共軛焦顯微鏡最重要的功能為去除噪聲，而讓我們能夠清楚的觀察到厚片樣本組織內(nèi)部熒光物體的顯微構(gòu)造影像。在一般的光學(xué)顯微鏡由樣本組織非焦面所發(fā)散的訊息，會干擾真正焦點訊息的偵測，而使所得的影像模糊。共軛焦顯微鏡在PMT(photomultipliertube)偵測器前，具有一針孔(pinholediaphragm)裝置，可濾除樣本中非焦點部分所發(fā)散之噪聲，僅允許清楚的焦面影像通過，使其可對厚片樣本組織進(jìn)行不同深度的光學(xué)截面掃描，而這些沿Z軸方向所紀(jì)錄下來的數(shù)個連續(xù)光學(xué)截面信息則被紀(jì)錄成為一個影像資料組，可以進(jìn)行各種三度空間上的立體結(jié)構(gòu)重組或是定量上的分析。另外，共軛焦顯微技術(shù)除了用于會發(fā)散熒光的組織，也可用于其他會反射光線的樣本上，并且可與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡中各種增強(qiáng)對比的方法相互合用。這樣的技術(shù)提供了研究細(xì)胞及組織內(nèi)各種結(jié)構(gòu)和功能上的突破，已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研近幾年來共軛焦雷射掃描顯微鏡已成為廣泛被使用的研究工具，其主要是應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)上，研究一些會發(fā)散熒光的樣本以及生物的細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)。除了熒光影像，共軛焦顯微鏡也可產(chǎn)生如傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡般的穿透式影像(如相位差顯微影像)，且可將兩種影像合并以不同顏色呈現(xiàn)。另一個共軛焦顯微鏡的重要功能則為利用反射光的原理，來觀察具極性結(jié)構(gòu)的樣本。因此共軛焦顯微鏡技術(shù)也普遍的用在材料科學(xué)上，或是運(yùn)用在日常半導(dǎo)體回路對于任何一位想要利用光學(xué)來觀察生物或非生物之平面或立體顯微結(jié)構(gòu)的研究人員或?qū)W生，共軛焦雷射掃描顯微鏡將會是他最佳的選擇。共軛焦雷射掃描顯微鏡以高于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的解像力，不但可用于觀察物體表面，也可觀察活體組織的深部結(jié)構(gòu)。以雷射為光源結(jié)合顯微鏡及計算機(jī)影像的分析技術(shù)，共軛焦雷射掃描顯微術(shù)不但提高了顯微影像的分辨率，并可將連續(xù)光學(xué)截面的影像資料組重組可用于觀察并定量細(xì)胞內(nèi)之各項結(jié)構(gòu)、分子及離子之立體分布與瞬間變化，也可用于觀察組織內(nèi)的細(xì)胞、血管及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等之立體結(jié)構(gòu)。這方面的技術(shù)在最近十年內(nèi)快速的發(fā)展，并已廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞生物、神經(jīng)生物、分子生物、生理學(xué)、免疫學(xué)、訊號生物及發(fā)育生物等學(xué)門之研究。在生命科學(xué)的領(lǐng)域當(dāng)中，共軛焦顯微鏡被認(rèn)為是自電子顯微鏡發(fā)明以來，研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能最重要的必備儀器。