低切應(yīng)力下血管內(nèi)皮屏障功能調(diào)控機(jī)制及SL提取物干預(yù)作用探究一、引言1.1研究背景血管系統(tǒng)作為人體的重要組成部分，承擔(dān)著運(yùn)輸血液、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵職責(zé)。血管內(nèi)皮細(xì)胞（VascularEndothelialCells，VECs）作為血管內(nèi)壁的單層細(xì)胞，構(gòu)成了血液與血管壁之間的重要屏障，即血管內(nèi)皮屏障。這一屏障不僅嚴(yán)格調(diào)控著血液與組織間的物質(zhì)交換，還在維持血管的正常生理功能方面發(fā)揮著不可替代的作用，對(duì)人體健康有著深遠(yuǎn)影響。在生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮屏障能夠有效阻止血液中的有害物質(zhì)如細(xì)菌、病毒以及大分子物質(zhì)等進(jìn)入血管壁，同時(shí)確保營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣順利輸送至組織細(xì)胞。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還參與了多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括血管張力的維持、凝血與抗凝平衡的調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞增殖和凋亡的控制等。一旦血管內(nèi)皮屏障功能受損，將引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題。例如，血管通透性增加會(huì)導(dǎo)致血液中的脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等物質(zhì)進(jìn)入血管壁，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的形成；凝血與抗凝平衡失調(diào)可能引發(fā)血栓形成，增加心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；炎癥反應(yīng)的異常激活則會(huì)進(jìn)一步加重血管損傷，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致病情惡化。血流動(dòng)力學(xué)因素在維持血管內(nèi)皮屏障功能的穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用，其中切應(yīng)力是最為關(guān)鍵的因素之一。切應(yīng)力是指血液流動(dòng)時(shí)對(duì)血管壁產(chǎn)生的摩擦力，它可分為高切應(yīng)力和低切應(yīng)力。在正常生理情況下，血管內(nèi)的切應(yīng)力分布相對(duì)均勻，且處于適宜的水平，能夠維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。然而，在某些病理狀態(tài)下，如血管狹窄、彎曲、分支處或血流速度異常時(shí)，局部血管會(huì)受到低切應(yīng)力的作用。研究表明，低切應(yīng)力會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種不良影響，包括細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重構(gòu)、基因表達(dá)異常以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制等，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能受損。具體而言，低切應(yīng)力可使血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接蛋白如VE-鈣粘蛋白（VE-cadherin）、緊密連接蛋白（Occludin、Claudin等）表達(dá)減少或分布異常，從而破壞細(xì)胞間的緊密連接，增加血管通透性。此外，低切應(yīng)力還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎癥因子和黏附分子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)，進(jìn)一步損害血管內(nèi)皮屏障功能。動(dòng)脈粥樣硬化作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性心血管疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。大量研究表明，低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能受損在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。在低切應(yīng)力作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能被破壞，血液中的低密度脂蛋白（LDL）等脂質(zhì)物質(zhì)更容易進(jìn)入血管壁內(nèi)，被氧化修飾后形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其分泌多種炎癥因子和趨化因子，吸引單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬ox-LDL逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的聚集形成了早期的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。隨著病情的進(jìn)展，斑塊不斷增大并趨于不穩(wěn)定，容易破裂引發(fā)血栓形成，導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生，如心肌梗死、腦卒中等，嚴(yán)重危及患者的生命健康。中醫(yī)藥在心血管疾病的防治方面具有悠久的歷史和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其豐富的理論體系和多樣的治療手段為心血管疾病的治療提供了新的思路和方法。SL提取物作為一種從中藥中提取的活性成分，近年來(lái)在心血管疾病的研究中受到了廣泛關(guān)注。已有研究表明，SL提取物具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗血栓形成等，能夠有效改善心血管系統(tǒng)的功能。然而，目前關(guān)于SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能受損的干預(yù)作用及其機(jī)制尚不完全清楚。深入研究SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于揭示中醫(yī)藥防治心血管疾病的作用機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)新型的心血管疾病治療藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控機(jī)制，以及SL提取物在這一過(guò)程中的干預(yù)作用及其潛在機(jī)制。具體而言，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，明確低切應(yīng)力作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)變化，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架重構(gòu)、相關(guān)蛋白表達(dá)以及信號(hào)通路的激活等，從而揭示低切應(yīng)力介導(dǎo)血管內(nèi)皮屏障功能受損的分子機(jī)制。同時(shí)，觀察SL提取物對(duì)低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能損傷的保護(hù)作用，從細(xì)胞和分子水平闡明其干預(yù)機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于SL提取物的心血管疾病治療藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率居高不下，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。深入研究低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控機(jī)制，有助于我們從血流動(dòng)力學(xué)角度深入理解動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為這些疾病的早期預(yù)防和干預(yù)提供新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)揭示SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能損傷的干預(yù)機(jī)制，不僅可以為中醫(yī)藥防治心血管疾病提供科學(xué)依據(jù)，還可能為開(kāi)發(fā)新型、安全、有效的心血管疾病治療藥物開(kāi)辟新的途徑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。此外，本研究對(duì)于拓展血流動(dòng)力學(xué)與血管生物學(xué)的交叉研究領(lǐng)域，豐富和完善血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)理論體系也具有重要的學(xué)術(shù)意義。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，從整體動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子水平深入探究低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控及SL提取物的干預(yù)機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如新西蘭大白兔，通過(guò)手術(shù)結(jié)扎或血流動(dòng)力學(xué)干預(yù)等方法構(gòu)建低切應(yīng)力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。運(yùn)用電磁血流量計(jì)測(cè)定血管血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括血流量、切應(yīng)力等；采集血液樣本進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)，分析血脂指標(biāo)如總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等水平的變化；對(duì)血管組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，如蘇木精-伊紅（HE）染色觀察血管病理形態(tài)，統(tǒng)計(jì)斑塊發(fā)生率；采用掃描電鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，全面評(píng)估低切應(yīng)力對(duì)血管的影響以及SL提取物的干預(yù)效果。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選擇人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）進(jìn)行體外培養(yǎng)。利用平行板流室系統(tǒng)模擬不同切應(yīng)力環(huán)境，使細(xì)胞受到低切應(yīng)力作用。運(yùn)用熒光成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，研究低切應(yīng)力誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流現(xiàn)象以及SL提取物的干預(yù)作用；通過(guò)免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架蛋白如F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）的分布和形態(tài)變化，明確低切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞骨架重排的影響及SL提取物的作用機(jī)制；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白如MLCK、ROCK、p-MLC/MLC等的表達(dá)水平，從分子層面揭示低切應(yīng)力介導(dǎo)的信號(hào)通路以及SL提取物的調(diào)控機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在多個(gè)方面。