附件4皮膚吸收體外試驗(yàn)方法SkinAbsorption:InvitroMethod1范圍本方法規(guī)定了皮膚吸收體外試驗(yàn)的基本要求和方法。本方法適用于單一成分的化妝品用化學(xué)原料。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料在離體皮膚中的經(jīng)皮吸收率。3定義3.1受試物testsubstances被測(cè)試的化妝品原料，為單一化學(xué)物質(zhì)。3.2吸收量absorbeddose在一定時(shí)間內(nèi)透過(guò)皮膚的受試物的量。4試驗(yàn)原理在特定條件下，將受試物（可以是放射標(biāo)記物）暴露于擴(kuò)散池中的皮膚表面一定時(shí)間后，采用適當(dāng)?shù)那逑闯绦蚝头椒ǔテつw表面的受試物。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)采集接收液，采用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定受試物或其代謝產(chǎn)物。當(dāng)受試物具有代謝活性時(shí)，可以分析受試物的代謝活性產(chǎn)物，試驗(yàn)結(jié)束后，采用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定受試物及其代謝產(chǎn)物的分布情況。在本方法所描述的條件下，收集接收液和試驗(yàn)皮膚中的所有受試物，監(jiān)測(cè)給定時(shí)間內(nèi)受試物的吸收情況（一般試驗(yàn)周期為24h）。應(yīng)同時(shí)測(cè)定皮膚表面清洗液中的受試物、留在皮膚里的受試物、接收室中接收液里的受試物，得到受試物在各接收液里的分布和總體回收率。殘留在皮膚角質(zhì)層中的受試物可能會(huì)被吸收，參考本方法6數(shù)據(jù)處理和計(jì)算部分判定角質(zhì)層的殘留量是否計(jì)入皮膚吸收率。5試驗(yàn)方法5.1擴(kuò)散池?cái)U(kuò)散池由供給室和接收室組成（示例圖見(jiàn)圖1），離體皮膚放置于兩者之間。擴(kuò)散池的供給室和接收室之間應(yīng)有良好的密封性，能較好控制擴(kuò)散池及其內(nèi)容物的溫度，并保證與皮膚接觸的接收液混合良好和取樣方便（靜態(tài)式或流通池式擴(kuò)散池均可使用）。正常情況下，供給室在暴露于有限劑量受試物過(guò)程中保持開(kāi)放，但在無(wú)限劑量和部分有限劑量的情況下，供給室可以封閉。圖1一種用于皮膚吸收體外試驗(yàn)的直立式擴(kuò)散池示例圖5.2接收液接收液應(yīng)優(yōu)先選擇有益于生理的溶液，需提供接收液的精確組分，并證實(shí)受試物在接收液中能充分溶解，不影響皮膚吸收和完整性。在循環(huán)流動(dòng)系統(tǒng)中，流速不能妨礙受試物擴(kuò)散進(jìn)入接收液。在靜態(tài)滲透式系統(tǒng)中，接收液應(yīng)連續(xù)攪拌。如果研究受試物在皮膚中的代謝效應(yīng)，接收液必須能維持整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中皮膚的代謝活性。5.3皮膚制備皮膚來(lái)源為動(dòng)物，首選小型豬。須符合我國(guó)相關(guān)倫理要求，首選活性皮膚，也可以使用非活性皮膚，應(yīng)證明皮膚的完整性。采用表皮層（酶、熱或化學(xué)分離的）或用植皮刀分離的皮膚均可以使用。應(yīng)避免使用太厚的皮膚，除非特殊受試物需使用全層皮膚測(cè)試。同時(shí)還應(yīng)明確皮膚種類(lèi)、解剖位置以及制備技術(shù)。5.4皮膚完整性應(yīng)正確制備和儲(chǔ)存離體皮膚，使用前檢查皮膚及其屏障的完整性。研究受試物在皮膚的代謝作用時(shí)，應(yīng)使用新鮮皮膚，并確保其在試驗(yàn)過(guò)程中的代謝活性。一般新鮮的離體皮膚應(yīng)在24h內(nèi)使用，也可證明在合理可行的情況下，根據(jù)代謝酶系統(tǒng)和貯藏溫度的不同而做適當(dāng)調(diào)整，但在使用前應(yīng)測(cè)試和證明其屏障功能的完整性。5.5受試物制備受試物可以采用放射性標(biāo)記或使用其他定量方法。受試樣品的制備盡可能與實(shí)際使用的狀態(tài)保持一致，偏離使用情況的制備應(yīng)做合理說(shuō)明。受試物每個(gè)濃度要設(shè)置3個(gè)平行皮膚（皮膚來(lái)自同一個(gè)體），至少進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)（皮膚來(lái)自不同個(gè)體）。