近軛焦顯微鏡工作站是由具調(diào)節(jié)雷射光源之掃描器、全自動熒光顯微鏡與高解析影像記錄電腦系統(tǒng)共同組成。清華大學(xué)生命科學(xué)系腦神經(jīng)年來，更由于其高解析及樣品可免處理的特性，又被應(yīng)用在計算機(jī)芯片及生物芯片的觀察與分析研究。以下即簡要的敘述共軛焦雷射掃描顯微鏡技術(shù)的基本原理以及其在生命科學(xué)研究上的應(yīng)用。圖2.共軛焦顯微鏡之原理。共軛焦顯微鏡可藉由去除非焦面所產(chǎn)生的噪聲，以取得在樣本中不同深度之高分辨率顯微影像。其主要原理可分為三個步驟來說說明：首先雷射光線可以經(jīng)由物鏡聚焦成單一的光點，來照射樣品單點的特定深度；另外，由焦點反射或發(fā)散的光線還可經(jīng)由物鏡聚焦成單一的光束，完全通過影像偵測器前的針孔(pinholeaperture)；最后，其他在焦點之上及之下非焦點所產(chǎn)生的噪聲光子則在此針孔周圍被阻擋下來，因而確保偵測器獲取焦面訊號的準(zhǔn)確性，進(jìn)而達(dá)到所欲之不同深度高分辨率的顯為了要得到高分辨率的影像，共軛焦顯微鏡工作站是由雷射光源、全自動熒光顯微鏡與精密的電腦軟、硬件所共同組成(圖1)。突破了傳統(tǒng)式顯微鏡需要平均光照的原理，共軛焦顯微鏡是利用單點的光線(雷射光)為光源，經(jīng)過一個高分辨率的物鏡后，激發(fā)樣本組織內(nèi)部所欲平面上的單一焦點，因為非焦面所產(chǎn)生的光線或是熒光樣本發(fā)散出的螢光，也會影響到焦平面的光子，進(jìn)而使我們得到一對比不強(qiáng)且較模糊的影像。因此如何防止焦平面外傳回的影像，而只收集到自焦點上傳回的光子資訊，就變成最重要的事情了。在高分辨率物鏡的焦點上，直接反射的光線或是熒光分子所產(chǎn)生的光線會經(jīng)由此物鏡及一連串的鏡片被投射到一個極小的針孔(pinholediaphragm)裝置上(圖2的這個焦點和針孔裝置的相互配合，可以讓偵測器得到一個相對應(yīng)于樣本的共軛影像光點，這就是共軛焦顯微鏡的名稱由來。這樣的針孔裝置最重要的優(yōu)點在于，它可以濾除絕大部分投射在針孔外圍的噪聲，而讓其后的偵測器只收集到單一焦點所傳回的光子信息。因此針孔越小，便能去掉越多的雜訊，而得到專一且清晰的顯微影像了。比較共軛焦顯微鏡與傳統(tǒng)式的顯微鏡，前者明若要觀察厚片生物組織Z軸方向的影像，僅能侷超出了這個范圍，非焦面的光線將會嚴(yán)重的影響焦面的光線，致使對比消弱與影像模糊，若觀察的樣本同時會散發(fā)多種熒光，則欲得的各種單一熒光的影像都將混雜有其他光譜熒光的噪聲(圖3上)；而共軛焦顯微鏡則是專對這些厚片熒光樣本(如生物細(xì)胞組織)所設(shè)計的，它的光學(xué)截面之功能可以大幅減低傳統(tǒng)顯微鏡所無法去除的非焦面性噪聲，在多重?zé)晒獾臉颖旧?，也能確切的分開不同光譜范圍的熒光訊息，而得到多重?zé)晒夂衿M織之不同深度的清晰顯微影像(圖3下)。除此之外，共軛焦顯微鏡還可達(dá)到傳統(tǒng)顯微鏡所不及之高分辨率影像，但是必須特別注意樣本的制備、顯微影像的紀(jì)錄及影沒有好的熒光樣本，共軛焦顯微鏡不可能產(chǎn)生高解析的影像。在準(zhǔn)備共軛焦顯微鏡所使用的樣本時，必須要先確定在處理的過程中，如固定或包埋的步驟上，樣本整體三維結(jié)構(gòu)之完整性。我們可以藉由比較固定完全之后的樣本與未經(jīng)固定步驟的活體樣本來確認(rèn)這項顧慮，但若樣本自身不具熒光特性，則可以熒光染劑標(biāo)示以方便比較。舉例來說，NBD-C6-ceramide即為一方便使用的熒光染色劑，對細(xì)胞膜具有專一性，并具有活體染色的特性。