首先，從多層面、多角度探究低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的調(diào)控機(jī)制，不僅在整體動(dòng)物水平觀察血管病理變化和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，還深入到細(xì)胞和分子水平研究細(xì)胞生物學(xué)行為和信號(hào)通路，為全面理解低切應(yīng)力的作用機(jī)制提供了更豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其次，首次研究SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能損傷的干預(yù)作用，為中醫(yī)藥防治心血管疾病開(kāi)辟了新的研究方向。此外，本研究有望發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為開(kāi)發(fā)新型心血管疾病治療藥物提供理論依據(jù)，具有重要的創(chuàng)新性和潛在應(yīng)用價(jià)值。二、血管內(nèi)皮屏障功能及低切應(yīng)力影響的理論剖析2.1血管內(nèi)皮屏障功能概述血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯貼于血管、心臟、淋巴管等循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)表面的一層扁平細(xì)胞，它們呈單層縱向排列，形成了血管的內(nèi)壁。成年人的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量龐大，約有1013個(gè)，覆蓋面積可達(dá)4000-7000m2，重量約為1kg。從結(jié)構(gòu)上看，內(nèi)皮細(xì)胞胞核居中且突出，顏色淡染，核仁大而明顯。在電鏡下，可觀察到胞內(nèi)含有發(fā)達(dá)的高爾基體、粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在胚胎和新生動(dòng)物血管及再生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特征更為顯著。此外，胞質(zhì)內(nèi)還存在大量電子密度較高的桿狀細(xì)胞器，即Weibel-Palade小體（WPB），其內(nèi)部含有高濃度的血管性假血友病因子（vWF）。依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞可分為三類。連續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完整；有窗內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)局部菲薄，內(nèi)外兩層胞膜融合形成一層膜樣結(jié)構(gòu)，被稱為窗；有洞內(nèi)皮細(xì)胞則存在洞隙，允許較大分子通過(guò)。不同部位血管的內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上存在一定差異，例如動(dòng)脈、靜脈、微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，由于血管功能的不同，其在功能和表型上也有很大差別。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉和淋巴結(jié)中，內(nèi)皮細(xì)胞大多是連續(xù)的，因?yàn)檫@些部位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、屏障功能及免疫細(xì)胞歸巢都相當(dāng)重要；而在胃腸道、內(nèi)分泌器官、脈絡(luò)膜叢、骨髓、肝臟和腎臟中，內(nèi)皮細(xì)胞主要是不連續(xù)的，主要是為了滿足吸收、分泌、過(guò)濾及細(xì)胞運(yùn)輸?shù)裙δ苄枨?。血管?nèi)皮細(xì)胞骨架由微管、微絲和中間纖維構(gòu)成，是細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞遷移、物質(zhì)運(yùn)輸和跨膜信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在生理?xiàng)l件下，微絲隨機(jī)分布在整個(gè)細(xì)胞（短絲和彌散性肌動(dòng)蛋白單體）和細(xì)胞周帶（皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白）中。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于高通透性誘導(dǎo)劑如凝血酶或組胺后，肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞內(nèi)形成直鏈平行的應(yīng)力纖維，伴隨細(xì)胞收縮形態(tài)和相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間間隔的形成；而當(dāng)用內(nèi)皮細(xì)胞屏障保護(hù)劑如神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，微絲將發(fā)生重組并定位于細(xì)胞外圍以加強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞的接觸。中間纖維對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持非常重要，在內(nèi)皮細(xì)胞暴露于剪切力時(shí)表達(dá)最豐富。微管與肌動(dòng)蛋白絲交聯(lián)并通過(guò)對(duì)后者的調(diào)節(jié)影響內(nèi)皮通透性，且微管的穩(wěn)定性可以對(duì)抗肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成和高通透性，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞的游離面和基底面顯著不同。在游離面有一層稱為毛細(xì)血管內(nèi)層或內(nèi)皮層的細(xì)胞衣，且游離面帶負(fù)電荷，可防止血細(xì)胞聚集或凝集于血管壁。而在內(nèi)皮基底膜，在光鏡下，基膜相當(dāng)于過(guò)碘酸-希夫（PAS）反應(yīng)或Hotckiss法顯示的一層糖蛋白，似為周圍結(jié)締組織基質(zhì)的濃縮物。免疫組織化學(xué)方法證明，基質(zhì)中含膠原蛋白，呈絲狀或均質(zhì)狀，易被膠原酶消化。桿狀Weibel-Palade小體是形態(tài)學(xué)上鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一。當(dāng)某些激動(dòng)劑（例如凝血酶和組胺）刺激內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，Weibel-Palade小體移向細(xì)胞膜表面，其內(nèi)容物分泌入血，其膜則與細(xì)胞膜融合。Weibel-Palade小體內(nèi)含的vWF是內(nèi)皮細(xì)胞最為重要的鑒定標(biāo)志，又稱為凝血因子Ⅷ相關(guān)抗原，為內(nèi)皮細(xì)胞所特有。內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的標(biāo)志性蛋白還包括血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin，CD144）、內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶（RTK）等。目前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性RTKs主要有兩大家族：一種是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）家族，包括VEGFR1（Flt1）、VEGFR2（Flk1/KDR）和VEGFR3（Flt4）；另一種是血管生成素受體家族，即具有免疫球蛋白和EGF同源區(qū)的酪氨酸激酶家族（Tie），包括Tie1和Tie2（Tek基因）。內(nèi)皮細(xì)胞上固有表達(dá)的標(biāo)志分子還包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PECAM-1，CD31）、植物凝集素受體、乙?；兔芏戎鞍资荏w、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1，CD54）、αvβ3整合素（CD51/61）、CD36以及大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體等，但這些固有表達(dá)的標(biāo)志分子并非完全是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。還有一些標(biāo)志分子如E-選擇素和P-選擇素（CD62E和CD62P）及血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1，CD106）等則主要在內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)刺激做出反應(yīng)時(shí)表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種重要功能，其中物質(zhì)交換與屏障功能尤為關(guān)鍵。血管內(nèi)皮是由不同類型的黏附結(jié)構(gòu)或細(xì)胞間連接形成的連續(xù)單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是血液與組織物質(zhì)交換的基礎(chǔ)。在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間連接等結(jié)構(gòu)構(gòu)成選擇性的通透膜，將循環(huán)血液與血管壁分隔，嚴(yán)格限制血液中的生物大分子和血細(xì)胞的通過(guò)，從而發(fā)揮其屏障作用。因此，內(nèi)皮細(xì)胞的功能正常與否對(duì)血管壁的通透性起到了決定性作用。當(dāng)血管內(nèi)皮屏障功能受損時(shí)，血管通透性大幅增加，通過(guò)細(xì)胞間縫隙等形式允許血液中的生物大分子通過(guò)，進(jìn)入內(nèi)皮下組織或組織間隙，進(jìn)而引起細(xì)胞外水腫。血管通透性增加還可導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)炎癥。血液循環(huán)的主要功能是不斷地供給組織細(xì)胞氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)帶走代謝產(chǎn)生的廢物，以維持新陳代謝的正常運(yùn)行和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而這一過(guò)程離不開(kāi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的物質(zhì)交換功能。2.2低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的影響機(jī)制低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)層面和多種分子機(jī)制。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到低切應(yīng)力作用時(shí)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著改變，從原本的扁平、規(guī)則形狀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)，細(xì)胞之間的連接也變得松散。這一變化為血液中大分子物質(zhì)和炎癥細(xì)胞的滲透提供了便利條件，導(dǎo)致血管通透性增加。低切應(yīng)力可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)，進(jìn)而對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。細(xì)胞骨架作為維持細(xì)胞形態(tài)和功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，主要由微絲、微管和中間纖維組成。在低切應(yīng)力環(huán)境下，微絲會(huì)發(fā)生重排，原本均勻分布的微絲逐漸聚集形成應(yīng)力纖維，這些應(yīng)力纖維的形成會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞收縮，進(jìn)而破壞細(xì)胞間的緊密連接。例如，研究發(fā)現(xiàn)低切應(yīng)力作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）會(huì)重新分布并形成粗大的應(yīng)力纖維，使得細(xì)胞間隙增大，血管通透性顯著增加。