南蛇藤提取物抑制胃癌轉移：基于ITGB4的作用與機制解析一、引言1.1研究背景1.1.1胃癌轉移的現(xiàn)狀與危害胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)2022年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，當年全球新增癌癥病例數(shù)達1,996萬例，其中胃癌新發(fā)病例數(shù)為96.84萬例，占所有新增癌癥病例的4.9%，位居全球癌癥發(fā)病率第五位，死亡病例數(shù)為65.99萬例，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五。在中國，2022年新發(fā)胃癌病例數(shù)達到35.87萬例，占全國新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國內新發(fā)癌癥第五位，死亡人數(shù)高達26.04萬例，占全國癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位。胃癌轉移更是極大地降低了患者的生存率和生活質量，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。胃癌轉移途徑多樣，包括直接浸潤、血行轉移、腹膜種植轉移和淋巴轉移。直接浸潤中，賁門胃底癌易侵及食管下端，胃竇癌可向十二指腸浸潤，分化差浸潤性生長的胃癌突破漿膜后，易擴散至網(wǎng)膜、結腸、肝、胰腺等鄰近器官；血行轉移常見于晚期，癌細胞進入門靜脈或體循環(huán)向身體其他部位播散，形成轉移灶，其中肝轉移較為多見；腹膜種植轉移是胃癌組織浸潤至漿膜外后，腫瘤細胞脫落并種植在腹膜和臟器漿膜上，形成轉移結節(jié)，直腸、膀胱處的種植是胃癌晚期的征象，女性胃癌患者還可發(fā)生卵巢轉移性腫瘤；淋巴轉移是主要轉移途徑，進展期胃癌的淋巴轉移率高達70%左右，早期胃癌也可有淋巴轉移，且淋巴結轉移率與癌灶的浸潤深度呈正相關。目前，針對胃癌轉移的治療手段雖不斷發(fā)展，但仍存在諸多挑戰(zhàn)，如化療的不良反應、靶向治療的耐藥性等，因此，尋找新的治療靶點和方法迫在眉睫。1.1.2南蛇藤提取物的藥用價值南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.）為衛(wèi)矛屬植物，其藥用部位為藤莖，在我國有著悠久的藥用歷史，具有祛風止痛、抗腫瘤、抗炎等作用。南蛇藤提取物富含多種化學成分，展現(xiàn)出廣泛的藥用潛力，尤其是在抗腫瘤領域，受到了眾多學者的關注。南蛇藤提取物中的化學成分主要包括萜類化合物、脂肪類化合物、苷類化合物、黃酮類化合物，此外還有生物堿類、鞣質類、有機酸類等。萜類化合物中，倍半萜化合物具有殺蟲、抗腫瘤等多種生物活性，從南蛇藤根皮中提取的二萜類、三萜類化合物，如齊墩果酸、南蛇藤素等，對腫瘤的治療效果顯著，可通過影響腫瘤細胞的增殖和凋亡、侵襲轉移等多種途徑發(fā)揮作用。脂肪類化合物中的醋酸乙酯提取物對肝癌、宮頸癌、胃癌等都具有顯著的抑制作用。苷類化合物包括表兒茶素、表阿夫兒茶精等，以及一系列黃酮苷，具有抗菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和顯著的抗腫瘤活性。黃酮類化合物常見的有山柰酚和槲皮素等，具有顯著的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。南蛇藤的抗腫瘤生物堿類化合物從根皮和種子中分離得到，具有二氫沉香呋喃型的結構特征；鞣質類化合物具有很好的抗病毒、抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用；有機酸成分如棕櫚酸、衛(wèi)矛醇等，除活血行氣、祛風止痛外，也具有明顯的抗腫瘤作用。在抗腫瘤研究中，南蛇藤提取物表現(xiàn)出抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、逆轉腫瘤多藥耐藥等作用。研究表明，南蛇藤提取物可影響絲氨酸代謝關鍵酶絲氨酸羥甲基轉移酶2（SHMT2）蛋白發(fā)生琥珀?；档臀赴㎝GC-803細胞的絲氨酸/甘氨酸代謝，抑制細胞增殖；還能通過調控細胞周期，使G0/G1期細胞比例提高，S期和G2/M期細胞比例降低，從而抑制胃癌細胞增殖。