因此，未經(jīng)固定步驟仍可以此熒光染劑標(biāo)定活的細(xì)胞，便可與固定完全且亦標(biāo)定細(xì)胞膜構(gòu)造的死細(xì)胞樣本相比較。將處理好的上述兩種樣本分別包埋在生理食鹽水(PBS)中，藉由比較相互間如樣本高度或型態(tài)上是否存有差異，便可確認(rèn)樣本的固定過程glutaraldehyde是一個較佳選擇的固定劑，但是這種固定劑會使許多樣本產(chǎn)生自體熒光且降低樣本的抗原性，因此在一些熒光性或是免疫染色處理等的樣本上并不適用。另一方面，paraformaldehyde因為不會產(chǎn)生自體熒光的問題且較能保存樣本的抗原性之故，也成為一常用的固定劑，但是其會造成樣本三維結(jié)構(gòu)上的扭曲、破壞膜狀結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜穿孔等的缺失，也是不可忽略的事實。為了解決這個問題，我們發(fā)現(xiàn)：只要事先以微波的方式，將置于生理食鹽水中之樣本組織稍微固定，再將樣本浸入paraformaldehyde中進(jìn)行傳統(tǒng)式的固定，即能同時保存良好的樣本三維結(jié)構(gòu)，并解決自體熒光以及樣另外，樣本的包埋也是一項影響樣本三維結(jié)構(gòu)完整性的重要因素。蓋玻片是否會壓迫所包埋的樣本，或是包埋液中的化學(xué)性質(zhì)都可能會造成樣本型態(tài)上的扭曲變形。為了避免厚片組織樣本被蓋玻片擠壓，最好能在載玻片下架上小片的蓋玻片或是涂上指甲油，來撐高蓋玻片與載玻片之間的包埋間距。我們的方法是使用圓環(huán)形的加強(qiáng)圈來達(dá)到這個目的，而在包埋好樣本之后，建議使用不具自體螢包埋液的選擇也是一門大學(xué)問，適當(dāng)?shù)陌駝┎坏梢杂兄跇颖救S結(jié)構(gòu)的完整性，一些的添加劑還可減緩樣本熒光物質(zhì)的衰減，但一些如含有polyvinylalcohol的包埋劑，則已證實會導(dǎo)致樣本的萎縮和變形。在這一方面，建議使用以生理食鹽水(PBS)調(diào)配的30－50%的甘油來當(dāng)包埋劑，一些具減緩熒光衰減的化學(xué)物質(zhì)也可另外加入，這種包埋劑可以保存樣本的外觀型態(tài)以達(dá)到我們的需求。其缺點則為澄清透明度不足。(1)標(biāo)定物要染上正確的熒光，使雷射光可以有效(2)熒光染色需要有專一性，且整個背景訊號降到(3)當(dāng)進(jìn)行多重標(biāo)記時，選擇激發(fā)和放射光重疊最(4)當(dāng)標(biāo)定物很小時，應(yīng)考慮以化學(xué)方法將訊號放從共軛焦顯微鏡的對焦平面制造一個完整的二(1)樣本在XY平面上是經(jīng)由雷射光藉由X和Y方向兩個不同的鏡面交互掃描，一條線一條線的(3)將PMT的電子訊號數(shù)字化，一個pixel一個pixel從數(shù)字化存儲器中收集輸出到顯示器上。圖3.昆蟲腦部雙重染色之傳統(tǒng)熒光顯微鏡影像(上圖)與共軛焦顯微鏡影像(下圖)圖。紅色部分為以對脫氧核糖核酸(DNA)專一的染劑(propidiumiodine)所標(biāo)定之細(xì)胞核；綠色部ceramide)所標(biāo)示之細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。在傳統(tǒng)熒光顯微鏡影像中，不但非焦面所產(chǎn)生的噪聲會消弱焦面所傳回的訊息，而且不同的染色訊息間亦會互相干擾，而使得影像信息模糊不清，細(xì)部構(gòu)造更多為兩種染色的混合結(jié)果；反之，在共軛焦顯微鏡影像中，組織的細(xì)部染色結(jié)構(gòu)均可被清晰的辨別，并且所得的影像在對比和解析度上均有很明顯的改善。