5.6受試物濃度和組成通常將受試物配制成系列濃度，其濃度范圍應(yīng)覆蓋人體實(shí)際接觸的可能暴露范圍。受試物配制過(guò)程中需確保其穩(wěn)定性和均一性，對(duì)于固體、半固體制劑和混懸液，需驗(yàn)證受試物在溶媒中的均勻性。5.7皮膚暴露根據(jù)人體可能接觸受試物的情況，常選擇有限劑量暴露。劑量應(yīng)模仿人體暴露量，通常固體受試物為2~5mg/cm2，液體受試物最高為10μL/cm2。實(shí)際劑量可根據(jù)預(yù)期的上樣條件、研究目標(biāo)或受試物的物理特性進(jìn)行調(diào)整。如皮膚用量為無(wú)限劑量時(shí)，單位面積的劑量可以加大。5.8溫度受試物皮膚吸收一般屬于被動(dòng)吸收，受溫度的影響較大，因此試驗(yàn)時(shí)擴(kuò)散池和皮膚應(yīng)保持恒定接近于皮膚正常溫度32±1℃。不同的擴(kuò)散池可根據(jù)自身情況調(diào)整水浴或干加熱參數(shù)到一定溫度，以確保離體皮膚溫度在其正常生理標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度保持在30~70%之間。5.9暴露時(shí)間和取樣一般情況下接收液的采樣點(diǎn)應(yīng)滿(mǎn)足能夠以作圖形式表現(xiàn)受試物的透皮吸收情況。根據(jù)受試物理化性質(zhì)結(jié)合預(yù)試驗(yàn)確定合適的采樣頻率，試驗(yàn)周期內(nèi)通常需要6~12個(gè)采樣點(diǎn)。5.10樣品分析對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)的所有組成部分均應(yīng)進(jìn)行分析測(cè)定，以確定回收率。其中包括供給室、皮膚表面、皮膚中、接收液/池中的所有受試物。試驗(yàn)應(yīng)得到足夠的回收率，放射性標(biāo)記試驗(yàn)的回收率應(yīng)為100±10%，其他定量方法建議回收率應(yīng)為100±15%，若偏離應(yīng)合理解釋?zhuān)匾獣r(shí)重新進(jìn)行試驗(yàn)。6數(shù)據(jù)處理和計(jì)算應(yīng)列出接收液的分析結(jié)果，不同時(shí)間內(nèi)受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的分布和吸收情況。對(duì)于有限暴露劑量，應(yīng)計(jì)算皮膚洗液中受試物的量、與皮膚結(jié)合的數(shù)量（分析不同皮膚層）以及接收液中受試物的量。經(jīng)皮吸收試驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)只能用接收液的數(shù)據(jù)表示，對(duì)于受試物在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍殘留于皮膚內(nèi)的情況，總的吸收量要考慮是否扣除角質(zhì)層含量，并結(jié)合化合物作用位置和透過(guò)特性給出合理解釋。無(wú)限劑量暴露試驗(yàn)時(shí)不做吸收百分比的計(jì)算?；厥章视?jì)算公式：回收率=注：*代表皮膚中的量包含角質(zhì)層、活性表皮層和真皮層的總和皮膚吸收率計(jì)算公式：皮膚吸收率=注：#是否去除角質(zhì)層應(yīng)給予合理說(shuō)明

附錄皮膚吸收體外試驗(yàn)方法應(yīng)用示例（咖啡因）1試驗(yàn)?zāi)康谋敬卧囼?yàn)根據(jù)《皮膚吸收體外試驗(yàn)方法》文件中的基本原則，參考相關(guān)文獻(xiàn)中具體方法，研究咖啡因在離體豬皮膚的吸收特性，定量分析咖啡因的透皮吸收率。本試驗(yàn)是以水溶性成分咖啡因?yàn)檠芯繉?duì)象獲得其皮膚透過(guò)率，因角質(zhì)層中咖啡因含量較少，故在計(jì)算皮膚吸收率時(shí)未計(jì)入皮膚吸收量中。條件不同數(shù)據(jù)會(huì)產(chǎn)生變化，本示例中的所有設(shè)備參數(shù)僅供參考。2受試物和皮膚類(lèi)型試驗(yàn)使用咖啡因（MW=194.2Dal，LogPo/w=-0.07，水中溶解度=21.6mg/mL25℃）作為受試物。皮膚模型：3月齡巴馬小型豬背部或腹部皮膚。貯藏條件：制備后-20℃凍存，10天內(nèi)用完，凍融不超過(guò)2次。3試劑和設(shè)備耗材3.1試劑生理鹽水、甲醇（色譜級(jí)）、磷酸（色譜級(jí)）。3.2設(shè)備透皮吸收擴(kuò)散儀（配備適宜的池體，能保證受試物于接收液中均勻擴(kuò)散）、超高效液相色譜儀、經(jīng)皮水分流失測(cè)定儀、渦旋混勻器、離心機(jī)。