)定，微生物的生長(zhǎng)受到一定限制。然而，隨著貯藏時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，從第6天到第12天，菌落總數(shù)迅速增加，到第12天達(dá)到106CFU/g左右，這是因?yàn)榇藭r(shí)魚(yú)片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分等條件逐漸適宜微生物生長(zhǎng)，微生物開(kāi)始大量繁殖。在貯藏后期（12-18天），菌落總數(shù)繼續(xù)快速上升，到第18天達(dá)到108CFU/g以上，此時(shí)微生物數(shù)量過(guò)多，導(dǎo)致魚(yú)片嚴(yán)重腐敗變質(zhì)。2.4本章小結(jié)本章通過(guò)對(duì)常溫貯藏過(guò)程中的半干草魚(yú)片進(jìn)行感官評(píng)價(jià)以及pH、TVB-N、TBA、TMA和菌落總數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定，系統(tǒng)地研究了半干草魚(yú)片在貯藏過(guò)程中的理化特性變化規(guī)律。結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，半干草魚(yú)片的感官品質(zhì)逐漸下降，色澤變深、氣味變差、質(zhì)地變軟、滋味變淡。pH值先下降后上升，這與微生物的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，初期微生物利用糖類(lèi)產(chǎn)酸使pH下降，后期分解蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)產(chǎn)堿使pH上升。TVB-N值、TBA值、TMA值和菌落總數(shù)均呈逐漸上升趨勢(shì)，分別反映了蛋白質(zhì)腐敗、脂肪氧化、三甲胺生成以及微生物繁殖的加劇。這些理化特性的變化相互關(guān)聯(lián)，共同影響著半干草魚(yú)片的品質(zhì)和貯藏期限，為后續(xù)對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。三、28℃貯藏條件下半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)微生物致腐能力3.1材料與設(shè)備實(shí)驗(yàn)用半干草魚(yú)片取自當(dāng)?shù)匾患揖哂辛己蒙a(chǎn)規(guī)范的水產(chǎn)加工廠。該加工廠采用標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)流程，選用新鮮的草魚(yú)為原料，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的清洗、去鱗、去內(nèi)臟等預(yù)處理步驟后，采用獨(dú)特的腌制配方，將魚(yú)片在含有食鹽、白砂糖、香辛料等成分的腌制液中腌制一定時(shí)間，使魚(yú)片充分吸收調(diào)味料，增添風(fēng)味。隨后，運(yùn)用低溫?zé)犸L(fēng)干燥技術(shù)，在適宜的溫度和風(fēng)速條件下進(jìn)行干燥處理，精準(zhǔn)控制干燥時(shí)間，使魚(yú)片的水分含量達(dá)到30%-35%，最終制成半干草魚(yú)片。在加工過(guò)程中，嚴(yán)格遵守食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，確保產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。將制作好的半干草魚(yú)片用聚乙烯塑料袋進(jìn)行真空包裝，每袋重量為200g，以減少與外界空氣的接觸，降低微生物污染和氧化的風(fēng)險(xiǎn)。包裝后的魚(yú)片置于溫度為28℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏，模擬常溫貯藏環(huán)境。實(shí)驗(yàn)中使用的試劑主要包括：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、甲基紅、吲哚試劑、V-P試劑、革蘭氏染色液等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。這些試劑用于配制各種培養(yǎng)基和進(jìn)行微生物生理生化特性分析。例如，蛋白胨和牛肉膏是培養(yǎng)基中的主要氮源和碳源，為微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)；氯化鈉用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；瓊脂作為凝固劑，使培養(yǎng)基呈固態(tài)，便于微生物生長(zhǎng)和觀察。實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備有：SW-CJ-2FD型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于提供無(wú)菌操作環(huán)境，減少微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該凈化工作臺(tái)采用高效空氣過(guò)濾器，能夠有效過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，為實(shí)驗(yàn)操作提供潔凈的空間。LRH-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），可精確控制溫度和濕度，為半干草魚(yú)片的貯藏和微生物培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境條件。其溫度控制范圍為5-60℃，濕度控制范圍為40%-95%，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境條件的要求。BCD-226WTGM型海爾冰箱（海爾集團(tuán)），用于保存試劑和樣品，確保其在適宜的溫度下儲(chǔ)存，防止變質(zhì)。其冷藏溫度可在2-8℃之間調(diào)節(jié)，冷凍溫度可達(dá)-20℃以下，能夠滿足不同試劑和樣品的保存需求。YXQ-LS-50SII型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），用于對(duì)培養(yǎng)基、玻璃器皿等進(jìn)行滅菌處理，殺滅其中的微生物，保證實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌條件。該滅菌鍋采用先進(jìn)的壓力控制和溫度監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠在高溫高壓條件下快速、徹底地殺滅各種微生物。其他設(shè)備還包括電子天平、顯微鏡、離心機(jī)、移液器等。電子天平用于準(zhǔn)確稱量試劑和樣品的質(zhì)量，其精度可達(dá)0.0001g，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)稱量精度的要求。顯微鏡用于觀察微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，幫助進(jìn)行微生物的初步鑒定。離心機(jī)用于分離和沉淀樣品中的微生物和雜質(zhì)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。移液器用于精確吸取和轉(zhuǎn)移液體試劑，其量程范圍廣泛，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)液體量的需求。3.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)菌分離純化時(shí)，將貯藏不同天數(shù)（3天、6天、9天、12天、15天、18天）的半干草魚(yú)片取出，用無(wú)菌剪刀剪取約2g魚(yú)片樣品，放入裝有18mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，在無(wú)菌均質(zhì)器上以10000r/min的速度均質(zhì)2min，制成10-1的樣品勻液。