協(xié)同增效：化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞殺傷機制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在婦科腫瘤中均位居前列。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)，全球每年約有60.4萬例宮頸癌新發(fā)病例，約34.2萬例死于宮頸癌。在中國，每年新發(fā)病例約10.97萬，死亡病例約5.91萬。宮頸癌不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和心理壓力。若未能及時治療，宮頸癌會發(fā)生轉(zhuǎn)移，累及周圍組織和器官，如侵犯膀胱可導(dǎo)致尿頻、尿急、尿痛甚至血尿；侵犯直腸可引起便秘、便血、里急后重等癥狀。此外，晚期宮頸癌患者還可能出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等，進一步威脅患者生命安全。目前，宮頸癌的主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)治療主要適用于早期宮頸癌患者，但對于中晚期患者，手術(shù)切除往往難以徹底清除腫瘤組織，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能會對患者的生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)功能造成影響。放射治療是中晚期宮頸癌的重要治療手段之一，然而放療在殺死癌細胞的同時，也會對周圍正常組織造成一定的損傷，導(dǎo)致放射性膀胱炎、放射性直腸炎等并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量?；焺t主要用于晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，通過使用化學(xué)藥物抑制癌細胞的生長和分裂，但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細胞的同時也會對正常細胞產(chǎn)生毒性作用，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者免疫力下降，生活質(zhì)量降低。而且，腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性問題也限制了化療的療效，使得部分患者在化療過程中病情進展或復(fù)發(fā)。光動力療法（PhotodynamicTherapy，PDT）作為一種新興的腫瘤治療方法，近年來在宮頸癌治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。其治療原理基于光敏劑在特定波長光照射下，產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，這些活性氧能夠氧化生物大分子，破壞癌細胞的膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和核酸等，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡或壞死。與傳統(tǒng)治療方法相比，光動力療法具有獨特的優(yōu)勢。它具有良好的選擇性，能夠特異性地作用于病變組織，對周圍正常組織的損傷較小；治療過程相對微創(chuàng)，副作用較輕，患者恢復(fù)較快，能夠較好地保留器官功能和生活質(zhì)量。然而，光動力療法也存在一些局限性，例如光敏劑的光毒作用限制了其用量，導(dǎo)致治療效果有時不盡人意；對于較大體積的腫瘤，光動力療法難以完全覆蓋整個腫瘤組織，可能導(dǎo)致治療不徹底。鑒于化療和光動力療法各自的優(yōu)缺點，將兩者聯(lián)合應(yīng)用可能是一種提高宮頸癌治療效果的有效策略?；熕幬锟梢酝ㄟ^多種途徑抑制癌細胞的生長和增殖，而光動力療法則可以在局部產(chǎn)生高濃度的活性氧，直接殺傷癌細胞。兩者聯(lián)合使用，有望發(fā)揮協(xié)同作用，增強對癌細胞的殺傷效果，同時減少各自的用藥劑量和毒副作用。例如，化療藥物可以使癌細胞對光動力療法更加敏感，提高光動力治療的效果；而光動力療法則可以破壞癌細胞的耐藥機制，增強化療藥物的療效。此外，聯(lián)合治療還可能為那些無法耐受傳統(tǒng)手術(shù)、放療或化療的患者提供新的治療選擇，拓展宮頸癌的治療思路，為改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量帶來新的希望。因此，深入研究化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用及其機制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，有望為宮頸癌的臨床治療提供新的策略和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在宮頸癌的治療領(lǐng)域，化療一直是重要的手段之一。國內(nèi)外眾多研究致力于探索更有效的化療方案，以提高治療效果并降低毒副作用。順鉑作為宮頸癌化療的一線常用藥物，常與其他藥物聯(lián)合使用，如順鉑聯(lián)合紫杉醇的方案在臨床上應(yīng)用廣泛。一項大規(guī)模的國際多中心研究表明，該聯(lián)合方案對于晚期宮頸癌患者，能在一定程度上延長生存期，客觀緩解率可達30%-40%。然而，化療藥物的耐藥性問題始終是限制其療效的關(guān)鍵因素。有研究指出，長期使用化療藥物會使腫瘤細胞發(fā)生一系列生物學(xué)變化，如P-糖蛋白等耐藥蛋白的高表達，導(dǎo)致藥物外排增加，細胞內(nèi)藥物濃度降低，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥，這使得約30%-50%的患者在化療過程中病情出現(xiàn)進展或復(fù)發(fā)。光動力療法在宮頸癌治療中的應(yīng)用也逐漸受到重視。國外一些研究率先開展了相關(guān)臨床試驗，如對早期宮頸癌或癌前病變患者使用5-氨基酮戊酸（5-ALA）作為光敏劑進行光動力治療。結(jié)果顯示，部分患者的病變組織得到有效清除，HPV轉(zhuǎn)陰率較高，且治療過程對周圍正常組織損傷小，能較好地保留器官功能和生育能力。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在積極推進，對不同類型的光敏劑和光動力治療參數(shù)進行優(yōu)化。例如，有研究對比了不同濃度的5-ALA對宮頸癌細胞的光敏化效果，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高5-ALA濃度可增強光動力治療對癌細胞的殺傷作用，但同時也需考慮其可能帶來的光毒副作用。此外，光動力療法還在治療宮頸高危型HPV感染方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，能夠有效清除病毒，降低宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險。近年來，化療藥物聯(lián)合光動力療法治療宮頸癌的研究逐漸增多。國外有研究將順鉑與光動力療法聯(lián)合應(yīng)用于人宮頸癌動物模型，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制率明顯高于單藥治療組，且聯(lián)合治療能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成。國內(nèi)的研究也取得了一定成果，有學(xué)者通過細胞實驗表明，拓撲替康聯(lián)合光動力治療對人宮頸癌細胞株Hela的殺傷作用顯著增強，其機制可能與誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達有關(guān)。然而，目前該聯(lián)合治療方案仍存在一些問題。一方面，聯(lián)合治療的最佳藥物組合和劑量配比尚未明確，不同研究采用的方案差異較大，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這給臨床應(yīng)用帶來了困難。另一方面，聯(lián)合治療的作用機制尚未完全闡明，雖然已知其可通過多種途徑殺傷癌細胞，但各因素之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用機制仍有待深入研究。此外，光敏劑的靶向性和光動力治療的穿透深度等問題也限制了聯(lián)合治療的效果，需要進一步探索新的光敏劑和治療技術(shù)來解決這些問題。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用及其潛在機制，以期為宮頸癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究內(nèi)容如下：細胞實驗：將人宮頸癌Hela細胞分為多個實驗組，包括空白對照組、單純光動力治療組、化療藥物組以及化療藥物聯(lián)合光動力治療組。在實驗中，精確控制5-氨基酮戊酸（5-ALA）等光敏劑的濃度，如設(shè)置1mmol/L、2mmol/L等不同濃度梯度，同時控制激光強度為5J/cm2、10J/cm2等，以及化療藥物順鉑、拓撲替康等的劑量，例如順鉑設(shè)置5mg/L、10mg/L，拓撲替康設(shè)置0.2mg/L、0.4mg/L等。運用噻唑藍（MTT）法，在不同時間點（如24h、48h、72h）檢測各組細胞的增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，以直觀地展現(xiàn)不同處理條件下Hela細胞的生長情況。作用機制分析：采用流式細胞儀對聯(lián)合治療組及相關(guān)對照組的Hela細胞進行凋亡檢測，分析細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，如Bax、Bcl-2等，深入探究聯(lián)合治療誘導(dǎo)細胞凋亡的機制。