微生物基因組無痕敲除技術(shù)介紹

有痕敲除&無痕敲除

基因敲除是一種常見的生物工程技術(shù)，可用于微生物基因組改造。有痕敲除的含義是

每次敲除基因后都會在基因組中引入一個篩選標(biāo)記。一方面，當(dāng)進行連續(xù)敲除時，多種抗

性標(biāo)記在同一株菌體中堆疊，使得后面抗體標(biāo)記的選捧越來越困難。另一方面,抗體基因

的插入可能會影響上下游基因的表達。因此,無痕(markerless/scarless)敲除越來越受

到追捧,成為人們研究的重點。

無痕敲除技術(shù)

1同源重組

同源重組技術(shù)包括RecA和Red重組系統(tǒng)，Red系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢，包括同源臂較

短，重組率較高等，被廣泛用于大腸桿菌的基因組編輯。然后Red系統(tǒng)存在外源片段殘留

的情況，比如殘留一個FRT重組酶作用位點。研究人員通過持續(xù)的研究，對該系統(tǒng)進行了

持續(xù)的優(yōu)化和改進，并開發(fā)出了無痕敲除技術(shù)，方便進行連續(xù)多個基因的敲除操作。下面

我們將對這些優(yōu)化策略進行解讀。

1.1環(huán)狀質(zhì)粒型同源重組載體

環(huán)狀質(zhì)粒載體是實現(xiàn)大腸桿菌基因敲除的經(jīng)典策略，依靠的是RecA重組系究

RecA系統(tǒng)主要包括RecA、RecBCD、RuvA、RuvB、RuvC等。RecA具有與重組相關(guān)

的活性,RecBCD可降解線性DNA片段，通過Chi序列識別靶位點，形成單鏈區(qū)域，然

后再RecFOR、RecQ、RuvABC.SSB等蛋白共同作用下由RecA進行同源重組。應(yīng)用

此類載體進行的基因敲除可分為2種類型,一種是通過同源單交換的插入型敲除，另一種

是通過同源雙交換的置換型敲除，后者可實現(xiàn)目標(biāo)基因無痕敲除，但是第二步同源交換的

效率較低。

1.2線性雙鏈DNA型同源重組載體

該載體依據(jù)Red重組系統(tǒng)。線性載體直接利用PCR的方法獲得帶有與靶基因同源的

DNA片段和抗性基因，在Red重組系統(tǒng)的輔助下實現(xiàn)大腸桿菌的無痕敲除。相比于質(zhì)粒

型載體，該方法可以避免目標(biāo)基因突變體（如基因點突變、基因缺失突變、基因插入突變）

克隆和質(zhì)粒載體的構(gòu)建簡化了流程。但是該方法有一個缺點即線性DNA容易被RecBCD

酶降解。但這個問題可以被克服，Red重組系統(tǒng)設(shè)計時就已經(jīng)包含了能抑制RecBCD對線

性DNA降解的Gam蛋白。該載體同樣適用于RecA重組系統(tǒng)。

PCR：構(gòu)建上博引物abu

PCR：合成線性用藻重組施體

Ara靖導(dǎo)表達RedIffiM

電轉(zhuǎn)化線性栽體

發(fā)生同毒■蛆

Cm抗性I1選

PCR■定

CTc?#,衰達l-Scal

*口引發(fā)DSB修黛機制

苜落PCR■定

圖1.應(yīng)用線性雙鏈DNA型同源重組載體的無痕敲除技術(shù)原理圖（Feh所等2008）

下圖是葛高順等人改進的大腸桿菌無痕敲除策略，第一步是采用兩次PCR擴增出與

目的基因兩端同源并包含核酸內(nèi)切酣I-Scel序列的氯霉素抗性片段。然后誘導(dǎo)質(zhì)粒

PKD46表達Red同源重組系統(tǒng)，并進行同源交換敲除目的基因，笫二步進行無痕化處

理。

nanKETA

Red

(pKD46)

PUC57Z

684mer

684m<rdsDNAs

Bed+I-Scel叱3二Rev

(pWRG99)

圖2.質(zhì)粒型無痕化基因敲除策略（葛高順等20141

2Cre/loxp系統(tǒng)

Cre重組酶于1982年在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn),全長1029bp,能介導(dǎo)2個loxp位點

間的基因刪除或者倒立。loxp是一段回文序列，長約34bp，包含2個13bp的反向重復(fù)

序列和1個8bp的不對稱間隔區(qū)，是Cre酶的特異性識別位點。近年來，Cre/loxp位點

特異性重組系統(tǒng)被用于無痕敲除。Herrmann等（2012）對該系統(tǒng)進行了改進，使得敲除

率可達100%。作者先將2個loxp位點通過單交換的方法整合到敲除基因兩側(cè),依靠Cre

重組酶作用實現(xiàn)靶基因敲除。

ExcisionofihcwholeclusterwithCrc

irecombinase

SYloxpXY

圖3.改進后的Cre/loxp系統(tǒng)用于無痕敲除原理示意圖(Herrmann等2012\

3CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRIPSR/Cas9技術(shù)是由RNA指導(dǎo)Cas9蛋白進行的定向基因組編輯技術(shù)，具有結(jié)構(gòu)

簡單、安全性高、切點精準(zhǔn)、價格低廉、可逆性、可同時編輯多個基因等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于

不同微生物中。這里主要講一下CRIPSR無痕編輯。通過將Red同源重組和CRISPR技術(shù)

結(jié)合，可以實現(xiàn)CRIPSR無痕編輯，利用了Red重組前的高效重組的優(yōu)點和CRISPR系統(tǒng)

識別并切割特異位點的優(yōu)點。Reisch等(2015)發(fā)明了no-SCAR方法，能一步實現(xiàn)多個

位點的無痕編輯(包括缺失、點突變、小片段插入等\該方法需要構(gòu)建2個質(zhì)粒，包括受

PTET啟動子控制表達的cas9和tetR組成表達的質(zhì)粒pCas9cr4和由受PTET啟動子控制表

達的和受阿拉伯犍誘導(dǎo)啟動子控制的人系統(tǒng)的質(zhì)粒

sgRNAParaB-RedpKDsg-xxx0Ronda

等(2016)基于MAGE(MultiplexAutomatedGenomeEngineering)技術(shù),倉!J造了

一種更為高效的CRMAGE(CRISPR/Cds9and入RedrecombineeringbasedMAGE

technology）,該方法對3個靶標(biāo)的重組率高達96.5%-99.7%。

C

TransformwithDay1

pCas9cr4

Transformwith,

Day2

pKDsg-xxx0O

ExpressX-Redand

transformwithDay3

ssDNAordsDNAoo

ScreenbyPCR

CurepKDsg-xxxooDay4

a：37°C

TransformwithDayS

nextpKDsg-xxxoorDay1

Day6

ooorDay2

圖4.no-SCAR系統(tǒng)用于大腸桿菌的基因組編輯（Reisch&Prather20151

Cdldeath

WT二二

圖5.CRMAGE系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒結(jié)構(gòu)（Ronda等20161

參考文獻:

1.FeherT,KarcagiI,GyorfyZ,etal.ScarlessengineeringoftheEscherichiacoli

genome[M]//MicrobialGeneEssentiality:ProtocolsandBioinformatics.Humana

Press,2008:251-259.

2.葛高順，張立超，趙昕，等.大腸桿菌基因組基因無痕敲除的優(yōu)化方法[幾中國生物

工程雜志,2014,34(06):68-74.

3.HerrmannS,SieglT,LuzhetskaM,etal.Site-specific