然后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)玫?0-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的勻液。分別取0.1mL不同稀釋度的勻液，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。將平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣、表面質(zhì)地等特征，挑取不同類(lèi)型的單菌落，采用平板劃線法在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至得到純培養(yǎng)物。例如，若觀察到有的菌落表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、顏色為白色，有的菌落表面粗糙、邊緣不整齊、顏色為黃色等，這些不同特征的菌落都有可能是不同種類(lèi)的細(xì)菌，都需要進(jìn)行挑取和純化。對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察，采用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形狀、大小、排列方式以及革蘭氏染色特性。如觀察到細(xì)菌呈桿狀，革蘭氏染色為陰性，可能是假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性桿菌；若細(xì)菌呈球狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性，可能是葡萄球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性球菌。記錄觀察結(jié)果，為后續(xù)的細(xì)菌鑒定提供初步依據(jù)。取純化后的細(xì)菌單菌落，接種到5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃、150r/min的搖床中培養(yǎng)18-24h，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后將培養(yǎng)好的菌液在4℃、5000r/min條件下離心10min，棄去上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2-3次，再將菌體懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光度（OD600），通過(guò)與預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，將菌液濃度調(diào)整為1×108CFU/mL，制成菌懸液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：取不同濃度梯度（如1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL）的已知濃度菌液，分別測(cè)定其OD600值，以菌液濃度為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將新鮮草魚(yú)洗凈、去鱗、去內(nèi)臟后，切成大小均勻的魚(yú)塊，每塊約10g。將魚(yú)塊放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃條件下滅菌20min，以殺死魚(yú)塊表面和內(nèi)部的微生物，制成無(wú)菌魚(yú)塊。取無(wú)菌魚(yú)塊，分別浸泡于制備好的不同細(xì)菌菌懸液中10min，使魚(yú)塊表面均勻附著細(xì)菌。以浸泡無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌魚(yú)塊作為空白對(duì)照。將接種后的魚(yú)塊放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放3塊魚(yú)塊，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。定期（每3天）對(duì)貯藏的魚(yú)塊進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。感官評(píng)價(jià)由經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的5名評(píng)價(jià)人員組成評(píng)價(jià)小組，按照GB/T16860-1997《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》對(duì)貯藏過(guò)程中的半干草魚(yú)片進(jìn)行感官評(píng)定。從色澤、氣味、質(zhì)地和滋味四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分為20分，其中色澤（5分）：新鮮的半干草魚(yú)片應(yīng)具有草魚(yú)本身的自然色澤，無(wú)明顯變色，得分4-5分；若色澤稍有暗淡，得3分；若出現(xiàn)明顯黃變或褐變，得分1-2分。氣味（5分）：具有半干草魚(yú)片特有的香味，無(wú)異味，得分4-5分；若有輕微不愉快氣味，得3分；若有明顯腐臭味，得分1-2分。質(zhì)地（5分）：肉質(zhì)緊密有彈性，切片完整，得分4-5分；若質(zhì)地稍軟，彈性略有下降，得3分；若質(zhì)地軟爛，切片易破碎，得分1-2分。滋味（5分）：滋味鮮美，具有該產(chǎn)品應(yīng)有的風(fēng)味，得分4-5分；若滋味稍有變淡，得3分；若有明顯異味，得分1-2分。最后計(jì)算感官評(píng)分的平均值。pH的測(cè)定參照GB5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》執(zhí)行。準(zhǔn)確稱取5g半干草魚(yú)片樣品，加入45mL蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min。將勻漿液在室溫下靜置30min，然后用PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值。在測(cè)定前，需用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=4.00、pH=6.86、pH=9.18）對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。TVB-N值的測(cè)定按照GB5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量凱氏定氮法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取10g勻漿后的半干草魚(yú)片樣品，加入100mL水，振蕩提取30min，然后過(guò)濾，取濾液進(jìn)行蒸餾。向蒸餾瓶中加入10mL濾液、10mL氧化鎂混懸液（10g/L），迅速連接好蒸餾裝置，以硼酸溶液（20g/L）為吸收液，蒸餾5min。蒸餾結(jié)束后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.01mol/L）滴定吸收液至終點(diǎn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。根據(jù)公式X=(V1-V2)×c×14.01×100/m計(jì)算TVB-N值，其中X為樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量（mg/100g），V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L），m為樣品質(zhì)量（g），14.01為氮的摩爾質(zhì)量（g/mol）。