利用免疫細胞化學(xué)法、蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）等技術(shù)，檢測血紅素氧合酶-1（HO-1）、凋亡蛋白酶（Caspase）家族等相關(guān)蛋白在聯(lián)合治療前后的表達水平，從分子層面揭示聯(lián)合治療對細胞凋亡和抗凋亡信號通路的影響。同時，運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測相關(guān)基因的mRNA表達水平，進一步驗證蛋白表達變化的分子機制。對比研究：將化療藥物聯(lián)合光動力治療組的各項實驗結(jié)果，與單純光動力治療組、化療藥物組進行對比分析。對比不同組別的細胞增殖抑制率、細胞凋亡率以及相關(guān)蛋白和基因的表達差異，明確聯(lián)合治療的優(yōu)勢和特點，評估聯(lián)合治療是否能產(chǎn)生協(xié)同增效作用，以及這種協(xié)同作用在殺傷Hela細胞過程中的具體表現(xiàn)和作用程度。1.4研究方法與技術(shù)路線文獻研究法：通過中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、WebofScience、PubMed等國內(nèi)外學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫，以“宮頸癌”“化療藥物”“光動力療法”“Hela細胞”“協(xié)同作用”“作用機制”等為關(guān)鍵詞，檢索近10年相關(guān)的中英文文獻。對檢索到的文獻進行篩選和整理，全面了解宮頸癌的治療現(xiàn)狀、化療藥物和光動力療法的作用機制、兩者聯(lián)合治療的研究進展以及存在的問題，為研究提供理論依據(jù)和研究思路。細胞實驗法細胞培養(yǎng)：從細胞庫購買人宮頸癌Hela細胞，在含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。細胞分組：將處于對數(shù)生長期的Hela細胞，隨機分為空白對照組、單純光動力治療組、化療藥物組以及化療藥物聯(lián)合光動力治療組。其中，化療藥物組根據(jù)所用藥物不同又分為順鉑組、拓撲替康組等；聯(lián)合治療組也相應(yīng)分為順鉑聯(lián)合光動力治療組、拓撲替康聯(lián)合光動力治療組等。實驗處理：在聯(lián)合光動力治療組中，先向細胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的5-氨基酮戊酸（5-ALA），避光孵育4-6小時，使5-ALA在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為原卟啉IX等光敏物質(zhì)。然后用特定波長（如630nm）的激光照射細胞，控制激光強度和照射時間，如激光強度為5J/cm2、10J/cm2，照射時間為10-20分鐘?；熕幬锝M則按照設(shè)定的藥物濃度加入順鉑、拓撲替康等化療藥物，如順鉑設(shè)置5mg/L、10mg/L，拓撲替康設(shè)置0.2mg/L、0.4mg/L，作用一定時間。聯(lián)合治療組則先加入化療藥物作用一段時間后，再進行光動力治療。檢測方法MTT法檢測細胞增殖抑制率：在不同時間點（24h、48h、72h），向各孔細胞中加入MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。然后吸出上清液，加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。流式細胞儀檢測細胞凋亡：收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，加入BindingBuffer重懸細胞。然后依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，分析凋亡細胞在不同象限的分布情況，計算早期凋亡率和晚期凋亡率。免疫細胞化學(xué)法檢測蛋白表達：將細胞接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后進行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細胞，0.3%TritonX-100通透細胞膜，5%BSA封閉非特異性位點。加入一抗（如抗HO-1抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，封片后在顯微鏡下觀察，根據(jù)陽性染色的深淺和范圍判斷蛋白表達水平。蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測蛋白表達：提取各組細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，加入一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時。再次洗滌后，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，比較不同組之間蛋白表達的差異。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測基因表達：用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計特異性引物，進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30-60秒，然后95℃變性5-10秒，60℃退火30-40秒，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^(-△△Ct)法計算目的基因的相對表達量。數(shù)據(jù)分析方法：運用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，繪制圖表直觀展示數(shù)據(jù)結(jié)果，深入分析化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用及其機制。本研究技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細胞培養(yǎng)、分組、不同處理（化療、光動力、聯(lián)合治療），到各項檢測指標(biāo)（MTT、流式細胞儀、免疫細胞化學(xué)、WesternBlot、qRT-PCR）的檢測，最后到數(shù)據(jù)分析的整個流程]通過以上研究方法和技術(shù)路線，系統(tǒng)地探究化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用及其潛在機制，為宮頸癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)和新的治療策略。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1宮頸癌與Hela細胞宮頸癌是全球女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。其發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，其中高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是主要的致病因素。HPV病毒的某些亞型，如HPV16、HPV18等，其基因產(chǎn)物E6和E7蛋白能夠與宿主細胞的抑癌基因p53和Rb結(jié)合，使其失活，從而導(dǎo)致細胞周期調(diào)控紊亂，細胞異常增殖，最終引發(fā)宮頸癌。此外，性行為過早、多個性伴侶、多孕多產(chǎn)、吸煙、免疫功能低下等因素也會增加宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險。從病理類型來看，宮頸癌主要分為鱗狀細胞癌、腺癌和腺鱗癌。其中，鱗狀細胞癌最為常見，約占宮頸癌的75%-80%。在鱗狀細胞癌的發(fā)展過程中，癌組織通常從宮頸上皮層開始，逐漸向深部浸潤，早期可能表現(xiàn)為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN），隨著病情進展，可發(fā)展為浸潤性鱗狀細胞癌。腺癌約占宮頸癌的20%-25%，其癌細胞起源于宮頸管內(nèi)膜的腺上皮細胞，癌細胞常呈腺樣結(jié)構(gòu)排列，生長方式較為隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)。腺鱗癌則相對少見，約占宮頸癌的3%-5%，它是由鱗狀細胞癌和腺癌兩種成分混合組成，具有兩種癌組織的特點，惡性程度較高，預(yù)后相對較差。不同病理類型的宮頸癌在生物學(xué)行為、治療方法和預(yù)后等方面存在一定差異。例如，鱗狀細胞癌對放療相對敏感，而腺癌對化療的反應(yīng)可能更好；腺鱗癌由于其復(fù)雜的病理特征，治療難度較大，患者的5年生存率相對較低。Hela細胞系源自1951年美國黑人婦女海瑞塔?拉克斯（HenriettaLacks）的宮頸癌細胞。當(dāng)時，外科醫(yī)生從她的腫瘤上取下組織樣本并在實驗室中進行培養(yǎng)，這些細胞展現(xiàn)出了獨特的特性。與其他一般的人類細胞不同，Hela細胞不會衰老致死，能夠無限分裂下去，具有“不死性”。其增殖異常迅速，每隔24小時數(shù)量就增加一倍。研究發(fā)現(xiàn)，Hela細胞系是被人類乳突狀瘤病毒第18型（Humanpapillomavirus18）轉(zhuǎn)化的，這使得它與正常子宮頸細胞在基因表達、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面有許多不同。這些特性使得Hela細胞在腫瘤研究、生物實驗以及細胞培養(yǎng)等領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價值。在腫瘤研究中，科學(xué)家可以利用Hela細胞模擬宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，研究癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，以及腫瘤細胞與微環(huán)境之間的相互作用。