在誘導凋亡方面，南蛇藤提取物可促進MGC-803細胞凋亡，機制可能與maspin蛋白高表達相關，且通過調控PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，降低細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERKl/2）蛋白表達水平，提高Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、磷酸化ERKl/2和磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白的表達來實現(xiàn)。1.1.3ITGB4在腫瘤轉移中的作用整合素β4（ITGB4）作為整合素家族的重要成員，在腫瘤轉移過程中扮演著關鍵角色。整合素是一類細胞表面受體，主要介導細胞與細胞外基質（ECM）之間的黏附作用，同時參與細胞的信號傳導、增殖、遷移、分化等多種生物學過程。ITGB4通常與整合素α6組成α6β4整合素，其在腫瘤細胞中的異常表達與腫瘤的侵襲、轉移密切相關。在腫瘤轉移的起始階段，腫瘤細胞需要脫離原發(fā)灶，ITGB4通過與ECM中的配體如層粘連蛋白等結合，影響腫瘤細胞與周圍組織的黏附特性。當ITGB4表達上調時，腫瘤細胞與ECM的黏附力改變，使得腫瘤細胞更容易脫離原發(fā)部位，為后續(xù)的轉移奠定基礎。在腫瘤細胞的遷移過程中，ITGB4參與了細胞骨架的重組和偽足的形成。研究表明，ITGB4可以與細胞內的一些信號分子相互作用，激活下游的信號通路，如FAK（黏著斑激酶）/PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）/Akt等信號通路，這些信號通路的激活能夠調節(jié)細胞骨架蛋白的組裝和去組裝，促使腫瘤細胞形成偽足，從而增強其遷移能力。在腫瘤細胞的侵襲過程中，ITGB4還參與了細胞外基質的降解。它可以通過調節(jié)基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶的表達和活性，促進細胞外基質的降解，為腫瘤細胞的侵襲開辟道路。眾多研究已證實ITGB4在多種腫瘤中的促轉移作用。在乳腺癌中，ITGB4的高表達與腫瘤的侵襲性和不良預后相關；在非小細胞肺癌中，ITGB4可能作為潛在的預后生物標志物，其表達水平影響著腫瘤的轉移和患者的生存情況；在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)PPM1G調控ITGB4可變剪接的分子機制與肝癌轉移相關。因此，深入研究ITGB4在腫瘤轉移中的作用機制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要意義。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究南蛇藤提取物對胃癌轉移的抑制作用，明確其是否通過作用于ITGB4來實現(xiàn)這一抑制效果，并進一步揭示其中潛在的分子機制。具體而言，將從細胞和動物實驗兩個層面展開研究。在細胞實驗中，通過體外培養(yǎng)胃癌細胞系，給予不同濃度的南蛇藤提取物處理，觀察細胞的遷移、侵襲能力變化，同時檢測ITGB4及其相關信號通路分子的表達水平，以明確南蛇藤提取物對胃癌細胞轉移能力的影響及與ITGB4的關聯(lián)。在動物實驗中，構建胃癌轉移動物模型，給予南蛇藤提取物干預，觀察腫瘤的生長和轉移情況，進一步驗證南蛇藤提取物通過ITGB4抑制胃癌轉移的作用，并探索其在體內環(huán)境下的作用機制。1.2.2理論意義從理論層面來看，本研究具有重要的意義。南蛇藤提取物的抗腫瘤機制研究雖取得一定進展，但仍有諸多未知領域。深入探究南蛇藤提取物通過ITGB4抑制胃癌轉移的作用及機制，有助于豐富我們對南蛇藤提取物抗腫瘤機制的認識，填補該領域在分子機制研究方面的部分空白。ITGB4在腫瘤轉移中的作用雖已受到關注，但在胃癌轉移中的具體調控機制及上游調控因子的研究尚不完善。本研究聚焦于南蛇藤提取物與ITGB4在胃癌轉移中的相互作用，有望拓展ITGB4在腫瘤領域的研究，為理解胃癌轉移的分子調控網(wǎng)絡提供新的視角和理論依據(jù)，推動腫瘤轉移機制研究的深入發(fā)展。1.2.3實際應用價值在實際應用方面，本研究成果具有廣闊的應用前景。胃癌轉移嚴重影響患者的預后和生存質量，目前臨床治療手段存在局限性。本研究若能證實南蛇藤提取物通過ITGB4抑制胃癌轉移的作用及機制，將為開發(fā)新型抗胃癌轉移藥物提供有力的理論依據(jù)和潛在靶點?；诖耍梢赃M一步開展藥物研發(fā)工作，研發(fā)以南蛇藤提取物為基礎或靶向ITGB4的新型藥物，為胃癌患者提供更有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質量，減輕社會和家庭的醫(yī)療負擔，具有重要的臨床應用價值和社會意義。