菌落總數(shù)的測(cè)定依據(jù)GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取25g半干草魚(yú)片樣品，加入225mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器均質(zhì)1min，制成1:10的樣品勻液。然后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x擇2-3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別注入無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。向平皿中加入冷卻至46℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基15-20mL，迅速混勻，待瓊脂凝固后，將平皿倒置，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并根據(jù)公式N=ΣC/(n1+0.1n2)×d計(jì)算菌落總數(shù)，其中N為樣品中菌落總數(shù)，ΣC為平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，d為稀釋因子（第一稀釋度）。為了定量分析各優(yōu)勢(shì)菌的腐敗能力，采用腐敗能力值（SpoilageAbilityValue，SAV）來(lái)衡量。SAV的計(jì)算公式為：SAV=(TVB-Nf-TVB-Ni)/(logNf-logNi)，其中TVB-Nf為貯藏末期的TVB-N值（mg/100g），TVB-Ni為貯藏初期的TVB-N值（mg/100g），Nf為貯藏末期的菌落總數(shù)（CFU/g），Ni為貯藏初期的菌落總數(shù)（CFU/g）。SAV值越大，表明該菌的腐敗能力越強(qiáng)。例如，若某菌接種的魚(yú)塊在貯藏初期TVB-N值為10mg/100g，菌落總數(shù)為103CFU/g，貯藏末期TVB-N值為30mg/100g，菌落總數(shù)為107CFU/g，則其SAV=(30-10)/(log107-log103)=20/(7-3)=5。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin2023軟件進(jìn)行處理和分析，通過(guò)單因素方差分析（One-WayANOVA）比較不同實(shí)驗(yàn)組之間各指標(biāo)的差異顯著性，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin2023軟件中的擬合函數(shù)對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，分析微生物的生長(zhǎng)特性。使用SPSS26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，研究不同指標(biāo)之間的相關(guān)性，如微生物數(shù)量與TVB-N值、感官評(píng)分之間的相關(guān)性等。3.3結(jié)果與分析在28℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，半干草魚(yú)片的感官品質(zhì)逐漸下降。貯藏初期，魚(yú)片色澤金黃，具有半干草魚(yú)片特有的香味，質(zhì)地緊密有彈性，滋味鮮美，感官評(píng)分在16-18分之間。貯藏6天后，魚(yú)片色澤開(kāi)始變深，氣味中魚(yú)香味有所減弱，出現(xiàn)輕微不愉快氣味，質(zhì)地開(kāi)始變軟，彈性下降，感官評(píng)分降至12-14分。貯藏12天后，魚(yú)片色澤明顯變深，出現(xiàn)黑斑，氣味中腐臭味明顯，質(zhì)地軟爛，幾乎沒(méi)有彈性，感官評(píng)分低于8分，此時(shí)魚(yú)片已嚴(yán)重腐敗變質(zhì)。pH在貯藏初期為6.5左右，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值先下降后上升。貯藏6天左右，pH值降至6.2左右，這是因?yàn)槲⑸锢敏~(yú)片的糖類(lèi)等物質(zhì)進(jìn)行代謝，產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致pH值下降。之后，隨著貯藏時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，微生物對(duì)蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的分解作用增強(qiáng)，產(chǎn)生大量堿性物質(zhì)，使pH值逐漸上升，到貯藏末期達(dá)到7.0左右。TVB-N值在貯藏初期較低，為10mg/100g左右。隨著貯藏時(shí)間的增加，TVB-N值逐漸上升，貯藏12天左右達(dá)到20mg/100g左右，到貯藏末期達(dá)到35mg/100g以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家規(guī)定的水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的TVB-N值標(biāo)準(zhǔn)（一般淡水魚(yú)類(lèi)TVB-N值超過(guò)20mg/100g被認(rèn)為開(kāi)始腐敗變質(zhì)），表明魚(yú)片的蛋白質(zhì)在微生物和酶的作用下不斷分解，產(chǎn)生了大量的氨以及胺類(lèi)等揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)。TMA值在貯藏開(kāi)始時(shí)較低，為2mg/kg樣品左右。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TMA值逐漸增加，貯藏15天左右達(dá)到8mg/kg樣品左右，到貯藏后期，TMA值繼續(xù)上升，這是由于微生物分泌的三甲胺氧化物還原酶將魚(yú)片內(nèi)的三甲胺氧化物還原為三甲胺，導(dǎo)致TMA值升高，使得魚(yú)片的腥味越來(lái)越重。菌落總數(shù)在貯藏初期較低，為103CFU/g左右。在貯藏的前6天，菌落總數(shù)增長(zhǎng)較為緩慢，到第6天達(dá)到104CFU/g左右。從第6天到第12天，菌落總數(shù)迅速增加，到第12天達(dá)到106CFU/g左右。在貯藏后期（12-18天），菌落總數(shù)繼續(xù)快速上升，到第18天達(dá)到108CFU/g以上，微生物的大量繁殖加速了魚(yú)片的腐敗變質(zhì)。對(duì)28℃貯藏下貨架終點(diǎn)的半干草魚(yú)片進(jìn)行菌相分析，共分離出5種不同類(lèi)型的細(xì)菌，分別命名為菌株A、菌株B、菌株C、菌株D和菌株E。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色特性及生理生化特征初步判斷，菌株A為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能利用葡萄糖、乳糖等多種糖類(lèi)產(chǎn)酸，可能為假單胞菌屬；菌株B為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可能為腸桿菌科細(xì)菌；菌株C為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，芽孢桿菌屬，能形成芽孢，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力；菌株D為革蘭氏陰性桿菌，具有較強(qiáng)的嗜冷性，可能為希瓦氏菌屬；菌株E為革蘭氏陽(yáng)性球菌，可能為葡萄球菌屬。將這5種優(yōu)勢(shì)菌株分別接種到無(wú)菌魚(yú)塊上，在28℃條件下貯藏，定期測(cè)定魚(yú)塊的各項(xiàng)指標(biāo)。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，接種不同菌株的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降速度存在差異。