比共軛焦顯微鏡影像的形成原理，是由于PMT偵測器內(nèi)收集到的光子，產(chǎn)生數(shù)位電流波動所產(chǎn)生的。這樣所產(chǎn)生的電流是沒有顏色的，因此需藉由紀(jì)錄器來將其轉(zhuǎn)換為黑白灰階的影像資料。但由于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡即可分別擁有多種不同顏色的影像，各種不同的細(xì)胞內(nèi)的胞器或其他物質(zhì)都可藉由不同顏色的熒光分子標(biāo)定，進(jìn)而可以研究不同物質(zhì)之間的相互關(guān)系，因此現(xiàn)今的共軛焦顯微鏡通常亦具有多頻道偵測多重資料組分析的功能設(shè)備(目前可同時擁有多達(dá)四套紀(jì)錄熒光光子的資料組，及一套穿透光光子的資料組)。目前的共軛焦顯微鏡可藉由不同偵測器內(nèi)的傳感器(sensor)區(qū)分出不同螢光染劑所被激發(fā)傳回的光子信息，因此不同資料組的灰階影像可以同時被完整的紀(jì)錄下來，這些影像可以并列的方式顯現(xiàn)出來，讓我們可以觀察并分析細(xì)胞內(nèi)不同分子的交互作用或是特殊蛋白質(zhì)在細(xì)胞不但可以將不同熒光分子顯示的細(xì)部影像都更清楚的表現(xiàn)出來，并且也可較清楚的觀察其相互之間分布差異與關(guān)系(圖4，上三圖)。另一個顯示這些不同資料組的方法為，將紀(jì)錄不同熒光分子之不同灰階資料組，分別轉(zhuǎn)換成預(yù)設(shè)的不同顏色的顏色深淺資料組，若只使用二或三個資料組時，系統(tǒng)將仍可表現(xiàn)出最佳的影像強(qiáng)弱差異，這種表現(xiàn)方法的優(yōu)點為：每一個顏色都代表了一種單獨(dú)的熒光資料組，而可在一個影像中同時顯示所紀(jì)錄的不同資料信息(圖4，下)。另外一個共軛焦顯微鏡獨(dú)特的地方是：它提供了重組三度空間顯微影像的功能。在一個單一的光學(xué)截面上，共軛焦顯微鏡能夠讓偵測器只偵測到自焦點散發(fā)并通過針孔而產(chǎn)生的光線，而除去其他非焦點所發(fā)散的干擾噪聲。因之，只要光線被樣本吸收的程度不高并且不超過物鏡的工作距離，便可以轉(zhuǎn)動顯微鏡對焦調(diào)節(jié)輪，來觀察到垂直方向任何深度的樣本結(jié)構(gòu)。接下來，只要讓顯微鏡可以自動的從設(shè)定的樣本Z軸起始位置，由微馬達(dá)帶動著，依照預(yù)設(shè)之間隔距離，一片片光學(xué)截面的掃描紀(jì)同時觀察三種熒光染色。纖維母細(xì)胞中層之共軛焦顯微光學(xué)切片影像顯示細(xì)胞核(藍(lán)色)、肌動蛋白纖維(綠色)及粒腺體(紅色)在細(xì)胞中之分布情形。左上圖為(DNA)專一的染劑(DAPI)所標(biāo)定之細(xì)胞核；中上圖為由OregonGreen488phalloidin所標(biāo)示之肌動蛋白纖維；右上圖為由MitoTrackerRed所標(biāo)示之粒腺體；下圖為計算機(jī)合并上述三種不同染色資料組所重組之高分辨率(2048×2048dpi×3)影像圖。錄，至樣本Z軸的終止位置即可(圖5)。需要特別注意的是，所設(shè)定的掃描間距必須小于光學(xué)截面一半的厚度，如此才不會漏失應(yīng)得的影像信息，而使影像變得不連續(xù)。這樣由連續(xù)掃描，自樣本表面至底部的一連串光學(xué)截面信息資料組，便可由計算機(jī)儲存起來，這些資料便包含了樣本的所有三度空間的(2)設(shè)定顯微鏡、濾片、鏡頭和屏蔽的途徑使得最(3)利用高數(shù)值光圈的鏡頭盡可能的提高分(4)考慮使用高數(shù)值光圈的水鏡，盡量減少球面像許多影像處理軟件可以藉由灰階的調(diào)整或亮度和對比的改善來增加影像的清晰度，或利用主要的標(biāo)示影像減去背景影像有助于噪聲的消除。