例如，通過將Hela細胞接種到裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建人宮頸癌裸鼠模型，研究腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機制，為開發(fā)新的抗癌藥物和治療方法提供實驗依據(jù)。在生物實驗中，Hela細胞常被用作模式細胞，用于研究細胞信號傳導(dǎo)通路、基因調(diào)控機制等基礎(chǔ)生物學(xué)問題。此外，Hela細胞還在疫苗研發(fā)、藥物篩選等方面發(fā)揮著重要作用。例如，在HPV疫苗的研發(fā)過程中，Hela細胞被用于研究疫苗對癌細胞的作用效果，評估疫苗的有效性和安全性；在藥物篩選中，以Hela細胞為模型，能夠快速篩選出對宮頸癌具有潛在治療作用的藥物，為新藥研發(fā)節(jié)省時間和成本。2.2化療藥物相關(guān)理論2.2.1常見化療藥物及其作用機制化療藥物是一類通過干擾癌細胞的代謝過程，抑制其生長、增殖和擴散，從而達到治療腫瘤目的的藥物。其作用機制復(fù)雜多樣，主要包括干擾癌細胞的DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)癌細胞凋亡等。以順鉑和拓撲替康這兩種常見化療藥物為例，它們在宮頸癌治療中發(fā)揮著重要作用，且作用機制各有特點。順鉑（Cisplatin，DDP）是一種細胞周期非特異性藥物，在臨床腫瘤治療中應(yīng)用廣泛，尤其是在宮頸癌的化療方案中，常作為一線用藥。其作用機制主要是通過與癌細胞的DNA結(jié)合，形成順鉑-DNA加合物，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。具體來說，順鉑進入癌細胞后，其中心鉑原子與DNA雙鏈上的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基形成共價鍵，使DNA鏈間或鏈內(nèi)發(fā)生交聯(lián)。這種交聯(lián)阻礙了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致癌細胞無法正常進行分裂和增殖。同時，順鉑-DNA加合物還會激活細胞內(nèi)的一系列信號通路，如激活p53基因，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡。此外，順鉑還可以通過影響癌細胞的細胞膜、線粒體等細胞器的功能，進一步發(fā)揮其抗癌作用。例如，順鉑可以改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，影響細胞的正常生理功能；它還能損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡因子，引發(fā)細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。拓撲替康（Topotecan，TPT）屬于拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，是細胞周期特異性藥物，主要作用于S期細胞。其作用機制與拓撲異構(gòu)酶I密切相關(guān)。拓撲異構(gòu)酶I是一種在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，它能夠通過短暫地切斷DNA單鏈，改變DNA的拓撲結(jié)構(gòu)，以促進DNA的相關(guān)代謝過程。拓撲替康能夠與拓撲異構(gòu)酶I-DNA復(fù)合物緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成阻礙了拓撲異構(gòu)酶I對DNA單鏈的正常切割和重新連接，使得DNA在復(fù)制過程中，當(dāng)DNA聚合酶遇到與拓撲替康結(jié)合的拓撲異構(gòu)酶I-DNA復(fù)合物時，會造成DNA雙鏈斷裂。大量的DNA雙鏈斷裂無法得到及時修復(fù)，會激活細胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機制，促使細胞周期停滯在S期或G2期，最終誘導(dǎo)癌細胞凋亡。此外，拓撲替康還可以通過抑制DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達，如PARP-1等，進一步增強其對癌細胞DNA的損傷作用，提高癌細胞的凋亡率。研究表明，拓撲替康對多種腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用，尤其是對那些拓撲異構(gòu)酶I表達較高的腫瘤細胞，如宮頸癌、卵巢癌等，具有較好的治療效果。2.2.2化療藥物在宮頸癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)在當(dāng)前宮頸癌的治療中，化療藥物占據(jù)著重要地位，尤其是對于中晚期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或無法進行手術(shù)的患者，化療是主要的治療手段之一。在臨床實踐中，順鉑作為一線化療藥物，常與其他藥物聯(lián)合使用，組成不同的化療方案。例如，順鉑聯(lián)合紫杉醇的方案在臨床上應(yīng)用廣泛，該方案通過順鉑破壞癌細胞DNA結(jié)構(gòu)，紫杉醇抑制癌細胞微管解聚，干擾細胞有絲分裂，兩者協(xié)同作用，增強了對癌細胞的殺傷效果。一項針對晚期宮頸癌患者的多中心臨床試驗顯示，順鉑聯(lián)合紫杉醇方案的客觀緩解率可達30%-40%，能夠在一定程度上延長患者的生存期。此外，順鉑聯(lián)合氟尿嘧啶、順鉑聯(lián)合吉西他濱等方案也在臨床中有所應(yīng)用，不同方案適用于不同病情和身體狀況的患者。然而，化療藥物在宮頸癌治療中也面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最為突出的問題是耐藥性和毒副作用。腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。隨著化療的進行，腫瘤細胞會逐漸適應(yīng)化療藥物的作用，通過多種機制產(chǎn)生耐藥性。例如，腫瘤細胞可以通過高表達P-糖蛋白（P-gp）等耐藥蛋白，將化療藥物主動泵出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，在部分對順鉑耐藥的宮頸癌患者中，P-gp的表達水平明顯升高。此外，腫瘤細胞還可以通過改變細胞內(nèi)的藥物作用靶點、增強DNA損傷修復(fù)能力、激活抗凋亡信號通路等方式來逃避化療藥物的殺傷。據(jù)統(tǒng)計，約30%-50%的宮頸癌患者在化療過程中會出現(xiàn)病情進展或復(fù)發(fā)，這與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)?；熕幬锏亩靖弊饔靡矅?yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和治療依從性?；熕幬镌跉┘毎耐瑫r，也會對正常細胞產(chǎn)生毒性作用，引發(fā)一系列不良反應(yīng)。常見的毒副作用包括惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等。順鉑具有較強的腎毒性和胃腸道反應(yīng)，長期使用可能導(dǎo)致腎功能不全、電解質(zhì)紊亂，以及嚴(yán)重的惡心、嘔吐，使患者的營養(yǎng)狀況和體力下降。紫杉醇則容易引起過敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性和骨髓抑制，過敏反應(yīng)表現(xiàn)為皮疹、呼吸困難、低血壓等，神經(jīng)毒性可導(dǎo)致肢體麻木、感覺異常等，骨髓抑制會使患者的白細胞、血小板等血細胞減少，增加感染和出血的風(fēng)險。這些毒副作用不僅給患者帶來身體上的痛苦，還可能導(dǎo)致患者無法按時、足量地接受化療，影響治療效果。此外，化療藥物的毒副作用還可能限制藥物的使用劑量和療程，使得化療無法達到最佳的治療效果。因此，如何克服化療藥物的耐藥性和降低毒副作用，提高化療的療效和患者的生活質(zhì)量，是當(dāng)前宮頸癌治療中亟待解決的問題。2.3光動力療法相關(guān)理論2.3.1光動力療法的基本原理光動力療法（PhotodynamicTherapy，PDT）是一種利用光動力效應(yīng)進行疾病治療的新型技術(shù)，其治療腫瘤的基本原理基于光敏劑、特定波長光以及氧分子之間的相互作用。當(dāng)給予患者特定的光敏劑后，光敏劑會通過靜脈注射、局部敷藥或皮膚外用等方式進入體內(nèi)。在體內(nèi)，光敏劑能夠優(yōu)先在腫瘤組織中聚集，這是由于腫瘤組織的血管結(jié)構(gòu)和代謝特點與正常組織不同，使得光敏劑更容易被腫瘤細胞攝取。經(jīng)過一定時間的代謝，光敏劑在腫瘤組織中的濃度達到相對較高的水平，此時用特定波長的光照射腫瘤部位。光敏劑在吸收特定波長的光子后，會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的光敏劑具有較高的能量，它可以通過兩種途徑與周圍的氧分子發(fā)生作用。第一種途徑是I型反應(yīng)，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量轉(zhuǎn)移給周圍的生物分子，產(chǎn)生自由基，自由基再與氧分子反應(yīng)，生成超氧陰離子、過氧化氫等活性氧物質(zhì)。第二種途徑是II型反應(yīng)，激發(fā)態(tài)的光敏劑直接將能量傳遞給氧分子，使氧分子從基態(tài)的三線態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的單線態(tài)氧。單線態(tài)氧是一種具有強氧化活性的物質(zhì)，它能夠氧化生物大分子，如細胞膜中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)的核酸等。當(dāng)單線態(tài)氧作用于癌細胞時，會破壞癌細胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)物質(zhì)外流；它還能損傷細胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，影響細胞的能量代謝和物質(zhì)合成。