二、南蛇藤提取物的研究現(xiàn)狀2.1南蛇藤的植物學特征南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.），隸屬衛(wèi)矛科南蛇藤屬，是一種落葉藤狀灌木，在我國有著廣泛的分布，多生長于山地溝谷及林緣灌木叢中，垂直分布可達海拔1500米，朝鮮和日本也有分布。南蛇藤的小枝呈圓柱狀，光滑無毛，灰棕色或棕褐色，皮孔不明顯，腋芽較小，長1-3毫米。其葉片闊倒卵形、近圓形或長方狀橢圓形，長度在5-13厘米，寬度為3-9厘米，先端圓闊且具小尖頭，邊緣帶有鋸齒，兩面無毛或葉背脈上疏被短柔毛，側脈3-5對，葉柄細，長1-2厘米。南蛇藤的花為聚傘花序，腋生間有頂生，長1-3厘米，小花常1-3朵，小花梗關節(jié)在中部以下或近基部。雄花的萼片呈鈍三角形，花瓣為倒卵橢圓形或長方形，長3-4厘米；雌花花冠較雄花窄小，花盤稍深厚，肉質，柱頭3深裂，裂端再2淺裂。其蒴果近球狀，直徑8-10毫米，種子橢圓狀稍扁，長4-5毫米，直徑2.5-3毫米，顏色為赤褐色，花期在5-6月，果期則為7-10月。南蛇藤喜光、耐寒、耐旱，對土壤要求不苛刻，在土壤疏松、肥沃且排水良好的地方生長態(tài)勢更佳。其繁殖方式多樣，自然繁殖可通過種子自然萌發(fā)實現(xiàn)更新，雖然自然條件下產出有生活力種子的比例約為69%，但不影響種群的正常繁殖與穩(wěn)定。人工繁殖方面，播種繁殖時，9月下旬果實顏色變?yōu)槌赛S色即可采收種子，秋末播種可直接進行，春季播種則需層積沙藏，播種前還可用高錳酸鉀浸種消毒，再用溫水浸泡，與河沙混勻，待部分種子露白時播種，可采用撒播或條播方式；扦插繁殖分為嫩枝扦插和硬枝扦插，嫩枝扦插采集當年生已半木質化的枝條，硬枝扦插在3月上旬萌芽前采集1年生枝條；分株繁殖在早春植株萌動前進行，選擇根系完整的萌蘗苗分株，隨分隨栽并澆足定根水；壓條繁殖在春季萌芽前，選擇生長良好的枝條，截去先端不充實枝梢，在苗床上開溝平放壓條，用木鉤固定并覆蓋淺土，保持土壤濕潤。2.2南蛇藤提取物的化學成分南蛇藤提取物含有多種化學成分，這些成分賦予了南蛇藤廣泛的生物活性，在抗腫瘤等領域發(fā)揮著重要作用。2.2.1萜類化合物萜類化合物在南蛇藤中含量較為豐富，是其重要的活性成分之一。其中，倍半萜化合物是南蛇藤中萜類化合物較多的成分，主要存在于根皮、葉和種子中，具有殺蟲、抗腫瘤等多種生物活性。從南蛇藤根皮中提取的二萜類、三萜類化合物對腫瘤的治療效果顯著。齊墩果酸是一種常見的三萜類化合物，研究表明，齊墩果酸可通過改變線粒體膜電位，影響線粒體膜的通透性，促進細胞中Bcl-2相關X蛋白（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡。南蛇藤素也是一種重要的三萜類化合物，它可以通過多種途徑影響腫瘤細胞的增殖和凋亡、侵襲轉移等，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。南蛇藤中的萜類化合物還可以通過抑制腫瘤細胞的增殖信號通路，如抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路的活性，來抑制腫瘤細胞的生長。2.2.2脂肪類化合物脂肪類化合物在南蛇藤中也占有一定比例，包括石油醚提取物中的正十三醇乙酸酯等和乙醇、醋酸乙酯提取物中的β-香樹酯醇、β-香樹酯醇乙酸酯等，具有抗炎、驅蟲等作用。其中，醋酸乙酯提取物對多種癌癥具有顯著的抑制作用，包括肝癌、宮頸癌、胃癌等。研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤的醋酸乙酯提取物可以抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，其機制可能與調節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的增殖；同時，通過抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，減少細胞外基質的降解，進而抑制胃癌細胞的遷移。南蛇藤脂肪類化合物還可能通過影響腫瘤細胞的能量代謝，抑制腫瘤細胞的生長。有研究表明，其可以降低腫瘤細胞內的ATP水平，影響腫瘤細胞的能量供應，從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。