基因工程專題訓(xùn)練4——反向PCR與PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)1.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過程如下圖所示。(1)要擴(kuò)增未知序列，應(yīng)選擇哪兩種引物？______________________________________________________________________________________________________________________________(2)上述PCR產(chǎn)物是環(huán)狀DNA分子還是鏈狀DNA分子？_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(3)上述PCR過程中使用了哪些酶？____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________2.(2025·廣東江門期中)常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩引物間的DNA區(qū)段，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)。反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.酶切階段，L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列B.PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸C.圖中引物應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)D.PCR擴(kuò)增時(shí)，每輪循環(huán)前應(yīng)加入限制酶將環(huán)狀DNA切割成線狀3.在基因工程實(shí)踐中，常用重疊延伸PCR技術(shù)。(1)操作中哪些引物應(yīng)含有擬突變位點(diǎn)？______________________________________________________________________________________________________________________________(2)進(jìn)行PCR1和PCR2時(shí)，應(yīng)分別選擇哪些引物？______________________________________________________________________________________________________________________________(3)為獲得大量目的基因序列，進(jìn)行PCR3時(shí)應(yīng)選擇哪兩種引物？_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________4.瑞典科學(xué)家斯萬特·帕博憑借對(duì)已滅絕古人類基因組和人類進(jìn)化的發(fā)現(xiàn)榮獲2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。他在研究過程中使用了大引物PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變。基因定點(diǎn)突變的目的是通過定向改變基因內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基來改變多肽鏈上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過程如圖所示。(1)第一輪PCR所用的引物有哪些？____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(2)第二輪PCR所用的引物除了側(cè)翼引物外，還有大引物。該大引物是第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的①鏈還是②鏈？_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(3)與常規(guī)引物相比，大引物有何特點(diǎn)？______________________________________________________________________________________________________________________________5.(2025·廣東佛山質(zhì)檢)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)是一種基因工程技術(shù)，它可以通過人工合成的引物，使目標(biāo)DNA序列發(fā)生特定的突變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精確編輯。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)的過程如圖所示(圖中對(duì)應(yīng)的字母為引物，黑點(diǎn)為定點(diǎn)誘變的位點(diǎn))。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1B.獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且1次循環(huán)即得片段2C.圖中兩種引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)D.圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)6.(2024·長郡中學(xué)模擬)研究人員欲比較大腸桿菌YT1和芽孢桿菌YP1兩類細(xì)菌降解塑料中聚乙烯(PE)的能力，并通過基因工程拼接黃粉蟲腸道內(nèi)菌株WZ降解塑料中聚氯乙烯(PVC)的胞外酶基因A，培育降解塑料的“超級(jí)菌”。請(qǐng)回答下列問題：(1)菌株的篩選。配置固體培養(yǎng)基，接種菌株后表層覆蓋0.1mm厚度的PE塑料，分組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表所示：培養(yǎng)基及接種菌株培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2培養(yǎng)基3單獨(dú)培養(yǎng)并接種YT1單獨(dú)培養(yǎng)并接種YP1混合培養(yǎng)YT1和YP1后，選取YP1接種降解圈直徑R1/cm1.221.551.43菌落R2/cm0.350.550.43R1/R23.52.83.3從功能上講，該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。培養(yǎng)基3中接種混合培養(yǎng)后的YP1，與單獨(dú)培養(yǎng)并接種YP1比較，降解PE的能力________，其原因可能是_______________________________________________________________。(2)培育“超級(jí)菌”。對(duì)菌株WZ的A基因測(cè)序可知，如果在其調(diào)節(jié)功能區(qū)增加一個(gè)堿基對(duì)A/T，則可以大大增強(qiáng)其基因表達(dá)能力。通過經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)在體外改造A基因，操作過程如圖1。改造A基因與圖2所示的質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，培育“超級(jí)菌”。①通過PCR1構(gòu)建大引物：需要兩步，先后使用的引物分別是________。PCR中引物的作用是__________________________________________________________________________________________________________________。②通過PCR2獲得完整的改良的A基因。③構(gòu)建改良基因表達(dá)載體：為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒和改良基因的準(zhǔn)確連接，應(yīng)選用的限制酶是________。④將表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌株。⑤檢測(cè)和鑒定：在含氨芐青霉素和β－半乳糖苷的平板上培養(yǎng)一段時(shí)間后，其中含有重組質(zhì)粒，判斷的依據(jù)是___________________________________________________________________________________________________________。附加題7.(2024·黑吉遼卷，25)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T－DNA轉(zhuǎn)移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對(duì)密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲害能力，進(jìn)行如下操作。回答下列問題。注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是______________________________________________________________________________________________________________________________。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是______________________________________________________________________________________________________________________________。(2)本操作中獲取目的基因的方法是________和________。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是________________________，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用________基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是________和________。(6)本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是________(單選)。A.通過含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞B.將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)C.將1～1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白8.(2024·新課標(biāo)卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是_______________________________________________________________________________。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是__________________________________________________________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。參考答案1.(1)引物1和引物4。(2)鏈狀DNA分子。(3)限制酶、DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶。2.D3.(1)引物2和引物3。(2)進(jìn)行PCR1時(shí)需選擇引物1和引物2，進(jìn)行PCR2時(shí)需選擇引物3和引物4。(3)引物1和引物4。4.(1)誘變引物和側(cè)翼引物。(2)②鏈。(3)大引物特異性高。5.B6.(1)選擇增大/增強(qiáng)YP1和YT1混合培養(yǎng)過程中，YP1菌株整合了YT1的對(duì)PE塑料高分解力的基因，發(fā)生了轉(zhuǎn)化(2)①誘變引物和引物1使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸③X