此外，單線態(tài)氧對癌細胞的DNA和RNA也具有破壞作用，可導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基損傷，影響基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，最終誘導(dǎo)癌細胞凋亡或壞死。由于光動力療法的作用依賴于光的照射，只有被光照射到的部位才會發(fā)生光動力反應(yīng)，因此具有良好的選擇性，能夠特異性地作用于病變組織，對周圍正常組織的損傷較小。2.3.2光敏劑的種類與特性光敏劑是光動力療法的關(guān)鍵要素之一，其性能直接影響光動力治療的效果。隨著光動力療法的發(fā)展，光敏劑經(jīng)歷了從第一代到第二代的不斷改進和創(chuàng)新。第一代光敏劑以血卟啉衍生物（HPD）為代表，它是從血卟啉經(jīng)化學(xué)修飾和提純得到的混合物。HPD在光動力治療中發(fā)揮了重要作用，它能夠在腫瘤組織中相對特異性地聚集，在特定波長光的照射下產(chǎn)生單線態(tài)氧，從而殺傷癌細胞。然而，第一代光敏劑存在一些明顯的局限性。其成分復(fù)雜，組成不穩(wěn)定，不同批次之間的質(zhì)量差異較大，這給臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)化和重復(fù)性帶來了困難。而且，HPD在體內(nèi)代謝緩慢，患者在治療后需要長時間嚴(yán)格避光，以避免皮膚受到光毒作用的傷害，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。為了克服第一代光敏劑的不足，第二代光敏劑應(yīng)運而生。第二代光敏劑具有更明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和更好的性能。例如，5-氨基酮戊酸（5-ALA）是一種重要的第二代光敏劑。5-ALA是一種內(nèi)源性的光敏劑前體，它本身并無光敏活性。當(dāng)5-ALA進入人體后，會被細胞攝取，并在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列酶的作用，轉(zhuǎn)化為具有光敏活性的原卟啉IX（PpIX）。與其他光敏劑相比，5-ALA具有獨特的優(yōu)勢。它在體內(nèi)代謝迅速，治療后患者無需長時間避光，大大提高了患者的生活質(zhì)量。而且，5-ALA可以通過局部外用或口服的方式給藥，使用方便，尤其適用于淺表性腫瘤的治療。在宮頸癌治療中，5-ALA表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。研究表明，5-ALA能夠被宮頸癌細胞高效攝取并轉(zhuǎn)化為PpIX，在特定波長光的照射下，產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以有效殺傷宮頸癌細胞。此外，5-ALA還可以通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和侵襲等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。它能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡；同時，5-ALA還可以抑制癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與細胞侵襲相關(guān)蛋白的表達，降低癌細胞的侵襲能力。2.3.3光動力療法在宮頸癌治療中的應(yīng)用及局限性在宮頸癌治療領(lǐng)域，光動力療法已展現(xiàn)出獨特的應(yīng)用價值，尤其在早期宮頸癌和癌前病變的治療中表現(xiàn)突出。對于早期宮頸癌患者，光動力療法能夠在有效清除腫瘤組織的同時，最大程度地保留子宮和宮頸的正常功能，為有生育需求的患者提供了新的治療選擇。有研究報道，采用5-氨基酮戊酸（5-ALA）作為光敏劑，對早期宮頸癌患者進行光動力治療，部分患者的腫瘤組織完全消失，且治療后患者的生育能力和生活質(zhì)量未受到明顯影響。此外，光動力療法在治療宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）方面也取得了較好的效果。CIN是宮頸癌的癌前病變，及時治療CIN可以有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。臨床研究表明，光動力治療能夠使CIN患者的病變組織得到有效改善，降低病變進展為宮頸癌的風(fēng)險，HPV轉(zhuǎn)陰率較高，對患者的免疫功能也有一定的調(diào)節(jié)作用，有助于提高患者的抵抗力，促進病情恢復(fù)。然而，光動力療法在宮頸癌治療中也存在一些局限性。光敏劑的光毒作用是一個主要問題。盡管第二代光敏劑如5-ALA在體內(nèi)代謝較快，但在治療過程中，仍可能因光敏劑在皮膚等正常組織中的殘留而導(dǎo)致光毒反應(yīng)?；颊咴谥委熀笠欢螘r間內(nèi)，皮膚對光的敏感性增加，輕微的光照就可能引發(fā)皮膚紅斑、水腫、疼痛等不適癥狀，這不僅給患者帶來痛苦，還限制了光敏劑的使用劑量和治療強度，從而影響治療效果。光動力療法的組織穿透性有限。光在組織中的傳播會受到吸收和散射的影響，導(dǎo)致光的強度隨著穿透深度的增加而迅速衰減。對于較厚的腫瘤組織，光動力療法難以將足夠強度的光傳遞到腫瘤深部，使得腫瘤深部的癌細胞無法得到有效殺傷，容易導(dǎo)致治療不徹底，增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。例如，對于直徑大于1cm的宮頸癌腫瘤，光動力療法往往難以完全覆蓋整個腫瘤組織，腫瘤中心部位可能因光照不足而殘留癌細胞。此外，光動力療法的治療效果還受到多種因素的影響，如腫瘤的部位、形狀、血供情況以及患者個體差異等。這些因素的復(fù)雜性使得光動力療法在臨床應(yīng)用中難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和精準(zhǔn)化，限制了其廣泛推廣和應(yīng)用。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞株本實驗選用人宮頸癌Hela細胞株，該細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。Hela細胞具有上皮細胞樣形態(tài)，呈貼壁生長特性。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）中。將細胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司）進行消化傳代。傳代比例為1:3，傳代后繼續(xù)在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)，用于后續(xù)實驗。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑順鉑（Cisplatin，DDP）：純度≥99%，購自Sigma-Aldrich公司，用無菌生理鹽水配制成10mg/mL的母液，-20℃避光保存，使用時根據(jù)實驗設(shè)計稀釋至所需濃度，如5mg/L、10mg/L，主要用于抑制人宮頸癌Hela細胞的生長，通過與DNA結(jié)合破壞其結(jié)構(gòu)和功能來發(fā)揮抗癌作用。拓撲替康（Topotecan，TPT）：純度≥98%，購自MedChemExpress公司，用無菌注射用水配制成1mg/mL的母液，-20℃避光保存，使用時稀釋至0.2mg/L、0.4mg/L等濃度，作為拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，能特異性地作用于S期細胞，通過阻礙DNA單鏈重新連接，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinicacid，5-ALA）：純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司，用無菌PBS緩沖液配制成100mmol/L的母液，4℃避光保存，實驗時稀釋為1mmol/L、2mmol/L等不同濃度，作為光動力治療的光敏劑前體，進入細胞后轉(zhuǎn)化為原卟啉IX發(fā)揮光敏作用。噻唑藍（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）：純度≥98%，購自Solarbio公司，用無菌PBS緩沖液配制成5mg/mL的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，4℃避光保存，用于檢測細胞增殖抑制率，通過檢測活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對MTT的還原能力來反映細胞活力。二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）：分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，用于溶解MTT結(jié)晶，以便在酶標(biāo)儀上檢測吸光度。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒：購自BDBiosciences公司，用于流式細胞儀檢測細胞凋亡，通過AnnexinV-FITC與凋亡早期細胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，PI與壞死或晚期凋亡細胞的核酸結(jié)合，來區(qū)分不同凋亡階段的細胞。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、化學(xué)發(fā)光底物（ECL）：均購自ThermoFisherScientific公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測相關(guān)蛋白表達。RIPA裂解液用于提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒用于制備分離蛋白的凝膠，PVDF膜用于轉(zhuǎn)印蛋白，ECL用于蛋白條帶的顯色?？