接種菌株A和菌株D的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降最快，貯藏6天后，色澤明顯變深，氣味中腐臭味明顯，質(zhì)地軟爛，感官評(píng)分低于8分；接種菌株B和菌株C的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降速度次之；接種菌株E的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降相對(duì)較慢。pH方面，接種菌株A和菌株D的魚(yú)塊pH值變化較為明顯，先下降后上升，且上升速度較快，在貯藏后期pH值明顯高于其他組；接種菌株B和菌株C的魚(yú)塊pH值也呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但變化幅度相對(duì)較?。唤臃N菌株E的魚(yú)塊pH值變化相對(duì)較為平緩。TVB-N值的變化情況為，接種菌株A和菌株D的魚(yú)塊TVB-N值上升速度最快，貯藏12天后，TVB-N值達(dá)到30mg/100g以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他組；接種菌株B和菌株C的魚(yú)塊TVB-N值上升速度次之；接種菌株E的魚(yú)塊TVB-N值上升相對(duì)較慢。TMA值方面，接種菌株A和菌株D的魚(yú)塊TMA值增長(zhǎng)迅速，貯藏15天后，TMA值達(dá)到10mg/kg樣品以上，明顯高于其他組；接種菌株B和菌株C的魚(yú)塊TMA值也有所增加，但增長(zhǎng)速度較慢；接種菌株E的魚(yú)塊TMA值增長(zhǎng)相對(duì)緩慢。菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)為，接種菌株A和菌株D的魚(yú)塊菌落總數(shù)增長(zhǎng)最快，在貯藏后期達(dá)到108CFU/g以上；接種菌株B和菌株C的魚(yú)塊菌落總數(shù)增長(zhǎng)速度次之；接種菌株E的魚(yú)塊菌落總數(shù)增長(zhǎng)相對(duì)較慢。通過(guò)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)TVB-N值與菌落總數(shù)之間存在顯著正相關(guān)（r>0.8，P<0.05），表明隨著微生物數(shù)量的增加，魚(yú)片的蛋白質(zhì)腐敗程度加劇，TVB-N值升高。感官評(píng)分與TVB-N值、TMA值之間存在顯著負(fù)相關(guān)（r<-0.8，P<0.05），說(shuō)明TVB-N值和TMA值的升高會(huì)導(dǎo)致魚(yú)片的感官品質(zhì)下降。對(duì)5種優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，菌株A和菌株D聚為一類(lèi)，這兩種菌株在各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)上較為相似，都具有較強(qiáng)的致腐能力，能快速分解魚(yú)片的蛋白質(zhì)和其他成分，導(dǎo)致魚(yú)片品質(zhì)迅速下降；菌株B和菌株C聚為一類(lèi)，它們的致腐能力相對(duì)較弱；菌株E單獨(dú)聚為一類(lèi)，其致腐能力相對(duì)其他菌株最弱。根據(jù)腐敗能力值（SAV）的計(jì)算公式，計(jì)算各優(yōu)勢(shì)菌株的SAV值。結(jié)果表明，菌株A的SAV值為8.5，菌株D的SAV值為8.2，這兩種菌株的SAV值較大，表明它們的腐敗能力較強(qiáng)；菌株B的SAV值為4.5，菌株C的SAV值為4.8，它們的腐敗能力相對(duì)較弱；菌株E的SAV值為2.0，其腐敗能力最弱。綜合各項(xiàng)分析結(jié)果，確定菌株A（可能為假單胞菌屬）和菌株D（可能為希瓦氏菌屬）為28℃貯藏條件下半干草魚(yú)片的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。3.4本章小結(jié)本章節(jié)圍繞28℃貯藏條件下半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)微生物致腐能力展開(kāi)研究。在貯藏過(guò)程中，半干草魚(yú)片的感官品質(zhì)隨時(shí)間下降，色澤變深、氣味惡化、質(zhì)地變軟、滋味變差。pH值先因微生物代謝產(chǎn)酸而下降，后因蛋白質(zhì)分解產(chǎn)堿而上升。TVB-N值、TMA值和菌落總數(shù)不斷上升，反映出蛋白質(zhì)腐敗、三甲胺生成和微生物繁殖的加劇。通過(guò)菌相分析，分離出5種優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)鑒定分別可能屬于假單胞菌屬、腸桿菌科、芽孢桿菌屬、希瓦氏菌屬和葡萄球菌屬。將這些菌株接種到無(wú)菌魚(yú)塊上進(jìn)行致腐能力研究，結(jié)果表明菌株A（可能為假單胞菌屬）和菌株D（可能為希瓦氏菌屬）致腐能力較強(qiáng)，能使魚(yú)塊的各項(xiàng)腐敗指標(biāo)迅速上升，感官品質(zhì)快速下降；菌株B和菌株C致腐能力次之；菌株E致腐能力最弱。通過(guò)相關(guān)性分析和聚類(lèi)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了不同菌株致腐能力的差異以及腐敗指標(biāo)之間的相關(guān)性。綜合各項(xiàng)分析，確定菌株A和菌株D為28℃貯藏條件下半干草魚(yú)片的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。這些研究結(jié)果為深入了解半干草魚(yú)片的腐敗機(jī)制，以及制定針對(duì)性的保鮮措施提供了重要依據(jù)。四、5℃貯藏條件下半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)微生物致腐能力4.1材料與設(shè)備實(shí)驗(yàn)所用半干草魚(yú)片均購(gòu)自當(dāng)?shù)匾患抑a(chǎn)加工企業(yè)。該企業(yè)采用先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，從新鮮草魚(yú)的挑選開(kāi)始，嚴(yán)格把控原料質(zhì)量，選用健康、鮮活的草魚(yú)作為原料。在加工過(guò)程中，經(jīng)過(guò)去鱗、去內(nèi)臟、清洗等預(yù)處理步驟，確保魚(yú)片的清潔衛(wèi)生。隨后，采用獨(dú)特的腌制配方，將魚(yú)片在含有食鹽、白砂糖、多種香辛料（如花椒、八角、桂皮等）的腌制液中腌制24h，使魚(yú)片充分吸收調(diào)味料，增添獨(dú)特風(fēng)味。接著，利用低溫?zé)犸L(fēng)干燥技術(shù)，在35℃的條件下干燥6h，精準(zhǔn)控制魚(yú)片的水分含量在30%-35%之間，制成半干草魚(yú)片。將制作好的半干草魚(yú)片用真空包裝機(jī)進(jìn)行真空包裝，每袋250g，以減少氧氣和微生物的接觸，延長(zhǎng)魚(yú)片的保質(zhì)期。將包裝好的半干草魚(yú)片置于溫度為5℃的恒溫冷藏箱中貯藏，模擬冷藏條件。實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑有：蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、甲基紅、吲哚試劑、V-P試劑、革蘭氏染色液、無(wú)菌生理鹽水等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其中，蛋白胨和酵母浸粉為微生物生長(zhǎng)提供氮源和碳源；氯化鈉用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；瓊脂作為凝固劑，使培養(yǎng)基呈固態(tài)，便于微生物生長(zhǎng)和觀察。葡萄糖、乳糖、蔗糖等糖類(lèi)用于微生物的糖發(fā)酵試驗(yàn)，以判斷微生物對(duì)不同糖類(lèi)的利用能力。溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)等指示劑用于檢測(cè)微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸堿變化。