3.3耗材色譜柱、離心管、2mL進(jìn)樣瓶、移液器、槍頭、0.22μm尼龍濾膜、皮膚膠帶、刀片、取皮刀、外科剪刀、1mL注射器、吸水紙、棉簽、離體豬皮。4試驗(yàn)方法4.1受試物制備經(jīng)預(yù)試驗(yàn)研究確定，配制0.1%、0.3%、1.0%三種濃度咖啡因溶液。取樣該溶液，經(jīng)前處理、稀釋等步驟，用液相檢測(cè)并計(jì)算溶液中咖啡因?qū)嶋H含量，用以計(jì)算實(shí)際加樣量。將配好的咖啡因溶液在試驗(yàn)條件下放置24h取樣，檢測(cè)咖啡因含量有無(wú)變化。4.2接收液保證其滿(mǎn)足漏槽條件，即接收液的體積至少是咖啡因達(dá)到飽和溶解時(shí)所需介質(zhì)體積的3~10倍。配制好的接收液pH值應(yīng)保持在pH6.5~7.5范圍內(nèi)。根據(jù)溶液中咖啡因濃度和加樣體積估算不同時(shí)間點(diǎn)的可能最高和最低濃度設(shè)計(jì)濃度曲線，于0.5h、1h、2h、4h、8h、24h取樣，測(cè)定咖啡因在接收液中的穩(wěn)定性。4.3離體豬皮的制備離體豬皮采自豬背或腹側(cè)皮膚，符合相關(guān)動(dòng)物倫理要求，保證豬皮角質(zhì)屏障的完整性（如不可采用熱水淋洗或刮毛，以確保皮膚角質(zhì)層完整性等）。用吸水紙吸干皮膚表面生理鹽水，制成肉眼觀察未受損傷、面積大小合適的皮膚備用。本試驗(yàn)中同一濃度受試物設(shè)置3個(gè)平行皮膚（皮膚來(lái)自同一個(gè)體）重復(fù)4次（皮膚來(lái)自不同個(gè)體）。4.4皮膚完整性檢查使用經(jīng)皮水分流失儀測(cè)定豬皮角質(zhì)層經(jīng)皮水分流失值（TEWL）<15g/m2/h的皮膚才可用于試驗(yàn)。加入受試物前調(diào)整溫度到32±1℃并保持穩(wěn)定，將皮膚固定在擴(kuò)散池的供給室和接收室之間，皮膚角質(zhì)層朝向供給室，真皮層一側(cè)朝向接收室，并通過(guò)補(bǔ)液管向接收室中加入接收液，去除接收液與皮膚間的氣泡，確保豬皮與接收液完全接觸，開(kāi)啟磁力攪拌器，轉(zhuǎn)速設(shè)為600rpm，擴(kuò)散池體系在此狀態(tài)下平衡30~45min。5試驗(yàn)步驟5.1上樣向接收室中加入接收液。通過(guò)加樣管加入接收液并準(zhǔn)確記錄接收液體積。接收液注入接收室后，去除皮膚與接收液接觸面滯留的氣泡，確保皮膚與接收液完全接觸。該擴(kuò)散池體系在正常試驗(yàn)條件下平衡30~45min，驗(yàn)證皮膚完整性之后，方可加樣處理。向供給室中皮膚表面加入咖啡因測(cè)試溶液，并設(shè)置不含咖啡因的生理鹽水作為陰性對(duì)照。用移液器按照10μL/cm2的比例，將根據(jù)供給室內(nèi)徑面積計(jì)算所得體積的咖啡因溶液，均勻涂布于皮膚表面。試驗(yàn)期間保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境濕度為30~70%RH。設(shè)置磁力攪拌器以600rpm的速度攪拌，保持32±1℃恒溫水浴。5.2取樣分別于0.5h、1h、2h、4h、8h、24h時(shí)間點(diǎn)用注射器/自動(dòng)取樣裝置取樣，具體取樣體積可根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果自行確定。0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾后待測(cè)。供給室清洗：暴露結(jié)束后每次使用1mL生理鹽水清洗15次，將所有清洗液合并待測(cè)。皮膚表面殘留受試物清洗：皮膚暴露24h后每次使用3mL生理鹽水清洗3次，將所有清洗液合并震蕩，使用0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾后待測(cè)。角質(zhì)層：受試皮膚在干燥條件下，使用皮膚膠帶進(jìn)行角質(zhì)層取樣，重復(fù)20次。取樣后將所有20張膠帶置于50mL離心管中，加入20mL甲醇震蕩過(guò)夜提取、離心，提取液過(guò)濾后待測(cè)。除去角質(zhì)層后的皮膚：去除角質(zhì)層后的皮膚剪碎，加入10mL甲醇過(guò)夜提取，離心取上清液過(guò)濾后待測(cè)。5.3檢測(cè)儀器：超高效液相色譜儀（UPLC）色譜柱：C18反相色譜柱流動(dòng)相：A（0.1%磷酸水溶液）和B（0.1%磷酸甲醇溶液）A:B=9:1流速：0.25mL/min進(jìn)樣量：2μL柱溫：30℃時(shí)間：14min 檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm6數(shù)據(jù)分析6.1皮膚吸收率皮膚吸收率=其中Q