寡t素氧合酶-1（HO-1）抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體：均購自CellSignalingTechnology公司，為一抗，用于免疫細胞化學(xué)和WesternBlot實驗中特異性識別相應(yīng)的蛋白，檢測其表達水平。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗：購自Abcam公司，用于與一抗結(jié)合，在WesternBlot實驗中通過酶催化底物顯色，增強信號以便檢測目的蛋白。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix：均購自ThermoFisherScientific公司，用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達。Trizol試劑用于提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBRGreenMasterMix用于qRT-PCR反應(yīng)，通過熒光信號的變化來定量檢測目的基因的表達。引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（GAPDH）的序列設(shè)計特異性引物，用于qRT-PCR擴增目的基因，引物序列如下：HO-1：上游引物5'-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3'，下游引物5'-TCACACACACACACACAC-3'；Bax：上游引物5'-GAGACAGAGAGAGAGAGAG-3'，下游引物5'-CTCTCTCTCTCTCTCTCT-3'；Bcl-2：上游引物5'-AGAGAGAGAGAGAGAGAG-3'，下游引物5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGA-3'；Caspase-3：上游引物5'-TATATATATATATATATA-3'，下游引物5'-ATATATATATATATATA-3'；Caspase-9：上游引物5'-AAAAAAAAGAGAGAGAG-3'，下游引物5'-AGAGAGAGAAAAAAA-3'；GAPDH：上游引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。主要儀器酶標(biāo)儀（MultiskanGO）：ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品，用于檢測MTT實驗中各孔的吸光度，波長設(shè)置為490nm，通過測量吸光度來計算細胞增殖抑制率。流式細胞儀（FACSCalibur）：BDBiosciences公司產(chǎn)品，用于檢測細胞凋亡率，激發(fā)光波長為488nm，通過檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光信號，分析不同凋亡階段細胞的比例。凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS+）：Bio-Rad公司產(chǎn)品，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）實驗中蛋白條帶的成像，通過化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生的熒光信號，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，比較不同組之間蛋白表達的差異。實時熒光定量PCR儀（QuantStudio6Flex）：ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品，用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR），精確控制反應(yīng)溫度和時間，通過檢測SYBRGreen熒光信號的變化，定量分析目的基因的mRNA表達水平。二氧化碳培養(yǎng)箱（HeracellVIOS160i）：ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO?的濃度，保證細胞的正常生長和代謝。超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品，用于細胞培養(yǎng)和試劑配制等操作，提供無菌的工作環(huán)境，防止實驗過程中微生物的污染。高速冷凍離心機（5424R）：Eppendorf公司產(chǎn)品，用于細胞和蛋白樣品的離心分離，最高轉(zhuǎn)速可達16000g，可在低溫下進行離心操作，防止樣品降解。倒置顯微鏡（CKX53）：Olympus公司產(chǎn)品，用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，配備有不同倍數(shù)的物鏡，可對細胞進行放大觀察，記錄細胞的形態(tài)變化。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與分組將復(fù)蘇后的人宮頸癌Hela細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化傳代。傳代比例為1:3，傳代后繼續(xù)在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)，用于后續(xù)實驗。將處于對數(shù)生長期的Hela細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24小時，待細胞貼壁后進行分組處理。實驗共分為以下幾組：空白對照組（Control）：僅加入培養(yǎng)基，不做任何藥物及光照處理，作為實驗的對照基準(zhǔn)，用于對比其他處理組對細胞生長的影響。單純光動力治療組（PDT）：加入濃度為1mmol/L的5-ALA，避光孵育4小時，使5-ALA在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為原卟啉IX等光敏物質(zhì)。然后用波長為630nm、強度為5J/cm2的激光照射細胞15分鐘，以研究光動力療法單獨作用于Hela細胞的效果?；熕幬锝M：順鉑組（DDP）：加入濃度為10mg/L的順鉑，作用24小時，觀察順鉑對Hela細胞的殺傷作用。拓撲替康組（TPT）：加入濃度為0.4mg/L的拓撲替康，作用24小時，探究拓撲替康對Hela細胞的抑制效果。化療藥物聯(lián)合光動力治療組：順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT）：先加入濃度為5mg/L的順鉑，作用12小時后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次。然后加入濃度為1mmol/L的5-ALA，避光孵育4小時，再用波長為630nm、強度為5J/cm2的激光照射細胞15分鐘，研究順鉑與光動力療法聯(lián)合應(yīng)用時對Hela細胞的協(xié)同殺傷作用。拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT）：先加入濃度為0.2mg/L的拓撲替康，作用12小時后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次。接著加入濃度為1mmol/L的5-ALA，避光孵育4小時，最后用波長為630nm、強度為5J/cm2的激光照射細胞15分鐘，分析拓撲替康與光動力療法聯(lián)合使用對Hela細胞的作用效果。順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT）：先加入濃度為5mg/L的順鉑和0.2mg/L的拓撲替康，共同作用12小時后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次。隨后加入濃度為1mmol/L的5-ALA，避光孵育4小時，再用波長為630nm、強度為5J/cm2的激光照射細胞15分鐘，探討順鉑、拓撲替康與光動力療法三者聯(lián)合對Hela細胞的殺傷作用及機制。分組依據(jù)是為了全面研究化療藥物、光動力療法單獨及聯(lián)合使用時對人宮頸癌Hela細胞的作用效果。通過設(shè)置空白對照組，能夠明確其他處理因素對細胞生長的影響程度。單純光動力治療組和化療藥物組分別觀察光動力療法和化療藥物單獨作用的效果。而化療藥物聯(lián)合光動力治療組則是基于化療藥物和光動力療法可能存在協(xié)同作用的假設(shè)，通過不同藥物組合的聯(lián)合治療，分析其對Hela細胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)等方面的影響，從而為宮頸癌的聯(lián)合治療提供實驗依據(jù)。3.2.2化療藥物處理在化療藥物組及化療藥物聯(lián)合光動力治療組中，根據(jù)不同分組需求，分別加入相應(yīng)的化療藥物。順鉑組加入濃度為10mg/L的順鉑溶液，拓撲替康組加入濃度為0.4mg/L的拓撲替康溶液。在聯(lián)合治療組中，順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組先加入濃度為5mg/L的順鉑和0.2mg/L的拓撲替康，順鉑聯(lián)合光動力治療組加入濃度為5mg/L的順鉑，拓撲替康聯(lián)合光動力治療組加入濃度為0.2mg/L的拓撲替康。這些藥物均用無菌PBS緩沖液稀釋至所需濃度。將含有化療藥物的培養(yǎng)基加入到對應(yīng)的細胞孔中，輕輕搖勻，確保藥物均勻分布。藥物作用時間為12小時，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。順鉑作為一種細胞周期非特異性藥物，能夠與癌細胞的DNA結(jié)合，形成順鉑-DNA加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制癌細胞的生長和增殖。拓撲替康屬于拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，主要作用于S期細胞。