附件6口腔黏膜刺激試驗(yàn)方法Oralmucousirritationtest1范圍本方法適用于評(píng)價(jià)牙膏對(duì)口腔黏膜組織潛在的刺激作用。2試驗(yàn)?zāi)康拇_定和評(píng)價(jià)牙膏對(duì)動(dòng)物口腔黏膜組織是否有刺激作用及其程度。3定義口腔黏膜刺激oralmucosairritation口腔黏膜組織接觸受試物后所產(chǎn)生的水腫、炎性變化及組織損傷等反應(yīng)。4試驗(yàn)的基本原則將受試物置于受試動(dòng)物的一側(cè)頰囊內(nèi)，對(duì)照物置于另一側(cè)頰囊內(nèi)，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)多次接觸，肉眼觀察并記錄動(dòng)物頰囊接觸部位的刺激程度，并于末次接觸后24小時(shí)取材進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。5試驗(yàn)方法5.1試樣5.1.1受試物：受試物直接使用，單次放置量為0.4g或0.4mL。5.1.2對(duì)照物：0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），用量同受試物，直接使用。5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境5.2.1健康的SPF級(jí)金黃地鼠（拉丁學(xué)名：Mesocricetusauratus），6~8周齡。同一品系，雌雄不限，雌性動(dòng)物應(yīng)未孕。5.2.2至少使用3只動(dòng)物。5.2.3試驗(yàn)前動(dòng)物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境內(nèi)至少適應(yīng)3天。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國家相關(guān)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.3試驗(yàn)步驟5.3.1動(dòng)物準(zhǔn)備與麻醉用適當(dāng)?shù)穆樽韯┞樽韯?dòng)物，檢查動(dòng)物雙側(cè)頰囊有無異常（剔除頰囊黏膜異常的動(dòng)物）。翻轉(zhuǎn)動(dòng)物頰囊用生理鹽水或蒸餾水清洗干凈后進(jìn)行試驗(yàn)。5.3.2試樣接觸5.3.2.1將受試物置于動(dòng)物一側(cè)頰囊底部，對(duì)照物置于另一側(cè)頰囊底部。試樣與黏膜接觸5min，接觸時(shí)間結(jié)束后將頰囊翻出，去除試樣，用生理鹽水或蒸餾水清洗接觸部位，清洗時(shí)間一般為1min~2min，直至將試樣完全清除。重復(fù)上述操作4次，每次操作間隔1h（含接觸與清洗時(shí)間）。每次重復(fù)放置試樣前肉眼檢查頰囊，并記錄異常情況。末次接觸后的24h肉眼觀察頰囊并取與試樣接觸的頰囊組織進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。5.3.2.2在5.3.2.1試驗(yàn)過程中，根據(jù)表1判定肉眼觀察結(jié)果。在試驗(yàn)周期內(nèi)的任意時(shí)間點(diǎn)，3只動(dòng)物中如有1只及以上出現(xiàn)重度水腫、紅斑、糜爛或潰瘍現(xiàn)象，可直接判定為重度口腔黏膜刺激反應(yīng)，無需再進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。5.4結(jié)果觀察5.4.1臨床觀察5.4.1.1試驗(yàn)期間觀察動(dòng)物，記錄異常表現(xiàn)，包括局部、全身及異常行為等。5.4.1.2肉眼觀察試驗(yàn)部位，根據(jù)表1判定有無紅斑、水腫、糜爛及潰瘍等情況，并比較同一動(dòng)物的試驗(yàn)側(cè)頰囊和對(duì)照側(cè)頰囊，記錄每側(cè)頰囊的狀況，注意試驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的差異。表1口腔黏膜臨床觀察評(píng)價(jià)表臨床表現(xiàn)反應(yīng)程度紅斑無紅斑無極輕微紅斑（勉強(qiáng)可見）極輕清晰紅斑輕度中度紅斑中度重度紅斑（紫紅色）至焦痂形成、糜爛、潰瘍重度水腫無水腫無極輕微水腫（勉強(qiáng)可見）極輕清晰水腫（腫起邊緣清晰）輕度中度水腫（腫起約1mm）中度重度水腫（腫起超過1mm，并超出接觸區(qū)）重度5.4.2組織學(xué)觀察5.4.2.1組織切片制作末次接觸后24h，取試樣接觸部位的頰囊，10%中性福爾馬林緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，半連續(xù)切片，間隔取片5張，H-E染色。5.4.2.2組織學(xué)觀察及記分對(duì)黏膜組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，并根據(jù)口腔黏膜組織反應(yīng)記分表（表2）計(jì)算每只動(dòng)物得分。其中白細(xì)胞浸潤情況應(yīng)至少在20倍物鏡下選取3~5個(gè)有代表性的視野觀察，每只動(dòng)物的得分為所有觀察視野的平均分。將試驗(yàn)組中所有動(dòng)物的組織反應(yīng)記分相加之和，再除以試驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)，得出試驗(yàn)組平均記分，對(duì)照組同法計(jì)算。表2口腔黏膜組織反應(yīng)記分表組織反應(yīng)記分上皮正常，完好無損0細(xì)胞變性或變扁平1組織變形2局部糜爛3廣泛糜爛4白細(xì)胞浸潤無0極少（少于25）1輕度（26～50）2中度（51～100）3重度（大于100)4血管充血無0極少1輕度2中度3重度伴血管破裂4水腫無0極少1輕度2中度3重度46結(jié)果評(píng)價(jià)6.1臨床觀察評(píng)價(jià)在試驗(yàn)周期內(nèi)的任意時(shí)間點(diǎn)，3只動(dòng)物中如有1只及以上出現(xiàn)重度紅斑、水腫、糜爛或潰瘍現(xiàn)象，則可直接判定該受試物為重度口腔黏膜刺激反應(yīng)，其它情況以下述組織學(xué)評(píng)價(jià)為準(zhǔn)。6.2組織學(xué)評(píng)價(jià)6.2.1若1只動(dòng)物對(duì)照側(cè)頰囊組織學(xué)評(píng)價(jià)記分之和大于9時(shí)，則考慮認(rèn)為是試驗(yàn)操作時(shí)造成的損傷，有必要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。6.2.2試驗(yàn)組平均記分減去對(duì)照組平均記分得出刺激指數(shù)，并根據(jù)表3對(duì)口腔黏膜組織反應(yīng)程度進(jìn)行分級(jí)。表3口腔黏膜組織反應(yīng)分級(jí)刺激指數(shù)（X）反應(yīng)程度0無0＜X≤4極輕4＜X≤8輕度8＜X≤11中度11＜X≤16重度7結(jié)果判定根據(jù)臨床觀察評(píng)價(jià)進(jìn)行結(jié)果判定，臨床觀察為重度口腔黏膜刺激反應(yīng)是不可接受的（見6.1）；依據(jù)6.2.2口腔黏膜組織反應(yīng)分級(jí)，認(rèn)為中度、重度口腔黏膜刺激反應(yīng)是不可