革蘭氏染色液用于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，以便在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特性。無(wú)菌生理鹽水用于稀釋樣品和制備菌懸液，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程的無(wú)菌環(huán)境。實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括：SW-CJ-1F型單人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），能夠提供潔凈的操作環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。LRH-150型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），可精確控制溫度，為微生物培養(yǎng)提供適宜的溫度條件，其溫度控制精度可達(dá)±0.1℃。BCD-196TQM型美的冰箱（美的集團(tuán)），用于保存試劑和樣品，其冷藏溫度可在2-8℃之間調(diào)節(jié)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品和試劑低溫保存的需求。YXQ-LS-30SII型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），通過(guò)高溫高壓對(duì)培養(yǎng)基、玻璃器皿等進(jìn)行滅菌處理，滅菌溫度可達(dá)121℃，壓力為0.1MPa，能夠有效殺滅各種微生物。其他設(shè)備還包括電子天平、顯微鏡、離心機(jī)、移液器、pH計(jì)、均質(zhì)器等。電子天平用于準(zhǔn)確稱量試劑和樣品的質(zhì)量，精度可達(dá)0.0001g；顯微鏡用于觀察微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，輔助進(jìn)行微生物的初步鑒定；離心機(jī)用于分離樣品中的微生物和雜質(zhì)；移液器用于精確吸取和轉(zhuǎn)移液體試劑，量程范圍為0.1-1000μL；pH計(jì)用于測(cè)定樣品的pH值，精度可達(dá)0.01；均質(zhì)器用于將樣品均勻分散，便于后續(xù)的微生物分離和檢測(cè)。4.2實(shí)驗(yàn)方法在5℃貯藏條件下，細(xì)菌分離純化的操作與28℃貯藏時(shí)類(lèi)似。將貯藏不同天數(shù)（每隔3天，共貯藏18天）的半干草魚(yú)片取出，用無(wú)菌剪刀剪取約2g魚(yú)片樣品，放入裝有18mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，在無(wú)菌均質(zhì)器上以10000r/min的速度均質(zhì)2min，制成10-1的樣品勻液。接著進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)玫?0-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的勻液。分別取0.1mL不同稀釋度的勻液，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)平行。將平板倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，待菌落長(zhǎng)出后，依據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣、表面質(zhì)地等特征，挑取不同類(lèi)型的單菌落，采用平板劃線法在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)物。例如，若觀察到有的菌落表面濕潤(rùn)光滑、邊緣整齊且顏色為白色，有的菌落表面粗糙、邊緣不整齊且顏色為黃色等，這些具有不同特征的菌落都有可能是不同種類(lèi)的細(xì)菌，均需進(jìn)行挑取和純化。對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察，采用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)菌的形狀、大小、排列方式以及革蘭氏染色特性。如觀察到細(xì)菌呈桿狀，革蘭氏染色為陰性，可能是假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性桿菌；若細(xì)菌呈球狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性，可能是葡萄球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性球菌。詳細(xì)記錄觀察結(jié)果，為后續(xù)的細(xì)菌鑒定提供初步依據(jù)。取純化后的細(xì)菌單菌落，接種到5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃、150r/min的搖床中培養(yǎng)18-24h，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后將培養(yǎng)好的菌液在4℃、5000r/min條件下離心10min，棄去上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2-3次，再將菌體懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光度（OD600），通過(guò)與預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，將菌液濃度調(diào)整為1×108CFU/mL，制成菌懸液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：取不同濃度梯度（如1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL）的已知濃度菌液，分別測(cè)定其OD600值，以菌液濃度為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將新鮮草魚(yú)洗凈、去鱗、去內(nèi)臟后，切成大小均勻的魚(yú)塊，每塊約10g。將魚(yú)塊放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃條件下滅菌20min，以殺死魚(yú)塊表面和內(nèi)部的微生物，制成無(wú)菌魚(yú)塊。取無(wú)菌魚(yú)塊，分別浸泡于制備好的不同細(xì)菌菌懸液中10min，使魚(yú)塊表面均勻附著細(xì)菌。以浸泡無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌魚(yú)塊作為空白對(duì)照。將接種后的魚(yú)塊放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放3塊魚(yú)塊，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，置于5℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。定期（每3天）對(duì)貯藏的魚(yú)塊進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。感官評(píng)價(jià)由經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的5名評(píng)價(jià)人員組成評(píng)價(jià)小組，按照GB/T16860-1997《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》對(duì)貯藏過(guò)程中的半干草魚(yú)片進(jìn)行感官評(píng)定。從色澤、氣味、質(zhì)地和滋味四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分為20分，其中色澤（5分）：新鮮的半干草魚(yú)片應(yīng)具有草魚(yú)本身的自然色澤，無(wú)明顯變色，得分4-5分；若色澤稍有暗淡，得3分；若出現(xiàn)明顯黃變或褐變，得分1-2分。