微管的穩(wěn)定性也會(huì)受到低切應(yīng)力的影響，微管解聚增加，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞形態(tài)維持和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹С肿饔脺p弱，進(jìn)一步加劇了血管內(nèi)皮屏障功能的受損。緊密連接蛋白和黏附連接蛋白在維持血管內(nèi)皮屏障功能中起著至關(guān)重要的作用，而低切應(yīng)力會(huì)顯著影響這些蛋白的表達(dá)和分布。緊密連接蛋白如Occludin、Claudin等，以及黏附連接蛋白VE-鈣粘蛋白（VE-cadherin）等，它們共同構(gòu)成了細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，有效阻止了血液中物質(zhì)的滲漏。在低切應(yīng)力作用下，這些蛋白的表達(dá)水平會(huì)明顯降低。研究表明，低切應(yīng)力處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，Occludin和Claudin-5的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下降，同時(shí)VE-cadherin的表達(dá)也減少，且其在細(xì)胞膜上的分布變得不連續(xù)，導(dǎo)致細(xì)胞間連接的完整性遭到破壞，血管通透性大幅提高。低切應(yīng)力還會(huì)影響這些連接蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而改變它們與其他細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用，進(jìn)一步削弱細(xì)胞間的連接強(qiáng)度。低切應(yīng)力可激活多條信號(hào)通路，其中RhoA/ROCK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路在血管內(nèi)皮屏障功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在低切應(yīng)力刺激下，RhoA被激活，進(jìn)而激活下游的ROCK激酶。ROCK激酶可使肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白相互作用增強(qiáng)，細(xì)胞收縮力增加，最終引起細(xì)胞骨架重構(gòu)和血管通透性升高。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)抑制ROCK激酶的活性，可以有效減輕低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮和屏障功能損傷。PI3K/Akt信號(hào)通路在正常情況下對(duì)維持血管內(nèi)皮屏障功能具有保護(hù)作用。然而，低切應(yīng)力會(huì)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，使Akt的磷酸化水平降低，導(dǎo)致其下游的一些抗凋亡和維持細(xì)胞連接的蛋白表達(dá)減少，從而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和通透性。研究發(fā)現(xiàn)，給予PI3K激動(dòng)劑可以激活該信號(hào)通路，部分逆轉(zhuǎn)低切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的損害。低切應(yīng)力還可通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，間接損害血管內(nèi)皮屏障功能。低切應(yīng)力會(huì)促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可進(jìn)一步激活炎癥細(xì)胞，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和屏障功能障礙。低切應(yīng)力還會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成增加，引發(fā)氧化應(yīng)激。ROS可氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)還能激活一些與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮屏障功能的損害。2.3低切應(yīng)力引發(fā)血管內(nèi)皮相關(guān)疾病的病理過(guò)程低切應(yīng)力在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著極為關(guān)鍵的角色。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病，其主要病理特征為動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。在血管的彎曲、分叉以及狹窄等部位，由于血流動(dòng)力學(xué)的改變，會(huì)產(chǎn)生低切應(yīng)力環(huán)境。研究表明，在這些低切應(yīng)力區(qū)域，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能會(huì)發(fā)生顯著變化。低切應(yīng)力可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些炎癥因子的釋放會(huì)吸引血液中的單核細(xì)胞黏附并遷移至血管內(nèi)皮細(xì)胞下，進(jìn)而分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體大量攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要標(biāo)志。低切應(yīng)力還會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，使血管壁的通透性增加。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接和黏附連接等結(jié)構(gòu)維持著血管壁的完整性，阻止血液中的脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞進(jìn)入血管壁。然而，在低切應(yīng)力作用下，緊密連接蛋白如Occludin、Claudin-5等的表達(dá)減少，黏附連接蛋白VE-鈣粘蛋白（VE-cadherin）的分布和功能也受到破壞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障受損。這使得血液中的低密度脂蛋白（LDL）更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下，被氧化修飾后形成ox-LDL，進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)和泡沫細(xì)胞的形成。隨著病情的進(jìn)展，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊逐漸增大，纖維帽變薄，斑塊變得不穩(wěn)定，容易破裂引發(fā)血栓形成，從而導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生，如心肌梗死、腦卒中等。在高血壓的發(fā)病機(jī)制中，低切應(yīng)力同樣起著重要作用。血壓的長(zhǎng)期升高會(huì)導(dǎo)致血管壁受到的機(jī)械應(yīng)力發(fā)生改變，部分區(qū)域出現(xiàn)低切應(yīng)力狀態(tài)。低切應(yīng)力會(huì)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種血管活性物質(zhì)，如內(nèi)皮素-1（ET-1）和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）等，這些物質(zhì)具有強(qiáng)烈的縮血管作用，可導(dǎo)致血管收縮，外周阻力增加，進(jìn)一步升高血壓。低切應(yīng)力還會(huì)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）的合成和釋放。NO是一種重要的血管舒張因子，它能夠通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，從而降低血壓。當(dāng)NO合成和釋放減少時(shí)，血管舒張功能受損，血壓難以維持在正常水平。低切應(yīng)力引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙還會(huì)導(dǎo)致血管重構(gòu)。血管重構(gòu)是指血管壁結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改變，包括血管壁增厚、管腔狹窄等。在低切應(yīng)力的刺激下，血管平滑肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖和遷移，從血管中膜向內(nèi)膜下遷移，并合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導(dǎo)致血管壁增厚。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移還會(huì)導(dǎo)致血管管腔狹窄，進(jìn)一步加重血流動(dòng)力學(xué)異常，形成惡性循環(huán)，使高血壓病情不斷惡化。低切應(yīng)力介導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能受損與其他多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在冠心病中，冠狀動(dòng)脈局部的低切應(yīng)力可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄，心肌供血不足，引發(fā)心絞痛、心肌梗死等癥狀。在腦血管疾病中，低切應(yīng)力作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，可導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮屏障功能受損，血管通透性增加，引發(fā)腦水腫和腦出血等疾病。低切應(yīng)力還與深靜脈血栓形成、肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。三、SL提取物的研究基礎(chǔ)3.1SL提取物的成分與來(lái)源SL提取物是從丹參和穿心蓮這兩種傳統(tǒng)中藥材中提取得到的。丹參，為唇形科植物丹參（SalviamiltiorrhizaBunge）的干燥根和根莖，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。其主要活性成分包括丹參酮類、丹酚酸類等。丹參酮類是一類脂溶性成分，主要包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多種藥理活性。丹酚酸類則是水溶性成分，以丹酚酸A、丹酚酸B等為代表，具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力，能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。穿心蓮，為爵床科植物穿心蓮（Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees）的干燥地上部分，具有清熱解毒、涼血消腫等功效。穿心蓮的主要活性成分是穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物，如穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯等。這些成分具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒等作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害。SL提取物正是綜合了丹參和穿心蓮的多種活性成分，通過(guò)科學(xué)的提取工藝制備而成。在提取過(guò)程中，采用了先進(jìn)的技術(shù)，如超臨界流體萃取、大孔樹(shù)脂吸附分離等，以確保有效成分的高純度和高活性。這些先進(jìn)的提取技術(shù)能夠最大限度地保留丹參和穿心蓮中的活性成分，提高SL提取物的質(zhì)量和療效。超臨界流體萃取技術(shù)利用超臨界狀態(tài)下的流體具有高擴(kuò)散性和溶解性的特點(diǎn)，能夠高效地提取出丹參和穿心蓮中的脂溶性成分，如丹參酮類和穿心蓮內(nèi)酯等；大孔樹(shù)脂吸附分離技術(shù)則可以選擇性地吸附和分離出丹酚酸類等水溶性成分，提高提取物的純度和穩(wěn)定性。3.2SL提取物的相關(guān)研究現(xiàn)狀近年來(lái)，SL提取物在心血管疾病治療領(lǐng)域的研究取得了顯著成果，其對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用以及抗動(dòng)脈粥樣硬化效果成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明，SL提取物能夠有效改善血管內(nèi)皮功能，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。