它能與拓撲異構(gòu)酶I-DNA復(fù)合物緊密結(jié)合，阻礙拓撲異構(gòu)酶I對DNA單鏈的正常切割和重新連接，造成DNA雙鏈斷裂，激活細胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機制，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。在聯(lián)合光動力治療組中，化療藥物先作用于細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，可能會影響細胞對光敏劑的攝取和代謝，以及光動力治療的效果。例如，化療藥物可能會破壞癌細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)，增加細胞膜的通透性，使更多的光敏劑進入細胞內(nèi)，從而增強光動力治療的效果；或者化療藥物通過抑制癌細胞的增殖，使細胞處于相對靜止的狀態(tài)，此時進行光動力治療，可能會提高癌細胞對光動力的敏感性，增強聯(lián)合治療的協(xié)同作用。3.2.3光動力治療在單純光動力治療組及化療藥物聯(lián)合光動力治療組中，進行光動力治療。先向細胞培養(yǎng)液中加入濃度為1mmol/L的5-氨基酮戊酸（5-ALA）。5-ALA本身無光敏活性，進入細胞后，在細胞內(nèi)一系列酶的作用下，轉(zhuǎn)化為具有光敏活性的原卟啉IX（PpIX）。加入5-ALA后，將細胞置于37℃的培養(yǎng)箱中避光孵育4小時，使5-ALA充分轉(zhuǎn)化為PpIX，并在細胞內(nèi)積累到一定濃度。孵育結(jié)束后，棄去含有5-ALA的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，以去除未被細胞攝取的5-ALA。然后向細胞孔中加入新鮮的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于光動力治療儀中，用波長為630nm的激光照射細胞。激光強度設(shè)置為5J/cm2，照射時間為15分鐘。在照射過程中，確保激光均勻地照射到每一個細胞孔，避免出現(xiàn)照射不均的情況。在光動力治療過程中，處于激發(fā)態(tài)的原卟啉IX會與周圍的氧分子發(fā)生作用，產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)。單線態(tài)氧具有強氧化活性，能夠氧化生物大分子，如細胞膜中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)的核酸等。當(dāng)單線態(tài)氧作用于癌細胞時，會破壞癌細胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)物質(zhì)外流；損傷細胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，影響細胞的能量代謝和物質(zhì)合成；還會對癌細胞的DNA和RNA造成損傷，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基損傷，影響基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，最終誘導(dǎo)癌細胞凋亡或壞死。在聯(lián)合治療組中，光動力治療與化療藥物的作用相互協(xié)同，化療藥物可能會改變癌細胞的微環(huán)境，使癌細胞對光動力治療更加敏感，從而增強聯(lián)合治療對癌細胞的殺傷效果。3.2.4檢測指標(biāo)與方法MTT法檢測細胞增殖抑制率：在藥物及光動力處理后的24h、48h、72h，向每孔細胞中加入20μLMTT溶液（5mg/mL）。繼續(xù)將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4小時。此時，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍紫色甲瓚結(jié)晶，而死細胞則無法進行此反應(yīng)。孵育結(jié)束后，小心吸出上清液，避免吸出甲瓚結(jié)晶。向每孔中加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式：細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%，計算不同處理組在不同時間點的細胞增殖抑制率。通過比較各處理組的細胞增殖抑制率，分析化療藥物、光動力療法單獨及聯(lián)合使用對Hela細胞增殖的抑制作用。流式細胞儀檢測細胞凋亡：在各處理組細胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，收集細胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。然后加入適量的BindingBuffer重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液于流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15-20分鐘。AnnexinV-FITC能夠與凋亡早期細胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，而PI則能夠與壞死或晚期凋亡細胞的核酸結(jié)合。孵育結(jié)束后，向流式管中加入400μLBindingBuffer，輕輕混勻。立即使用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)光波長為488nm。通過檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光信號，分析細胞凋亡情況，計算早期凋亡率和晚期凋亡率。比較不同處理組的細胞凋亡率，探究化療藥物聯(lián)合光動力療法對Hela細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。免疫細胞化學(xué)法檢測HO-1表達：將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后進行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，以保持細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。然后用0.3%TritonX-100通透細胞膜10-15分鐘，使抗體能夠進入細胞內(nèi)與抗原結(jié)合。用5%BSA封閉非特異性位點1-2小時，減少非特異性染色。加入一抗（抗HO-1抗體，稀釋比例為1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細胞3次，每次5-10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，稀釋比例為1:500），室溫孵育1-2小時。用PBS洗滌細胞3次后，進行DAB顯色。DAB在HRP的催化下會產(chǎn)生棕色沉淀，從而使表達HO-1的細胞呈現(xiàn)棕色。蘇木精復(fù)染細胞核，使細胞核呈現(xiàn)藍色。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。根據(jù)陽性染色的深淺和范圍判斷HO-1的表達水平，分析化療藥物聯(lián)合光動力療法對HO-1表達的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測相關(guān)蛋白表達：提取各組細胞的總蛋白，將細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次后，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。期間輕輕晃動離心管，使裂解液與細胞充分接觸。然后在4℃、12000g的條件下離心15分鐘，取上清液即為細胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)印1-2小時。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。加入一抗（抗HO-1抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，稀釋比例為1:5000），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次后，用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色。在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，比較不同組之間蛋白表達的差異，深入探究化療藥物聯(lián)合光動力療法對相關(guān)蛋白表達的影響。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達：用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，按照Trizol試劑說明書操作。將細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次后，加入1mLTrizol試劑，充分裂解細胞。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后在4℃、12000g的條件下離心15分鐘，取上層水相至新的離心管中。加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。再次在4℃、12000g的條件下離心10分鐘，棄上清液。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次在4℃、7500g的條件下離心5分鐘。棄上清液，室溫晾干RNA沉淀，然后加入適量的DEPC水溶解RNA。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合要求。