氣味（5分）：具有半干草魚(yú)片特有的香味，無(wú)異味，得分4-5分；若有輕微不愉快氣味，得3分；若有明顯腐臭味，得分1-2分。質(zhì)地（5分）：肉質(zhì)緊密有彈性，切片完整，得分4-5分；若質(zhì)地稍軟，彈性略有下降，得3分；若質(zhì)地軟爛，切片易破碎，得分1-2分。滋味（5分）：滋味鮮美，具有該產(chǎn)品應(yīng)有的風(fēng)味，得分4-5分；若滋味稍有變淡，得3分；若有明顯異味，得分1-2分。最后計(jì)算感官評(píng)分的平均值。pH的測(cè)定參照GB5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》執(zhí)行。準(zhǔn)確稱取5g半干草魚(yú)片樣品，加入45mL蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min。將勻漿液在室溫下靜置30min，然后用PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值。在測(cè)定前，需用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=4.00、pH=6.86、pH=9.18）對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。TVB-N值的測(cè)定按照GB5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量凱氏定氮法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取10g勻漿后的半干草魚(yú)片樣品，加入100mL水，振蕩提取30min，然后過(guò)濾，取濾液進(jìn)行蒸餾。向蒸餾瓶中加入10mL濾液、10mL氧化鎂混懸液（10g/L），迅速連接好蒸餾裝置，以硼酸溶液（20g/L）為吸收液，蒸餾5min。蒸餾結(jié)束后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.01mol/L）滴定吸收液至終點(diǎn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。根據(jù)公式X=(V1-V2)×c×14.01×100/m計(jì)算TVB-N值，其中X為樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量（mg/100g），V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL），c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L），m為樣品質(zhì)量（g），14.01為氮的摩爾質(zhì)量（g/mol）。菌落總數(shù)的測(cè)定依據(jù)GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取25g半干草魚(yú)片樣品，加入225mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器均質(zhì)1min，制成1:10的樣品勻液。然后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x擇2-3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別注入無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。向平皿中加入冷卻至46℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基15-20mL，迅速混勻，待瓊脂凝固后，將平皿倒置，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并根據(jù)公式N=ΣC/(n1+0.1n2)×d計(jì)算菌落總數(shù)，其中N為樣品中菌落總數(shù)，ΣC為平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)，d為稀釋因子（第一稀釋度）。為了定量分析各優(yōu)勢(shì)菌的腐敗能力，采用腐敗能力值（SpoilageAbilityValue，SAV）來(lái)衡量。SAV的計(jì)算公式為：SAV=(TVB-Nf-TVB-Ni)/(logNf-logNi)，其中TVB-Nf為貯藏末期的TVB-N值（mg/100g），TVB-Ni為貯藏初期的TVB-N值（mg/100g），Nf為貯藏末期的菌落總數(shù)（CFU/g），Ni為貯藏初期的菌落總數(shù)（CFU/g）。SAV值越大，表明該菌的腐敗能力越強(qiáng)。例如，若某菌接種的魚(yú)塊在貯藏初期TVB-N值為10mg/100g，菌落總數(shù)為103CFU/g，貯藏末期TVB-N值為30mg/100g，菌落總數(shù)為107CFU/g，則其SAV=(30-10)/(log107-log103)=20/(7-3)=5。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin2023軟件進(jìn)行處理和分析，通過(guò)單因素方差分析（One-WayANOVA）比較不同實(shí)驗(yàn)組之間各指標(biāo)的差異顯著性，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin2023軟件中的擬合函數(shù)對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，分析微生物的生長(zhǎng)特性。使用SPSS26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，研究不同指標(biāo)之間的相關(guān)性，如微生物數(shù)量與TVB-N值、感官評(píng)分之間的相關(guān)性等。4.3結(jié)果與分析在5℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，半干草魚(yú)片的感官品質(zhì)呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。貯藏初期，魚(yú)片色澤自然，呈現(xiàn)出草魚(yú)本身的淡黃色，表面干燥，無(wú)明顯的濕潤(rùn)感，這是由于在加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)干燥處理，水分含量得到有效控制，減少了微生物滋生的環(huán)境。氣味上具有淡淡的魚(yú)香味和腌制后的咸香味，未出現(xiàn)明顯的異味，質(zhì)地緊密有彈性，手指按壓后能迅速恢復(fù)原狀，切片完整，不易破碎，滋味鮮美，具有半干草魚(yú)片應(yīng)有的風(fēng)味，感官評(píng)分在16-18分之間，處于較高水平，表明此時(shí)魚(yú)片的品質(zhì)良好，符合消費(fèi)者的接受標(biāo)準(zhǔn)。貯藏6天后，魚(yú)片色澤開(kāi)始稍有暗淡，逐漸變?yōu)樯铧S色，這可能是由于魚(yú)片表面的脂肪在低溫下仍會(huì)發(fā)生緩慢氧化，產(chǎn)生一些氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致色澤改變。氣味中魚(yú)香味有所減弱，同時(shí)出現(xiàn)了輕微的不愉快氣味，這是因?yàn)樵诘蜏丨h(huán)境下，雖然微生物的生長(zhǎng)速度受到一定抑制，但仍有部分耐冷微生物開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)生了一些揮發(fā)性的異味物質(zhì)。質(zhì)地開(kāi)始變軟，彈性下降，手指按壓后恢復(fù)速度變慢，切片時(shí)容易出現(xiàn)破碎現(xiàn)象，這是因?yàn)槲⑸锓置诘拿割?lèi)在低溫下也能緩慢作用，分解魚(yú)片的蛋白質(zhì)和其他成分，破壞了肌肉組織的結(jié)構(gòu)。