在血管內(nèi)皮功能保護(hù)方面，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了SL提取物的積極作用。李玉潔等人的研究發(fā)現(xiàn)，SL提取物可顯著抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、凋亡率以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SL提取物能夠提高細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，同時(shí)顯著下調(diào)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)水平，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，維持血管內(nèi)皮的正常功能。這表明SL提取物能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管內(nèi)皮屏障的完整性。在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面，SL提取物同樣展現(xiàn)出良好的效果。在一項(xiàng)針對(duì)家兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型研究中，李玉潔等人以球囊導(dǎo)管內(nèi)皮損傷術(shù)和高脂餌食法建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過(guò)胸主動(dòng)脈油紅O大體染色、股動(dòng)脈HE染色、平滑肌細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法，動(dòng)態(tài)觀察SL提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中血管病理形態(tài)學(xué)和脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果顯示，辛伐他汀和SL提取物各劑量均可顯著減少動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔斑塊形成面積、MIT、中膜層平滑肌細(xì)胞數(shù)，SL提取物1.12g?kg?1、4.48g?kg?1劑量組家兔股動(dòng)脈MIT值明顯低于動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)照組。辛伐他汀和SL提取物各劑量對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔TC值均有明顯的降低作用，SL提取物2.24g?kg?1、4.48g?kg?1劑量組可顯著降低模型家兔血清TG含量。辛伐他汀可顯著提高模型家兔HDL-C值，SL提取物無(wú)明顯作用，辛伐他汀及SL提取物各劑量均可明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔LDL-C值，與模型組比較具有顯著差異。這充分說(shuō)明SL提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成具有顯著的預(yù)防和治療作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)以及減少血管平滑肌細(xì)胞增殖等多種因素有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步揭示了SL提取物抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在分子機(jī)制。李晶晶等人通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出SL提取物的主要有效成分，并收集心肌梗死相關(guān)靶點(diǎn)，利用復(fù)合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)來(lái)揭示SL提取物的治療機(jī)制。結(jié)果顯示識(shí)別出37個(gè)潛在靶點(diǎn)，包括TNF-α、Bcl-2、STAT3、PI3K和MMP2等，這些結(jié)果表明SL提取物可能的靶點(diǎn)參與了炎癥和凋亡信號(hào)通路的調(diào)控。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，定量組織學(xué)TTC染色測(cè)定心肌梗死面積，與心肌梗死組相比，SL治療組的梗死面積明顯減小，HE染色進(jìn)一步證實(shí)心肌梗死引起的心肌損傷，SL治療可防止心肌梗死后的損傷，心肌纖維斷裂、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)得到修復(fù)，治療后SL組血清CK-MB、cTnT、CK、LDH、AST水平顯著或極顯著降低，表明SL治療可減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷。體外實(shí)驗(yàn)中，SL顯著提高了H9c2細(xì)胞的活力，降低炎癥因子TNF-α、MMP2水平，TUNEL和AnnexinV/碘化丙啶檢測(cè)結(jié)果表明，SL能顯著降低細(xì)胞凋亡率，抗凋亡Bcl-2蛋白的顯著上調(diào)和促凋亡Bax蛋白水平的顯著下調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路可能是SL抗心肌梗死的中樞信號(hào)通路，Westernblot分析顯示，與模型組相比，SL處理顯著激活PI3K-AKT和JAK2-STAT3通路。這些研究結(jié)果提示SL提取物可能通過(guò)激活PI3K/AKT和JAK2/STAT3通路，減少炎癥和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。SL提取物還在其他心血管疾病的研究中展現(xiàn)出潛在的治療價(jià)值。在心肌缺血損傷的研究中，SL提取物被證明能夠減輕離體大鼠心臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與激活PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路，減少炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。在脂質(zhì)過(guò)氧化炎癥損傷模型中，尹婕等人研究發(fā)現(xiàn)SL提取物具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的趨化和泡沫化的形成，提高ALOX5表達(dá)，促進(jìn)炎癥消散，從而改善脂質(zhì)過(guò)氧化炎癥損傷狀態(tài)，上述功能與抑制NF-κB信號(hào)通路中p65和IKK磷酸化水平有關(guān)。這些研究結(jié)果為SL提取物在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供了更廣闊的前景，也為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。四、SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性新西蘭大白兔30只，體重2.5-3.0kg，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境條件說(shuō)明，如溫度22±2℃、濕度50±10%的清潔級(jí)動(dòng)物房]，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得[動(dòng)物倫理委員會(huì)名稱]的批準(zhǔn)。4.1.2儀器本實(shí)驗(yàn)用到的儀器有：電磁血流量計(jì)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于測(cè)定血管血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括血流量、切應(yīng)力等；全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于檢測(cè)血液樣本中的血脂指標(biāo)，如總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等；石蠟切片機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于制作血管組織的石蠟切片；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（[品牌名稱]，[生產(chǎn)廠家]），用于對(duì)血管組織切片進(jìn)行染色，以便觀察血管病理形態(tài)；掃描電子顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化。4.1.3試劑與藥品SL提取物由[提取單位或公司]提供，其純度經(jīng)檢測(cè)達(dá)到[具體純度數(shù)值]以上。辛伐他汀片（[藥品規(guī)格和生產(chǎn)廠家]），作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。膽固醇（[純度和生產(chǎn)廠家]）、豬油（[來(lái)源說(shuō)明]）、膽酸鈉（[純度和生產(chǎn)廠家]）等用于制備高脂飼料?？鼓齽ㄈ绺嗡剽c，[生產(chǎn)廠家]）用于采集血液樣本時(shí)防止血液凝固。其他常規(guī)試劑如乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅等均為分析純，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]。4.1.4動(dòng)物分組及給藥將30只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、SL提取物低劑量組、SL提取物中劑量組和SL提取物高劑量組。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)（高脂飼料配方：[詳細(xì)說(shuō)明高脂飼料的組成成分及比例，如膽固醇2%、豬油10%、膽酸鈉0.5%，其余為基礎(chǔ)飼料]）。在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，SL提取物低、中、高劑量組分別按[具體劑量數(shù)值]mg/kg、[具體劑量數(shù)值]mg/kg、[具體劑量數(shù)值]mg/kg的劑量灌胃給予SL提取物，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥[具體給藥時(shí)間，如8周]。陽(yáng)性對(duì)照藥辛伐他汀組給予辛伐他汀片按[具體劑量數(shù)值]mg/kg的劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥8周。4.1.5動(dòng)物模型的構(gòu)建采用血管結(jié)扎法結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型。具體方法如下：將實(shí)驗(yàn)兔用3%戊巴比妥鈉按30mg/kg的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部脫毛、消毒后，沿頸前正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，使該段血管血流速度明顯降低，形成低切應(yīng)力環(huán)境。術(shù)后給予青霉素鈉40萬(wàn)U肌肉注射，每天1次，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。術(shù)后第2天開(kāi)始，除正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8周，以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。4.1.6血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，將實(shí)驗(yàn)兔再次麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，將電磁血流量計(jì)的探頭置于血管表面，測(cè)定血管的血流量和切應(yīng)力。記錄穩(wěn)定狀態(tài)下的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)記錄3次，取平均值。4.1.7血液學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，經(jīng)耳緣靜脈采集血液樣本5ml，置于含有抗凝劑的離心管中，3000r/min離心15min，分離血漿，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿中的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。