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計特異性引物，進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30-60秒，然后95℃變性5-10秒，60℃退火30-40秒，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^(-△△Ct)法計算目的基因的相對表達量。通過比較不同處理組目的基因的相對表達量，從基因水平分析化療藥物聯(lián)合光動力療法對相關(guān)基因表達的影響。四、實驗結(jié)果4.1化療藥物聯(lián)合光動力療法對Hela細胞增殖抑制的影響采用MTT法對不同處理組的Hela細胞增殖抑制情況進行檢測，結(jié)果如圖2所示。在24小時時，單純光動力治療組（PDT組）的細胞增殖抑制率為（25.36±3.12）%，順鉑組（DDP組）為（32.58±4.05）%，拓撲替康組（TPT組）為（30.24±3.56）%。順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT組）的抑制率達到（45.67±5.23）%，拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT組）為（43.89±4.87）%，順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT組）的抑制率最高，為（56.78±6.02）%。經(jīng)單因素方差分析，各處理組與空白對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；聯(lián)合治療組與單純光動力治療組、化療藥物組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。[此處插入圖2，圖中橫坐標(biāo)為不同處理組，縱坐標(biāo)為細胞增殖抑制率，用柱狀圖清晰展示各處理組在24h、48h、72h的細胞增殖抑制率情況]在48小時時，PDT組的細胞增殖抑制率上升至（35.67±4.23）%，DDP組為（45.68±5.12）%，TPT組為（42.35±4.56）%。DDP-PDT組的抑制率達到（58.90±6.54）%，TPT-PDT組為（56.78±6.12）%，DDP-TPT-PDT組的抑制率進一步升高至（70.23±7.56）%。各處理組之間的差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。72小時時，PDT組的細胞增殖抑制率為（45.23±5.01）%，DDP組為（58.79±6.34）%，TPT組為（55.46±5.89）%。DDP-PDT組的抑制率達到（70.12±7.89）%，TPT-PDT組為（68.56±7.23）%，DDP-TPT-PDT組的抑制率高達（82.34±8.56）%。從時間進程來看，隨著時間的延長，各處理組的細胞增殖抑制率均呈現(xiàn)上升趨勢。聯(lián)合治療組的抑制率上升幅度更為明顯，且在各個時間點，聯(lián)合治療組的細胞增殖抑制率均顯著高于單純光動力治療組和化療藥物組。這表明化療藥物與光動力療法聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增強對Hela細胞的增殖抑制作用，且順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療的效果最為顯著，可能存在協(xié)同增效作用。4.2對Hela細胞凋亡的影響采用流式細胞儀對各組Hela細胞凋亡情況進行檢測，結(jié)果如圖3所示。空白對照組的細胞凋亡率僅為（3.56±0.56）%，處于較低水平，表明正常培養(yǎng)條件下Hela細胞凋亡較少。單純光動力治療組（PDT組）的細胞凋亡率為（18.67±2.12）%，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明光動力療法能夠誘導(dǎo)Hela細胞發(fā)生凋亡。順鉑組（DDP組）的細胞凋亡率為（25.45±3.01）%，拓撲替康組（TPT組）的細胞凋亡率為（23.78±2.89）%，這兩組與PDT組相比，細胞凋亡率有所升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出化療藥物順鉑和拓撲替康對Hela細胞凋亡有一定的誘導(dǎo)作用。[此處插入圖3，圖中展示了空白對照組、PDT組、DDP組、TPT組、DDP-PDT組、TPT-PDT組、DDP-TPT-PDT組的細胞凋亡散點圖，橫坐標(biāo)為PI熒光強度，縱坐標(biāo)為AnnexinV-FITC熒光強度，不同象限表示不同凋亡狀態(tài)的細胞]順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT組）的細胞凋亡率顯著提高至（38.56±4.23）%，拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT組）的細胞凋亡率為（36.78±3.98）%，這兩組與單純光動力治療組、化療藥物組相比，細胞凋亡率均有顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT組）的細胞凋亡率高達（50.23±5.56）%，為所有處理組中最高，與其他聯(lián)合治療組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。從早期凋亡率和晚期凋亡率的分析來看，聯(lián)合治療組的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于單純光動力治療組和化療藥物組。以DDP-TPT-PDT組為例，早期凋亡率達到（32.56±3.89）%，晚期凋亡率為（17.67±2.34）%。這表明化療藥物聯(lián)合光動力療法能夠顯著誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，且聯(lián)合治療的效果優(yōu)于單一治療，其中順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療對誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的效果最為顯著，可能是通過多種途徑協(xié)同作用，促進細胞凋亡相關(guān)信號通路的激活，從而增強了對Hela細胞的殺傷作用。4.3對Hela細胞內(nèi)HO-1表達的影響采用免疫細胞化學(xué)法檢測各組Hela細胞內(nèi)HO-1的表達，結(jié)果如圖4所示?？瞻讓φ战M中，Hela細胞內(nèi)HO-1呈現(xiàn)較高水平的表達，細胞胞質(zhì)中可見明顯的棕色陽性染色，表明在正常生長狀態(tài)下，HO-1在Hela細胞中發(fā)揮著一定的生理作用。[此處插入圖4，圖中展示了空白對照組、PDT組、DDP-PDT組、TPT-PDT組、DDP-TPT-PDT組Hela細胞免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果，HO-1陽性染色為棕色，細胞核為藍色]單純光動力治療組（PDT組）中，HO-1的表達有所下降，細胞胞質(zhì)中的棕色陽性染色變淺，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明光動力療法能夠抑制Hela細胞內(nèi)HO-1的表達。順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT組）和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT組）中，HO-1的表達進一步降低，陽性染色更為淺淡。DDP-PDT組與PDT組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；TPT-PDT組與PDT組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明化療藥物與光動力療法聯(lián)合應(yīng)用能夠更顯著地抑制HO-1的表達。順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT組）中，HO-1的表達受到最為顯著的抑制，細胞胞質(zhì)中幾乎未見明顯的棕色陽性染色。與其他聯(lián)合治療組相比，DDP-TPT-PDT組中HO-1表達的降低程度更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明順鉑、拓撲替康與光動力療法三者聯(lián)合對Hela細胞內(nèi)HO-1表達的抑制作用最強，可能通過抑制HO-1的表達，阻斷其抗凋亡等相關(guān)信號通路，從而增強對Hela細胞的殺傷作用。綜合以上結(jié)果，化療藥物聯(lián)合光動力療法能夠顯著抑制Hela細胞內(nèi)HO-1的表達，且聯(lián)合治療的抑制效果優(yōu)于單一治療，其中順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療的抑制作用最為顯著。五、結(jié)果討論5.1化療藥物聯(lián)合光動力療法對Hela細胞殺傷作用的協(xié)同效應(yīng)分析本研究結(jié)果顯示，化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，這一結(jié)論在細胞增殖和凋亡的實驗數(shù)據(jù)中得到了充分驗證。從細胞增殖角度來看，在各個檢測時間點，聯(lián)合治療組的細胞增殖抑制率均顯著高于單純光動力治療組和化療藥物組。在24小時時，順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT組）的抑制率達到（45.67±5.23）%，拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT組）為（43.89±4.87）%，順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT組）的抑制率最高，為（56.78±6.02）%，而單純光動力治療組（PDT組）的細胞增殖抑制率僅為（25.36±3.12）%，順鉑組（DDP組）為（32.58±4.05）%，拓撲替康組（TPT組）為（30.24±3.56）%。