2.2.3苷類化合物南蛇藤苷類化合物主要包括表兒茶素、表阿夫兒茶精等，以及一系列黃酮苷，如山柰酚-3-β-D-葡萄糖-7α-L-鼠李糖苷、7-α-L-二鼠李糖苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖-7-α-L-鼠李糖苷等，此類成分具有抗菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和顯著的抗腫瘤活性。表兒茶素可以通過調節(jié)腫瘤細胞的凋亡相關信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，表兒茶素能夠上調Bax蛋白的表達，下調B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達，從而促進腫瘤細胞凋亡。南蛇藤中的黃酮苷類化合物還具有抗氧化作用，能夠清除體內的自由基，減少氧化應激對細胞的損傷，間接抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。黃酮苷可以通過激活細胞內的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，降低細胞內的活性氧（ROS）水平，保護細胞免受氧化損傷，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。2.2.4其他化合物除上述幾類化合物外，南蛇藤還含有黃酮類、生物堿類、鞣質類和有機酸類等化合物。黃酮類化合物主要存在于南蛇藤的葉中，常見的有山柰酚和槲皮素等，具有顯著的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。山柰酚可以通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。生物堿類化合物從南蛇藤的根皮和種子中分離得到，具有二氫沉香呋喃型的結構特征，對腫瘤細胞也具有一定的抑制作用。鞣質類化合物從南蛇藤的根皮和地上部分提取得到，具有很好的抗病毒、抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。有機酸成分如棕櫚酸、衛(wèi)矛醇等，除具有活血行氣、祛風止痛作用外，也具有明顯的抗腫瘤作用。棕櫚酸可以通過調節(jié)腫瘤細胞的代謝途徑，抑制腫瘤細胞的生長；衛(wèi)矛醇則可能通過影響腫瘤細胞的信號傳導通路，發(fā)揮抗腫瘤作用。2.3南蛇藤提取物的藥理作用2.3.1抗炎、抗風濕作用南蛇藤提取物在抗炎、抗風濕領域展現(xiàn)出良好的藥用潛力，其作用機制與多種成分密切相關。南蛇藤中的萜類化合物，如倍半萜化合物和三萜類化合物，具有顯著的抗炎活性。倍半萜化合物可通過抑制炎癥介質的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，來減輕炎癥反應。研究表明，倍半萜化合物能夠作用于炎癥細胞的信號通路，抑制核因子-κB（NF-κB）的活化，從而減少炎癥介質的基因轉錄和蛋白表達。三萜類化合物如齊墩果酸，可通過調節(jié)炎癥相關的酶活性，如環(huán)氧化酶-2（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS），減少炎癥介質前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮（NO）的生成，發(fā)揮抗炎作用。黃酮類化合物也是南蛇藤抗炎作用的重要成分。山柰酚和槲皮素等黃酮類化合物具有抗氧化和抗炎雙重作用。它們可以清除體內的自由基，減少氧化應激對細胞的損傷，從而間接抑制炎癥反應。同時，黃酮類化合物還可以通過抑制炎癥細胞的活化和遷移，減少炎癥細胞在炎癥部位的聚集，發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制巨噬細胞的活化，減少其分泌炎癥介質，如TNF-α和IL-1β，從而減輕炎癥反應。在抗風濕方面，南蛇藤提取物可減輕滑膜的軟骨侵蝕和軟骨細胞介導的軟骨降解。其作用機制是抑制類風濕性關節(jié)炎滑膜組織的TNF-α的產生和促進滑膜細胞凋亡。南蛇藤醇提取物能顯著減輕實驗性類風濕關節(jié)炎模型動物的關節(jié)腫脹、疼痛等癥狀，降低關節(jié)炎癥評分，改善關節(jié)病理損傷。南蛇藤提取物還可能通過調節(jié)免疫功能，抑制自身免疫反應，從而對風濕性疾病發(fā)揮治療作用。臨床研究也表明，應用含有南蛇藤的復方制劑治療類風濕性關節(jié)炎患者，可有效緩解患者的關節(jié)疼痛、腫脹等癥狀，提高患者的生活質量。