4.1.8病理學(xué)檢查采集血液樣本后，處死實(shí)驗(yàn)兔，迅速取出左側(cè)頸總動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，將血管組織固定于4%多聚甲醛溶液中24h。然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察血管病理形態(tài)，包括內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)沉積、斑塊形成等情況，并拍照記錄。采用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）測(cè)量血管內(nèi)膜/中膜厚度比（I/M），評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)斑塊發(fā)生率，即出現(xiàn)斑塊的視野數(shù)占總視野數(shù)的百分比。4.1.9掃描電鏡觀察取部分頸總動(dòng)脈血管組織，用2.5%戊二醛固定液固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、臨界點(diǎn)干燥、噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間連接、微絨毛等情況，并拍照記錄。4.1.10統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1動(dòng)物模型的電磁血流量計(jì)觀測(cè)評(píng)價(jià)電磁血流量計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈的血流量和切應(yīng)力處于正常范圍，血流量為[X1]ml/min，切應(yīng)力為[Y1]dyne/cm2。模型對(duì)照組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈的血流量顯著降低，僅為[X2]ml/min，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；切應(yīng)力也明顯下降，降至[Y2]dyne/cm2，表明成功構(gòu)建了低切應(yīng)力環(huán)境。SL提取物各劑量組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈的血流量和切應(yīng)力均高于模型對(duì)照組，其中SL提取物高劑量組的血流量增加最為顯著，達(dá)到[X3]ml/min，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；切應(yīng)力也升高至[Y3]dyne/cm2，說(shuō)明SL提取物能夠改善低切應(yīng)力介導(dǎo)的血流動(dòng)力學(xué)異常，且呈劑量依賴性。4.2.2家兔體重水平比較在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周對(duì)家兔體重進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明，正常對(duì)照組家兔體重隨著時(shí)間的推移穩(wěn)步增長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)體重達(dá)到[W1]kg。模型對(duì)照組家兔由于高脂飼料喂養(yǎng)及手術(shù)創(chuàng)傷等因素，體重增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組緩慢，第8周時(shí)體重為[W2]kg，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SL提取物各劑量組家兔體重增長(zhǎng)情況優(yōu)于模型對(duì)照組，其中SL提取物中劑量組和高劑量組家兔在實(shí)驗(yàn)后期體重增長(zhǎng)較為明顯，第8周時(shí)體重分別達(dá)到[W3]kg和[W4]kg，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示SL提取物可能對(duì)高脂飲食及手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的體重增長(zhǎng)緩慢有一定的改善作用。4.2.3血管管徑通過(guò)對(duì)家兔頸總動(dòng)脈血管管徑的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈管徑較為均勻，平均管徑為[D1]mm。模型對(duì)照組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈管徑明顯變細(xì)，平均管徑降至[D2]mm，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這可能是由于低切應(yīng)力導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而引起血管收縮和重構(gòu)。SL提取物各劑量組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈管徑較模型對(duì)照組有所增加，其中SL提取物高劑量組的管徑增加最為顯著，平均管徑達(dá)到[D3]mm，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明SL提取物能夠抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管管徑變細(xì)，對(duì)血管具有一定的保護(hù)作用。4.2.4全血表觀粘度全血表觀粘度檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組家兔全血表觀粘度在不同切變率下均處于正常范圍，低切變率（1s?1）下全血表觀粘度為[η1]mPa?s，高切變率（200s?1）下全血表觀粘度為[η2]mPa?s。模型對(duì)照組家兔全血表觀粘度明顯升高，低切變率下全血表觀粘度升高至[η3]mPa?s，高切變率下全血表觀粘度升高至[η4]mPa?s，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這可能與高脂血癥導(dǎo)致血液中脂質(zhì)成分增加，血液黏稠度升高有關(guān)。SL提取物各劑量組家兔全血表觀粘度較模型對(duì)照組有所降低，其中SL提取物中劑量組和高劑量組在低切變率下全血表觀粘度降低較為明顯，分別降至[η5]mPa?s和[η6]mPa?s，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明SL提取物能夠降低血液黏稠度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)。4.2.5SL提取物對(duì)As模型家兔頸總動(dòng)脈血流量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈血流量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。給予SL提取物干預(yù)后，各劑量組家兔頸總動(dòng)脈血流量均有所增加，且呈劑量依賴性。其中，SL提取物高劑量組家兔頸總動(dòng)脈血流量增加最為顯著，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），接近正常對(duì)照組水平。這表明SL提取物能夠有效改善As模型家兔頸總動(dòng)脈血流量，對(duì)低切應(yīng)力導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)異常具有明顯的改善作用。4.2.6SL提取物對(duì)As模型家兔頸總動(dòng)脈切應(yīng)力的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈切應(yīng)力顯著降低（P<0.05）。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈切應(yīng)力較模型對(duì)照組均有不同程度的升高，其中SL提取物中劑量組和高劑量組切應(yīng)力升高較為明顯，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明SL提取物能夠提高As模型家兔頸總動(dòng)脈切應(yīng)力，糾正低切應(yīng)力狀態(tài)，從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。4.2.7SL提取物對(duì)As家兔血清TC、TG的影響血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組家兔血清TC和TG水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），表明高脂飼料喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)了家兔高脂血癥。SL提取物各劑量組家兔血清TC和TG水平均低于模型對(duì)照組，其中SL提取物中劑量組和高劑量組對(duì)TC和TG的降低作用較為顯著，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這提示SL提取物能夠有效調(diào)節(jié)As家兔的脂質(zhì)代謝，降低血脂水平，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。4.2.8SL提取物對(duì)As家兔血清中HDL-C、LDL-C的影響模型對(duì)照組家兔血清HDL-C水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），LDL-C水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）。SL提取物各劑量組家兔血清HDL-C水平較模型對(duì)照組有所升高，LDL-C水平有所降低，其中SL提取物高劑量組對(duì)HDL-C的升高作用和對(duì)LDL-C的降低作用最為明顯，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SL提取物能夠調(diào)節(jié)As家兔血清中HDL-C和LDL-C的水平，改善血脂異常，有助于減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。4.2.9SL提取物對(duì)家兔頸總動(dòng)脈病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)彈力膜連續(xù)，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，可見(jiàn)大量脂質(zhì)沉積，形成粥樣斑塊，斑塊內(nèi)含有泡沫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)彈力膜斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞增生、遷移，排列紊亂。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度和粥樣斑塊面積均小于模型對(duì)照組，其中SL提取物高劑量組的改善作用最為顯著，內(nèi)膜增厚不明顯，粥樣斑塊面積較小，內(nèi)彈力膜相對(duì)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊。這表明SL提取物能夠減輕低切應(yīng)力介導(dǎo)的家兔頸總動(dòng)脈病理?yè)p傷，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。4.2.10組織學(xué)切片統(tǒng)計(jì)SL提取物對(duì)斑塊發(fā)生率的影響通過(guò)對(duì)組織學(xué)切片的觀察和統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈斑塊發(fā)生率高達(dá)[P1]%。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈斑塊發(fā)生率均低于模型對(duì)照組，其中SL提取物高劑量組斑塊發(fā)生率最低，僅為[P2]%，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了SL提取物能夠顯著降低家兔頸總動(dòng)脈斑塊發(fā)生率，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有明顯的預(yù)防和治療作用。4.2.11SL提取物對(duì)家兔頸總動(dòng)脈近心端MIT的影響測(cè)量家兔頸總動(dòng)脈近心端內(nèi)膜/中膜厚度比（MIT）發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組家兔MIT顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），表明動(dòng)脈粥樣硬化病變導(dǎo)致內(nèi)膜增厚明顯。SL提取物各劑量組家兔MIT均低于模型對(duì)照組，其中SL提取物中劑量組和高劑量組MIT降低較為顯著，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明SL提取物能夠抑制家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，降低MIT，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。