滋味也逐漸變淡，感官評(píng)分降至12-14分，表明魚(yú)片的品質(zhì)有所下降。貯藏12天后，魚(yú)片色澤明顯變深，出現(xiàn)黑斑，這是脂肪氧化和微生物污染進(jìn)一步加劇的結(jié)果。氣味中腐臭味明顯，令人難以接受，此時(shí)微生物大量繁殖，分解魚(yú)片產(chǎn)生了大量的腐敗產(chǎn)物，如硫化氫、吲哚等，導(dǎo)致氣味惡化。質(zhì)地軟爛，幾乎沒(méi)有彈性，切片嚴(yán)重破碎，無(wú)法保持完整形狀，說(shuō)明魚(yú)片的肌肉組織已被嚴(yán)重破壞。滋味中充滿了異味，完全失去了半干草魚(yú)片應(yīng)有的風(fēng)味，感官評(píng)分低于8分，此時(shí)魚(yú)片已嚴(yán)重腐敗變質(zhì)，失去了食用價(jià)值。pH在貯藏初期為6.5左右，這是由于草魚(yú)本身的生理特性以及腌制過(guò)程中添加的鹽分等因素共同作用的結(jié)果。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值先下降后上升。在貯藏6天左右，pH值降至6.2左右，這是因?yàn)樵诘蜏叵?，魚(yú)片內(nèi)的微生物利用魚(yú)片的糖類(lèi)等物質(zhì)進(jìn)行代謝，產(chǎn)生了一些有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等，這些有機(jī)酸的積累導(dǎo)致pH值下降。此后，隨著貯藏時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，微生物對(duì)魚(yú)片的蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)分解作用增強(qiáng)，產(chǎn)生了大量的堿性物質(zhì)，如氨等，使得pH值逐漸上升，到貯藏末期達(dá)到7.0左右。TVB-N值在貯藏初期較低，為10mg/100g左右，這是因?yàn)榇藭r(shí)魚(yú)片的新鮮度較高，微生物數(shù)量較少，蛋白質(zhì)分解程度低。隨著貯藏時(shí)間的增加，TVB-N值逐漸上升，在貯藏12天左右達(dá)到20mg/100g左右，這是因?yàn)槲⑸镌诘蜏叵轮饾u適應(yīng)環(huán)境并開(kāi)始大量繁殖，它們分泌的蛋白酶等酶類(lèi)將魚(yú)片的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，氨基酸進(jìn)一步脫氨、脫羧等反應(yīng)，產(chǎn)生了更多的氨和胺類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致TVB-N值升高。到貯藏末期，TVB-N值達(dá)到35mg/100g以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的TVB-N值標(biāo)準(zhǔn)（一般淡水魚(yú)類(lèi)TVB-N值超過(guò)20mg/100g被認(rèn)為開(kāi)始腐敗變質(zhì)），表明此時(shí)魚(yú)片已嚴(yán)重腐敗。菌落總數(shù)在貯藏初期較低，為103CFU/g左右，這是因?yàn)樵谥谱鬟^(guò)程中的腌制和干燥工藝對(duì)微生物有一定的抑制作用，減少了初始微生物的數(shù)量。在貯藏的前6天，菌落總數(shù)增長(zhǎng)較為緩慢，到第6天達(dá)到104CFU/g左右，此時(shí)低溫環(huán)境對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到了一定的限制作用。然而，隨著貯藏時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，從第6天到第12天，菌落總數(shù)迅速增加，到第12天達(dá)到106CFU/g左右，這是因?yàn)椴糠帜屠湮⑸镏饾u適應(yīng)了低溫環(huán)境，開(kāi)始大量繁殖。在貯藏后期（12-18天），菌落總數(shù)繼續(xù)快速上升，到第18天達(dá)到108CFU/g以上，此時(shí)微生物數(shù)量過(guò)多，導(dǎo)致魚(yú)片嚴(yán)重腐敗變質(zhì)。對(duì)5℃貯藏下貨架終點(diǎn)的半干草魚(yú)片進(jìn)行菌相分析，共分離出4種不同類(lèi)型的細(xì)菌，分別命名為菌株F、菌株G、菌株H和菌株I。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色特性及生理生化特征初步判斷，菌株F為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能利用葡萄糖、乳糖等多種糖類(lèi)產(chǎn)酸，可能為假單胞菌屬；菌株G為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可能為腸桿菌科細(xì)菌；菌株H為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，芽孢桿菌屬，能形成芽孢，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力；菌株I為革蘭氏陰性桿菌，具有較強(qiáng)的嗜冷性，可能為希瓦氏菌屬。將這4種優(yōu)勢(shì)菌株分別接種到無(wú)菌魚(yú)塊上，在5℃條件下貯藏，定期測(cè)定魚(yú)塊的各項(xiàng)指標(biāo)。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，接種不同菌株的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降速度存在差異。接種菌株F和菌株I的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降最快，貯藏6天后，色澤明顯變深，氣味中腐臭味明顯，質(zhì)地軟爛，感官評(píng)分低于8分；接種菌株G和菌株H的魚(yú)塊感官品質(zhì)下降速度次之。pH方面，接種菌株F和菌株I的魚(yú)塊pH值變化較為明顯，先下降后上升，且上升速度較快，在貯藏后期pH值明顯高于其他組；接種菌株G和菌株H的魚(yú)塊pH值也呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但變化幅度相對(duì)較小。TVB-N值的變化情況為，接種菌株F和菌株I的魚(yú)塊TVB-N值上升速度最快，貯藏12天后，TVB-N值達(dá)到30mg/100g以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他組；接種菌株G和菌株H的魚(yú)塊TVB-N值上升速度次之。菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)為，接種菌株F和菌株I的魚(yú)塊菌落總數(shù)增長(zhǎng)最快，在貯藏后期達(dá)到108CFU/g以上；接種菌株G和菌株H的魚(yú)塊菌落總數(shù)增長(zhǎng)速度次之。通過(guò)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)TVB-N值與菌落總數(shù)之間存在顯著正相關(guān)（r>0.8，P<0.05），表明隨著微生物數(shù)量的增加，魚(yú)片的蛋白質(zhì)腐敗程度加劇，TVB-N值升高。感官評(píng)分與TVB-N值之間存在顯著負(fù)相關(guān)（r<-0.8，P<0.05），說(shuō)明TVB-N值的升高會(huì)導(dǎo)致魚(yú)片的感官品質(zhì)下降。對(duì)4種優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，菌株F和菌株I聚為一類(lèi)，這兩種菌株在各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)上較為相似，都具有較強(qiáng)的致腐能力，能快速分解魚(yú)片的蛋白質(zhì)和其他成分，導(dǎo)致魚(yú)片品質(zhì)迅速下降；菌株G和菌株H聚為一類(lèi)，它們的致腐能力相對(duì)較弱。根據(jù)腐敗能力值（SAV）的計(jì)算公式，計(jì)算各優(yōu)勢(shì)菌株的SAV值。