影像組的相加、相減、影像的比值、影像的過濾、影像相互的關(guān)系、影像的編輯、擷取、去模糊以及各種不同的影像處理，也可以經(jīng)由更復(fù)雜的計算機(jī)軟件來處理。國家高速計算機(jī)中心鑒于計算機(jī)輔助生物顯微影像分析的快速發(fā)展，已于今年成立國家生物顯微影像中心伺服網(wǎng)站，引進(jìn)一套高階3D顯微影像分析軟體－IMARIS，提供國內(nèi)相關(guān)研究工作的計算機(jī)計算資源，進(jìn)行生物影像的分析處理。該軟體備有分析及定量測量共軛焦顯微鏡3D影像的種種功能，配合國家高速計算機(jī)中心的計算資源對于相關(guān)學(xué)術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展極有幫助影像處理軟件可以收集像素重組成一個三維立體的顯微結(jié)構(gòu)，同時也可以經(jīng)由簡單的處理這些像素使得影像可以做三度空間的旋轉(zhuǎn)，可以從任何一個角度觀看影像。還有幾種不同呈現(xiàn)三度空間的方法可以從共軛焦影像資料組中處理得到。如果將整個影像組一片接著一片的展開來，那么整個3D的影像信息可從中獲得。在這個呈現(xiàn)方式中，二維的影像信息以單一的影像呈現(xiàn)，而三度空間的影像必須涵蓋所有這些順序排列的單一影朱槿花粉之三度空間立體影像重組圖。左排圖為花粉表面到中間不同深度，以5微米為間距之共軛焦顯微光學(xué)切片圖；右上圖為由之左排圖共軛焦顯微光學(xué)切片資料組所重組之直徑約0.5公厘的花粉表面立體影像圖；右下圖為同一組資料以不同顏色代表距表面不同深度之花粉表面立體影像重組圖。圖6.人體細(xì)胞染色體(chromosome)及著絲點(kinetochore)的三度空間共定位(colocolization)立體影像分析圖。染色體(紅色)上中心粒(centromere)與著絲點(綠色)之間的黏連在細(xì)胞有絲分裂(mitosis)或分裂間期(interphase)時都可以被觀察到。兩眼直視，可將左右兩個影像合并成為一個三維的影像。比例尺昆蟲腦部神經(jīng)細(xì)胞與其內(nèi)分泌系統(tǒng)咽側(cè)腺(corpusallatum)相接觸的突觸之三維立體影像重組圖，以不同顏色代表距表面不同深度。具有腦神經(jīng)物質(zhì)allatostatin之神經(jīng)細(xì)胞末端影像，可利用免疫熒光染色的方式，以共軛焦顯微鏡掃描與記錄下來。比例尺為50微毫米。圖8.昆蟲腦內(nèi)蕈狀體(mushroombody)(左圖)與中心體(centralcomplex)(右圖)。以共軛焦顯微鏡掃描并立體影像重組后，將虛擬的光源置于結(jié)構(gòu)體的左前方照射，產(chǎn)生右后方的陰影以突顯其立體效果。比例像。在Z軸方向的每一個影像可以單一影像呈現(xiàn)(圖5，左)，亦可選擇性的從原始資料中選擇部分假設(shè)從影像資料組壓縮所有的光學(xué)截面，將可以計算出一個全新的單一影像。這樣一個簡單的計算例子稱之為最大亮點的投影。每一個影像都是來自Z軸在不同截面中最亮的灰階值。這些影像中最亮值的位置被紀(jì)錄下來，所以一個從最表面到最底部對焦準(zhǔn)確的影像就被呈現(xiàn)出來了(圖5)。的放在一起可呈現(xiàn)一對立體的影像(圖6)。觀看者必須將這兩個影像對焦在一起而形成一個3D影像。這個方法使我們得到一個多顏色的影像，但是眼睛必須能夠同時分別對焦兩個影像才能看出立體效果。有些人無法做到這一點，因此也可以將兩個影像分離為紅色和綠色互相重疊而形成一個3D影像。此時只要利用分別由紅色和綠色作成的紅綠眼