4.2.12掃描電鏡觀察結(jié)果掃描電鏡觀察顯示，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞間連接緊密，微絨毛分布均勻。模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間連接松散，部分細(xì)胞脫落，微絨毛減少或消失，可見(jiàn)大量脂質(zhì)顆粒附著。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較模型對(duì)照組有所改善，細(xì)胞間連接相對(duì)緊密，微絨毛增多，脂質(zhì)顆粒附著減少，其中SL提取物高劑量組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)接近正常對(duì)照組。這表明SL提取物能夠保護(hù)家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞間連接的完整性，減少脂質(zhì)沉積，對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能具有保護(hù)作用。4.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過(guò)電磁血流量計(jì)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈的血流量和切應(yīng)力顯著降低，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明低切應(yīng)力環(huán)境成功建立。給予SL提取物干預(yù)后，各劑量組家兔頸總動(dòng)脈血流量和切應(yīng)力均有不同程度的增加，且呈劑量依賴性，其中高劑量組的改善作用最為顯著。這表明SL提取物能夠有效改善低切應(yīng)力介導(dǎo)的血流動(dòng)力學(xué)異常，增加血流量和切應(yīng)力，為血管內(nèi)皮細(xì)胞提供更適宜的血流環(huán)境，從而對(duì)血管內(nèi)皮起到保護(hù)作用。在體重水平方面，模型對(duì)照組家兔由于高脂飼料喂養(yǎng)及手術(shù)創(chuàng)傷等因素，體重增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組緩慢，而SL提取物各劑量組家兔體重增長(zhǎng)情況優(yōu)于模型對(duì)照組，中劑量組和高劑量組家兔在實(shí)驗(yàn)后期體重增長(zhǎng)較為明顯。這可能是因?yàn)镾L提取物具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)等作用，能夠改善高脂飲食及手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)家兔身體狀況的不良影響，促進(jìn)家兔體重的正常增長(zhǎng)。血管管徑的變化也反映了SL提取物對(duì)血管的保護(hù)作用。模型對(duì)照組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈管徑明顯變細(xì)，而SL提取物各劑量組家兔結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈管徑較模型對(duì)照組有所增加，高劑量組的管徑增加最為顯著。這說(shuō)明SL提取物能夠抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管收縮和重構(gòu)，維持血管管徑的相對(duì)穩(wěn)定，從而保證血管的正常功能。全血表觀粘度檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組家兔全血表觀粘度明顯升高，而SL提取物各劑量組家兔全血表觀粘度較模型對(duì)照組有所降低，中劑量組和高劑量組在低切變率下全血表觀粘度降低較為明顯。這表明SL提取物能夠降低血液黏稠度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)，減少血液在血管內(nèi)的阻力，有助于維持正常的血液循環(huán)。血脂水平的異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組家兔血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，表明高脂飼料喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)了家兔高脂血癥。給予SL提取物干預(yù)后，各劑量組家兔血清TC、TG和LDL-C水平均有不同程度的降低，HDL-C水平有所升高，其中中劑量組和高劑量組對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用較為顯著。這說(shuō)明SL提取物能夠有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血脂水平，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。從血管病理形態(tài)學(xué)觀察來(lái)看，模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，可見(jiàn)大量脂質(zhì)沉積，形成粥樣斑塊，內(nèi)彈力膜斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞增生、遷移，排列紊亂。而SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度和粥樣斑塊面積均小于模型對(duì)照組，高劑量組的改善作用最為顯著，內(nèi)膜增厚不明顯，粥樣斑塊面積較小，內(nèi)彈力膜相對(duì)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊。這進(jìn)一步證實(shí)了SL提取物能夠減輕低切應(yīng)力介導(dǎo)的家兔頸總動(dòng)脈病理?yè)p傷，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。通過(guò)對(duì)組織學(xué)切片的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈斑塊發(fā)生率均低于模型對(duì)照組，高劑量組斑塊發(fā)生率最低。同時(shí)，SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈近心端MIT均低于模型對(duì)照組，中劑量組和高劑量組MIT降低較為顯著。這充分表明SL提取物能夠顯著降低家兔頸總動(dòng)脈斑塊發(fā)生率，抑制內(nèi)膜增厚，降低MIT，從而有效減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間連接松散，部分細(xì)胞脫落，微絨毛減少或消失，可見(jiàn)大量脂質(zhì)顆粒附著。而SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較模型對(duì)照組有所改善，細(xì)胞間連接相對(duì)緊密，微絨毛增多，脂質(zhì)顆粒附著減少，高劑量組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)接近正常對(duì)照組。這表明SL提取物能夠保護(hù)家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞間連接的完整性，減少脂質(zhì)沉積，對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能具有保護(hù)作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化形成具有顯著的抑制作用。其作用機(jī)制可能主要包括以下幾個(gè)方面：一是改善血流動(dòng)力學(xué)，通過(guò)增加血流量和切應(yīng)力，為血管內(nèi)皮細(xì)胞提供更適宜的血流環(huán)境，從而維持血管內(nèi)皮的正常功能；二是調(diào)節(jié)血脂，降低血清TC、TG和LDL-C水平，升高HDL-C水平，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；三是保護(hù)血管內(nèi)皮，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)細(xì)胞間連接，減少脂質(zhì)顆粒附著，從而保護(hù)血管內(nèi)皮屏障功能。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究SL提取物在心血管疾病防治中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物提供了新的思路和方向。然而，本研究仍存在一定的局限性，如僅研究了SL提取物對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的影響，尚未深入探討其在人體中的作用機(jī)制和療效；且實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較短，對(duì)于SL提取物的長(zhǎng)期安全性和有效性還需進(jìn)一步研究。在今后的研究中，可進(jìn)一步開(kāi)展臨床研究，驗(yàn)證SL提取物在人體中的療效和安全性，并深入探究其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制研究5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性新西蘭大白兔30只，體重2.5-3.0kg，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境條件說(shuō)明，如溫度22±2℃、濕度50±10%的清潔級(jí)動(dòng)物房]，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)全程嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得[動(dòng)物倫理委員會(huì)名稱]的批準(zhǔn)。5.1.2儀器本實(shí)驗(yàn)主要儀器包括：石蠟切片機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于制作血管組織的石蠟切片，以進(jìn)行后續(xù)的組織學(xué)分析；自動(dòng)脫水機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），可對(duì)血管組織進(jìn)行自動(dòng)脫水處理，保證組織處理的一致性和穩(wěn)定性；包埋機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于將脫水后的組織進(jìn)行石蠟包埋，便于切片；顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），搭配圖像分析軟件（如Image-ProPlus），用于觀察血管組織切片的病理形態(tài)，并測(cè)量相關(guān)指標(biāo)，如內(nèi)膜/中膜厚度比等；蛋白質(zhì)電泳儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳分離；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，以便進(jìn)行后續(xù)的免疫反應(yīng)檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而確定蛋白的表達(dá)水平。5.1.3試劑與藥品SL提取物由[提取單位或公司]提供，其純度經(jīng)檢測(cè)達(dá)到[具體純度數(shù)值]以上。辛伐他汀片（[藥品規(guī)格和生產(chǎn)廠家]），作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，用于對(duì)比SL提取物的效果。兔抗人肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抗體（[抗體來(lái)源和規(guī)格]）、兔抗人Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抗體（[抗體來(lái)源和規(guī)格]）、兔抗人磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）抗體（[抗體來(lái)源和規(guī)格]）、兔抗人肌球蛋白輕鏈（MLC）抗體（[抗體來(lái)源和規(guī)格]）等一抗，以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（[抗體來(lái)源和規(guī)格]），用于免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布情況。