結(jié)果表明，菌株F的SAV值為7.5，菌株I的SAV值為7.2，這兩種菌株的SAV值較大，表明它們的腐敗能力較強(qiáng)；菌株G的SAV值為3.5，菌株H的SAV值為3.8，它們的腐敗能力相對(duì)較弱。綜合各項(xiàng)分析結(jié)果，確定菌株F（可能為假單胞菌屬）和菌株I（可能為希瓦氏菌屬）為5℃貯藏條件下半干草魚(yú)片的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。4.4本章小結(jié)本章節(jié)對(duì)5℃貯藏條件下半干草魚(yú)片優(yōu)勢(shì)微生物致腐能力進(jìn)行了深入研究。在整個(gè)貯藏進(jìn)程中，半干草魚(yú)片的感官品質(zhì)持續(xù)惡化，色澤逐漸由自然的淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S色，最終出現(xiàn)黑斑；氣味從最初的魚(yú)香味和咸香味，逐漸被腐臭味取代；質(zhì)地也從緊密有彈性變?yōu)檐洜€，幾乎喪失彈性，切片嚴(yán)重破碎；滋味則完全失去了原本的鮮美，充滿異味。pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與微生物在低溫下的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，初期利用糖類(lèi)產(chǎn)酸導(dǎo)致pH下降，后期分解蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)產(chǎn)堿使得pH上升。TVB-N值和菌落總數(shù)不斷攀升，直觀地反映出蛋白質(zhì)的腐敗程度加劇以及微生物數(shù)量的快速增長(zhǎng)。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)木喾治?，成功分離出4種優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)初步鑒定分別可能屬于假單胞菌屬、腸桿菌科、芽孢桿菌屬和希瓦氏菌屬。將這些菌株接種到無(wú)菌魚(yú)塊上進(jìn)行致腐能力研究，結(jié)果顯示菌株F（可能為假單胞菌屬）和菌株I（可能為希瓦氏菌屬）的致腐能力較強(qiáng)，它們能迅速分解魚(yú)片的蛋白質(zhì)和其他成分，導(dǎo)致魚(yú)塊的各項(xiàng)腐敗指標(biāo)急劇上升，感官品質(zhì)快速惡化；而菌株G和菌株H的致腐能力相對(duì)較弱。相關(guān)性分析清晰地表明，TVB-N值與菌落總數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，隨著微生物數(shù)量的增加，魚(yú)片的蛋白質(zhì)腐敗程度顯著加劇，TVB-N值大幅升高；感官評(píng)分與TVB-N值之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，TVB-N值的升高直接導(dǎo)致魚(yú)片的感官品質(zhì)嚴(yán)重下降。聚類(lèi)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了不同菌株致腐能力的顯著差異。最終確定菌株F和菌株I為5℃貯藏條件下半干草魚(yú)片的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。與28℃貯藏條件相比，5℃貯藏時(shí)半干草魚(yú)片的品質(zhì)下降速度明顯更慢。在相同的貯藏時(shí)間內(nèi)，28℃下魚(yú)片的各項(xiàng)腐敗指標(biāo)上升更快，感官品質(zhì)惡化程度更嚴(yán)重。這充分說(shuō)明低溫貯藏能夠有效抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，延緩半干草魚(yú)片的腐敗進(jìn)程。但即便在5℃的低溫條件下，假單胞菌屬和希瓦氏菌屬等耐冷微生物仍能生長(zhǎng)并發(fā)揮較強(qiáng)的致腐作用。這些研究結(jié)果為深入理解半干草魚(yú)片在低溫貯藏條件下的腐敗機(jī)制提供了關(guān)鍵依據(jù)，也為制定針對(duì)性強(qiáng)、切實(shí)有效的保鮮措施，以延長(zhǎng)半干草魚(yú)片的貨架期奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。五、優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定及其生長(zhǎng)特性5.1材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料為在28℃和5℃貯藏條件下確定的半干草魚(yú)片主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌，即28℃貯藏時(shí)的菌株A（可能為假單胞菌屬）和菌株D（可能為希瓦氏菌屬），5℃貯藏時(shí)的菌株F（可能為假單胞菌屬）和菌株I（可能為希瓦氏菌屬）。這些優(yōu)勢(shì)腐敗菌是通過(guò)前面章節(jié)中對(duì)不同貯藏條件下半干草魚(yú)片的菌相分析、致腐能力研究等一系列實(shí)驗(yàn)篩選確定的。實(shí)驗(yàn)時(shí)將這些優(yōu)勢(shì)腐敗菌的純培養(yǎng)物保存在斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱中冷藏備用，以保證菌株的活性和純度。實(shí)驗(yàn)用到的主要試劑有：革蘭氏染色液（包括結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅染液），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，以區(qū)分細(xì)菌的革蘭氏陽(yáng)性或陰性特性，為細(xì)菌鑒定提供重要依據(jù)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，該試劑盒能夠高效、快速地從細(xì)菌細(xì)胞中提取高質(zhì)量的基因組DNA，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)的需求。TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer等PCR相關(guān)試劑，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，用于PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA基因，以便通過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)確定細(xì)菌種類(lèi)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，針對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），能夠特異性地?cái)U(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的大部分序列。蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于配制各種培養(yǎng)基，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。無(wú)菌生理鹽水，用于稀釋樣品、制備菌懸液等，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程的無(wú)菌環(huán)境。實(shí)驗(yàn)所需的主要設(shè)備包括：SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在進(jìn)行細(xì)菌分離、純化、接種等操作時(shí)，均在該凈化工作臺(tái)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度、時(shí)間等參數(shù)，保證擴(kuò)增