隨著時間的推移，這種差異愈發(fā)明顯，72小時時，DDP-TPT-PDT組的抑制率高達（82.34±8.56）%，遠高于其他組。這表明化療藥物與光動力療法聯(lián)合使用，能夠更有效地抑制Hela細胞的增殖，且不同化療藥物與光動力療法的聯(lián)合組合均表現(xiàn)出較強的協(xié)同作用，其中順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療的協(xié)同效果最為突出。這種協(xié)同效應(yīng)可能是由于化療藥物和順鉑、拓撲替康等改變了癌細胞的生理狀態(tài)，使細胞對光動力治療更加敏感。例如，化療藥物可能破壞了癌細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)，增加了細胞膜的通透性，使更多的光敏劑5-ALA進入細胞內(nèi)，從而增強了光動力治療的效果；或者化療藥物通過抑制癌細胞的增殖，使細胞處于相對靜止的狀態(tài)，此時進行光動力治療，可能會提高癌細胞對光動力的敏感性，增強聯(lián)合治療的協(xié)同作用。在細胞凋亡方面，聯(lián)合治療組同樣展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，空白對照組的細胞凋亡率僅為（3.56±0.56）%，單純光動力治療組（PDT組）的細胞凋亡率為（18.67±2.12）%，順鉑組（DDP組）為（25.45±3.01）%，拓撲替康組（TPT組）為（23.78±2.89）%。而順鉑聯(lián)合光動力治療組（DDP-PDT組）的細胞凋亡率顯著提高至（38.56±4.23）%，拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（TPT-PDT組）的細胞凋亡率為（36.78±3.98）%，順鉑和拓撲替康聯(lián)合光動力治療組（DDP-TPT-PDT組）的細胞凋亡率高達（50.23±5.56）%，為所有處理組中最高。這說明化療藥物聯(lián)合光動力療法能夠顯著誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，且聯(lián)合治療的效果優(yōu)于單一治療。聯(lián)合治療可能通過多種途徑協(xié)同作用，促進細胞凋亡相關(guān)信號通路的激活。比如，化療藥物可能激活了細胞內(nèi)的某些凋亡相關(guān)蛋白，如Caspase家族蛋白，而光動力療法產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)進一步增強了這種激活作用，從而導(dǎo)致更多的癌細胞發(fā)生凋亡。此外，聯(lián)合治療還可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達，如上調(diào)促凋亡基因Bax的表達，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達，來促進癌細胞凋亡。綜上所述，化療藥物聯(lián)合光動力療法在抑制Hela細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡方面均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，能夠更有效地殺傷Hela細胞，為宮頸癌的臨床治療提供了新的策略和思路。5.2作用機制探討5.2.1細胞凋亡途徑的激活細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細胞死亡過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究中，化療藥物聯(lián)合光動力療法對人宮頸癌Hela細胞殺傷作用的增強，很可能與細胞凋亡途徑的激活密切相關(guān)，主要涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。在線粒體途徑中，化療藥物順鉑和拓撲替康以及光動力療法產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，都可以對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。順鉑能夠與線粒體膜上的某些蛋白結(jié)合，改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。拓撲替康則可以通過抑制拓撲異構(gòu)酶I的活性，間接影響線粒體的代謝過程。光動力療法產(chǎn)生的單線態(tài)氧能夠氧化線粒體膜上的脂質(zhì)，破壞線粒體膜的完整性。這些作用使得線粒體釋放出細胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細胞色素C釋放到細胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活Caspase-9前體，使其裂解為具有活性的Caspase-9?；罨腃aspase-9進一步激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。在本實驗中，蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組中Caspase-9和Caspase-3的表達水平明顯升高，表明線粒體途徑在聯(lián)合治療誘導(dǎo)的細胞凋亡中被激活。死亡受體途徑也是細胞凋亡的重要途徑之一。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）及其受體在死亡受體途徑中起著關(guān)鍵作用?；熕幬锖凸鈩恿Ο煼赡芡ㄟ^上調(diào)TRAIL及其受體的表達，激活死亡受體途徑。順鉑和拓撲替康可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，使細胞表面的TRAIL受體表達增加。光動力療法產(chǎn)生的氧化應(yīng)激也能夠刺激細胞，促使TRAIL及其受體的表達上調(diào)。當(dāng)TRAIL與細胞表面的死亡受體結(jié)合后，受體發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白FADD和Caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8前體被激活，裂解為具有活性的Caspase-8。活化的Caspase-8可以直接激活下游的Caspase-3，也可以通過切割Bid蛋白，使Bid的羧基末端片段（tBid）進入線粒體，進一步激活線粒體途徑，形成死亡受體途徑和線粒體途徑之間的交聯(lián)，放大細胞凋亡信號。雖然本研究中未直接檢測TRAIL及其受體的表達，但聯(lián)合治療組中Caspase-8的表達水平有所升高，提示死亡受體途徑可能也參與了聯(lián)合治療誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。綜上所述，化療藥物聯(lián)合光動力療法可能通過激活線粒體途徑和死亡受體途徑，協(xié)同誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細胞凋亡，從而增強對癌細胞的殺傷作用。這為進一步理解聯(lián)合治療的作用機制提供了重要線索，也為宮頸癌的治療提供了新的靶點和思路。5.2.2HO-1表達變化的意義血紅素氧合酶-1（HO-1）是生物體內(nèi)催化血紅素分解的限速酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物聯(lián)合光動力療法能夠顯著抑制人宮頸癌Hela細胞內(nèi)HO-1的表達，這種表達變化具有重要的生物學(xué)意義。HO-1的表達與細胞凋亡密切相關(guān)。研究表明，HO-1具有抗凋亡的功能。在腫瘤細胞中，HO-1可以通過多種機制抑制細胞凋亡。一方面，HO-1的催化產(chǎn)物一氧化碳（CO）具有抗炎和抗凋亡作用。CO能夠抑制細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少活性氧的產(chǎn)生，從而減輕氧化損傷對細胞的破壞。CO還可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，抑制凋亡相關(guān)蛋白的激活，如抑制Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白的活性，從而阻止細胞凋亡的發(fā)生。另一方面，HO-1催化產(chǎn)生的膽綠素在膽綠素還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素是一種強抗氧化劑，能夠清除細胞內(nèi)的自由基，保護細胞免受氧化損傷，進而抑制細胞凋亡。在本研究中，聯(lián)合治療組中HO-1表達的顯著降低，可能導(dǎo)致其抗凋亡作用減弱，使得細胞更容易受到化療藥物和光動力療法的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組中促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低，這與HO-1表達降低導(dǎo)致細胞凋亡增加的現(xiàn)象相吻合。HO-1的表達還與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)。腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是臨床治療中的一大難題。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1在耐藥腫瘤細胞中的表達往往較高。HO-1可以通過多種途徑參與腫瘤細胞的耐藥機制。例如，HO-1能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）等。P-gp是一種ATP依賴性的藥物外排泵，能夠?qū)⑦M入細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。HO-1可以上調(diào)P-gp的表達，增強腫瘤細胞的藥物外