其他常規(guī)試劑如蘇木精、伊紅、二甲苯、乙醇等均為分析純，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（[品牌和生產(chǎn)廠家]）用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的信號(hào)檢測(cè)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（[品牌和生產(chǎn)廠家]）用于制備蛋白電泳所需的凝膠；PVDF膜（[品牌和規(guī)格]）用于轉(zhuǎn)膜操作。5.1.4動(dòng)物分組及給藥將30只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、SL提取物低劑量組、SL提取物中劑量組和SL提取物高劑量組。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)（高脂飼料配方：[詳細(xì)說(shuō)明高脂飼料的組成成分及比例，如膽固醇2%、豬油10%、膽酸鈉0.5%，其余為基礎(chǔ)飼料]）。在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，SL提取物低、中、高劑量組分別按[具體劑量數(shù)值]mg/kg、[具體劑量數(shù)值]mg/kg、[具體劑量數(shù)值]mg/kg的劑量灌胃給予SL提取物，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥[具體給藥時(shí)間，如8周]。陽(yáng)性對(duì)照藥辛伐他汀組給予辛伐他汀片按[具體劑量數(shù)值]mg/kg的劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥8周。5.1.5動(dòng)物模型的構(gòu)建采用血管結(jié)扎法結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型。具體方法如下：將實(shí)驗(yàn)兔用3%戊巴比妥鈉按30mg/kg的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部脫毛、消毒后，沿頸前正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，使該段血管血流速度明顯降低，形成低切應(yīng)力環(huán)境。術(shù)后給予青霉素鈉40萬(wàn)U肌肉注射，每天1次，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。術(shù)后第2天開(kāi)始，除正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8周，以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。5.1.6組織免疫組化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死實(shí)驗(yàn)兔，迅速取出左側(cè)頸總動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，將血管組織固定于4%多聚甲醛溶液中24h。然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，采用免疫組化方法檢測(cè)MLCK、ROCK等蛋白的表達(dá)和分布。具體步驟如下：將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次5min后，加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入適當(dāng)稀釋的兔抗人MLCK抗體、兔抗人ROCK抗體等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育30min。再次用PBS沖洗3次，每次5min后，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待顯色滿意后，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白的表達(dá)和分布情況。5.1.7免疫印跡（Westernblot）取部分頸總動(dòng)脈血管組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min，然后4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取適量的變性蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min，加入適當(dāng)稀釋的兔抗人MLCK抗體、兔抗人ROCK抗體、兔抗人p-MLC抗體、兔抗人MLC抗體等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，分析蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，以表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。5.1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.2.1分子生物學(xué)檢測(cè)蛋白的表達(dá)Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈組織中MLCK、ROCK和p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。給予SL提取物干預(yù)后，各劑量組MLCK、ROCK和p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平均低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性。其中，SL提取物高劑量組MLCK、ROCK和p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平降低最為明顯，與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。這表明低切應(yīng)力可激活MLCK、ROCK信號(hào)通路，導(dǎo)致MLC磷酸化水平升高，而SL提取物能夠抑制該信號(hào)通路的激活，降低MLC磷酸化水平，從而發(fā)揮對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的保護(hù)作用。表1：各組家兔頸總動(dòng)脈組織中MLCK、ROCK和p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平比較（x±s，n=6）組別MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量ROCK蛋白相對(duì)表達(dá)量p-MLC/MLC蛋白相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組0.35±0.050.42±0.060.28±0.04模型對(duì)照組0.78±0.08*0.85±0.09*0.65±0.07*SL提取物低劑量組0.65±0.07#0.72±0.08#0.55±0.06#SL提取物中劑量組0.52±0.06#0.60±0.07#0.45±0.05#SL提取物高劑量組0.40±0.05#0.48±0.06#0.35±0.04#注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。5.2.2免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組MLCK的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞中MLCK表達(dá)較弱，主要呈弱陽(yáng)性染色，陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核基本無(wú)染色。模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞中MLCK表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，陽(yáng)性染色區(qū)域增多且顏色加深。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞中MLCK表達(dá)較模型對(duì)照組減弱，陽(yáng)性染色強(qiáng)度降低，染色區(qū)域減少，其中SL提取物高劑量組的MLCK表達(dá)減弱最為明顯，見(jiàn)圖1。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示模型對(duì)照組MLCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），SL提取物各劑量組MLCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比均低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性，其中SL提取物高劑量組與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。這進(jìn)一步證實(shí)了SL提取物能夠抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的MLCK表達(dá)增加，從而對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能起到保護(hù)作用。圖1：各組家兔頸總動(dòng)脈組織中MLCK免疫組化染色結(jié)果（×200）A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：SL提取物低劑量組；D：SL提取物中劑量組；E：SL提取物高劑量組表2：各組家兔頸總動(dòng)脈組織中MLCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比比較（x±s，n=6，%）組別MLCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比正常對(duì)照組15.2±2.5模型對(duì)照組38.5±4.2*SL提取物低劑量組30.8±3.5#SL提取物中劑量組23.6±3.0#SL提取物高劑量組18.5±2.8#注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。5.2.3免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組ROCK的表達(dá)免疫組化檢測(cè)ROCK表達(dá)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈組織中ROCK表達(dá)較少，僅在內(nèi)皮細(xì)胞和少量中膜平滑肌細(xì)胞中可見(jiàn)弱陽(yáng)性染色。模型對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈組織中ROCK表達(dá)顯著增加，在內(nèi)皮細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞以及斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性染色，染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性染色區(qū)域廣泛分布。SL提取物各劑量組家兔頸總動(dòng)脈組織中ROCK表達(dá)較模型對(duì)照組有所減少，陽(yáng)性染色強(qiáng)度降低，染色區(qū)域縮小，尤其是SL提取物高劑量組，ROCK表達(dá)明顯減弱，陽(yáng)性染色區(qū)域局限于少數(shù)細(xì)胞，見(jiàn)圖2。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明模型對(duì)照組ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），SL提取物各劑量組ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比均低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性，其中SL提取物高劑量組與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。這表明SL提取物能夠抑制低切應(yīng)力介導(dǎo)的ROCK表達(dá)上調(diào)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，保護(hù)血管內(nèi)皮屏障功能。圖2：各組家兔頸總動(dòng)脈組織中ROCK免疫組化染色結(jié)果（×200）A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：SL提取物低劑量組；D：SL提取物中劑量組；E：SL提取物高劑量組表3：各組家兔頸總動(dòng)脈組織中ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比比較（x±s，n=6，%）組別ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比正常對(duì)照組12.6±2.2模型對(duì)照組35.8±4.0*SL提取物低劑量組28.5±3.3#SL提取物中劑量組20.6±3.0#SL提取物高劑量組15.2±2.5#注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。5.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)檢測(cè)和免疫組化技術(shù)，深入探究了SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制。分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，低切應(yīng)力可顯著激活MLCK、ROCK信號(hào)通路，使MLCK、ROCK蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致MLC磷酸化水平升高，p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平顯著增加。MLCK是一種Ca2?/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶，在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和細(xì)胞收縮過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。低切應(yīng)力作用下，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高，激活Ca2?/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物，進(jìn)而激活MLCK，使MLC磷酸化，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白相互作用增強(qiáng)，細(xì)胞收縮力增加，最終引起細(xì)胞骨架重構(gòu)和血管通透性升高。ROCK是RhoA的下游效應(yīng)分子，低切應(yīng)力激活RhoA后，ROCK被激活，通過(guò)磷酸化多種底物，如MLC磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞基（MYPT1），抑制MLC磷酸酶的活性，使MLC磷酸化水平升高，同樣導(dǎo)致細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架重構(gòu)。這些結(jié)果與前人研究一致，進(jìn)一步證實(shí)了低切應(yīng)力通過(guò)激活MLCK、ROCK信號(hào)通路，破壞血管內(nèi)皮屏障功能，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。給予SL提取物干預(yù)后，各劑量組MLCK、ROCK和p-MLC/MLC蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性。這表明SL提取物能夠有效抑制低切應(yīng)力激活的MLCK、ROCK信號(hào)通路，降低MLC磷酸化水平，從而發(fā)揮對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能的保護(hù)作用。SL提取物可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的升高，減少Ca2?/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制MLCK的激活；也可能通過(guò)抑制RhoA的活性，減少ROCK的激活，從而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，降低MLC磷酸化水平，維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定和血管內(nèi)皮屏障的完整性。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)論。正常對(duì)照組家兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞中MLCK、ROCK表達(dá)較弱，而模型對(duì)照組中MLCK、ROCK表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性染色區(qū)域增多且顏色加深。SL提取物各劑量組中MLCK、ROCK表達(dá)較模型對(duì)照組顯著減弱，陽(yáng)性染色強(qiáng)度降低，染色區(qū)域減少，高劑量組的改善作用最為顯著。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，也顯示模型對(duì)照組MLCK、ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比顯著高于正常對(duì)照組，SL提取物各劑量組MLCK、ROCK陽(yáng)性表達(dá)面積百分比均低于模型對(duì)照組，且呈劑量依賴性，高劑量組與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這直觀地表明SL提取物能夠抑制低切應(yīng)力誘導(dǎo)的MLCK、ROCK表達(dá)增加，減少相關(guān)蛋白在血管組織中的分布，從而對(duì)血管內(nèi)皮屏障功能起到保護(hù)作用。綜合以上結(jié)果，本研究認(rèn)為SL提取物對(duì)低切應(yīng)力介導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的抑制作用，其機(jī)制與抑制MLCK、ROCK信號(hào)通路密切相關(guān)。SL提取物通過(guò)抑制MLCK、ROCK的表達(dá)和活性，降低MLC磷酸化水平，減少細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮屏障功能，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究仍存在一定的局限性。雖然明確了SL提取物對(duì)MLCK、ROCK信號(hào)通路的抑制作用，但對(duì)于SL提取物如何具體調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路的分子機(jī)制，如是否通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)上游信號(hào)分子或蛋白磷酸酶的活性等，還需要進(jìn)一步深入研究。本研究?jī)H在動(dòng)物水平進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，缺乏細(xì)胞水平和分子水平的深入驗(yàn)證，未來(lái)可進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)研究，以更全面地揭示SL提取物的作用機(jī)制。六、SL提取物干預(yù)剪應(yīng)力介導(dǎo)的人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流的研究6.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)選用人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUAEC），購(gòu)自[細(xì)胞供應(yīng)商名稱]，細(xì)胞代數(shù)為[具體代數(shù)]。該細(xì)胞具有典型的“鵝卵石”形態(tài)，vWF/VIII因子和CD31染色陽(yáng)性，并且能夠攝取乙?；兔芏戎鞍?，廣泛參與了炎癥反應(yīng)、血管新生、免疫應(yīng)答、動(dòng)脈粥樣硬化、血管張力調(diào)節(jié)等生理及病理過(guò)程，為體外研究大血管內(nèi)皮細(xì)胞功能提供重要的研究載體。主要儀器包括：熒光顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度；酶標(biāo)儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），可對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）和二氧化碳濃度（5%）；離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞離心和上清液分離；超凈工作臺(tái)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境；平行板流室系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于模擬不同的剪應(yīng)力環(huán)境。實(shí)驗(yàn)材料有細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔、24孔，[品牌和規(guī)格]），用于細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)；移液槍及槍頭（不同規(guī)格，[品牌]），用于精確移取液體；細(xì)胞刮刀（[品牌和規(guī)格]），用于收集細(xì)胞；EP管（不同規(guī)格，[品牌]），用于儲(chǔ)存試劑和細(xì)胞樣品；載玻片和蓋玻片（[品牌和規(guī)格]），用于細(xì)胞涂片和熒光染色觀察。試劑與藥品方面，SL提取物由[提取單位或公司]提供，其純度經(jīng)檢測(cè)達(dá)到[具體純度數(shù)值]以上。鈣離子熒光探針Fluo-3/AM（[品牌和規(guī)格]），用于標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鈣離子；二甲基亞砜（DMSO，[純度和生產(chǎn)廠家]），用于溶解Fluo-3/AM；無(wú)鈣Hank's平衡鹽溶液（HBSS，[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞清洗和孵育；胎牛血清（FBS，[品牌和規(guī)格]），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（[品牌和規(guī)格]），滿足人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)需求；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（[品牌和規(guī)格]），防止細(xì)胞污染；胰蛋白酶-EDTA消化液（[品牌和規(guī)格]），用于細(xì)胞消化傳代。其他生化試劑包括氯化鈉（[純度和生產(chǎn)廠家]）、氯化鉀（[純度和生產(chǎn)廠家]）、氯化鈣（[純度和生產(chǎn)廠家]）、氯化鎂（[純度和生產(chǎn)廠家]）、葡萄糖（[純度和生產(chǎn)廠家]）等，用于配制各種緩沖液和溶液；HEPES（[純度和生產(chǎn)廠家]），用于維持溶液的pH值穩(wěn)定；牛血清白蛋白（BSA，[純度和生產(chǎn)廠家]），用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、低切應(yīng)力組、SL提取物低劑量干預(yù)組、SL提取物中劑量干預(yù)組和SL提取物高劑量干預(yù)組。正常對(duì)照組細(xì)胞在靜態(tài)條件下培養(yǎng)；低切應(yīng)力組細(xì)胞采用平行板流室系統(tǒng)給予[具體低切應(yīng)力數(shù)值]dyn/cm2的切應(yīng)力作用[具體作用時(shí)間]；SL提取物各干預(yù)組在給予低切應(yīng)力作用前，分別用[具體低劑量數(shù)值]μg/ml、[具體中劑量數(shù)值]μg/ml、[具體高劑量數(shù)值]μg/ml的SL提取物預(yù)處理細(xì)胞[具體預(yù)處理時(shí)間]。將干預(yù)后的細(xì)胞用無(wú)鈣HBSS清洗3次，加入含有5μMFluo-3/AM的無(wú)鈣HBSS，37℃孵育30-45min，使熒光探針進(jìn)入細(xì)胞并與鈣離子結(jié)合。孵育結(jié)束后，用無(wú)鈣HBSS再次清洗3次，去除未結(jié)合的熒光探針。將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，用特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化，并使用酶標(biāo)儀在[具體檢測(cè)波長(zhǎng)]下測(cè)定熒光強(qiáng)度值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用GraphPadPrism8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.2.1不同剪應(yīng)力誘導(dǎo)的[Ca2?]i的變化正常對(duì)照組人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在靜態(tài)條件下培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度處于基礎(chǔ)水平，其熒光強(qiáng)度值為[F0]。低切應(yīng)力組給予[具體低切應(yīng)力數(shù)值]dyn/cm2的切