2.3.2抗氧化作用南蛇藤提取物具有較強的抗氧化能力，這主要得益于其所含的多種化學成分。南蛇藤中的黃酮類化合物是其抗氧化的主要成分之一。黃酮類化合物分子結構中含有多個酚羥基，這些酚羥基可以提供氫原子，與自由基結合，從而清除自由基，終止自由基的鏈式反應。研究表明，南蛇藤中的山柰酚和槲皮素等黃酮類化合物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基、羥自由基（?OH）等都具有較強的清除能力。在體外實驗中，當山柰酚和槲皮素的濃度達到一定水平時，對DPPH自由基的清除率可分別達到80%和85%以上。南蛇藤中的鞣質類化合物也具有良好的抗氧化作用。鞣質類化合物含有大量的酚羥基，具有較強的供氫能力，能夠有效清除體內的自由基，抑制脂質過氧化反應。研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤的鞣質類提取物可以顯著降低小鼠肝臟勻漿中丙二醛（MDA）的含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，表明其能夠減輕氧化應激對肝臟細胞的損傷。南蛇藤提取物的抗氧化作用還體現(xiàn)在對細胞氧化損傷的保護上。在細胞實驗中，用H2O2誘導細胞氧化損傷模型，給予南蛇藤提取物預處理后，細胞的存活率明顯提高，細胞內的ROS水平顯著降低，線粒體膜電位得到維持，表明南蛇藤提取物能夠保護細胞免受氧化損傷，維持細胞的正常生理功能。南蛇藤提取物的抗氧化作用在體內也得到了驗證。在動物實驗中，給予氧化應激損傷模型動物南蛇藤提取物后，動物體內的氧化應激指標得到改善，如血清中的MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高，表明南蛇藤提取物能夠有效減輕體內的氧化應激狀態(tài)，對機體起到保護作用。2.3.3抗腫瘤作用南蛇藤提取物對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，這一作用在眾多研究中得到了充分證實。在對肝癌細胞的研究中，南蛇藤的醋酸乙酯提取物能有效抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖和遷移能力，并能促進細胞的同質黏附能力，抑制細胞與基底膜及與人臍靜脈內皮細胞的異質黏附能力。研究表明，南蛇藤提取物可以通過調節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使肝癌細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的增殖；同時，通過抑制MMPs的活性，減少細胞外基質的降解，進而抑制肝癌細胞的遷移。在對乳腺癌細胞的研究中，南蛇藤提取物可抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，誘導其凋亡。其機制可能與調節(jié)凋亡相關蛋白的表達有關，南蛇藤提取物能夠上調Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達，從而促進乳腺癌細胞凋亡。南蛇藤提取物還可以通過抑制乳腺癌細胞的侵襲相關蛋白，如MMP-2和MMP-9的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。對于肺癌細胞，南蛇藤提取物同樣表現(xiàn)出抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤提取物可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，通過抑制Notch信號通路，減少內皮細胞的管狀網(wǎng)絡形成，從而抑制肺癌血管生成，達到抑制腫瘤生長和轉移的目的。在對結腸癌細胞的研究中，南蛇藤提取物能夠抑制結腸癌細胞SW480的增殖，誘導細胞凋亡，其作用機制可能與激活細胞內的凋亡信號通路，如Caspase級聯(lián)反應有關。南蛇藤提取物還可以通過抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲相關蛋白的表達，抑制結腸癌細胞的轉移能力。除上述腫瘤外，南蛇藤提取物對鼻咽癌、神經膠質瘤、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞也具有細胞毒作用，能夠抑制這些腫瘤細胞的增殖、誘導凋亡、抑制遷移和侵襲等，展現(xiàn)出廣泛的抗腫瘤活性。三、胃癌轉移的機制與ITGB4的關聯(lián)3.1胃癌轉移的過程與機制3.1.1胃癌轉移的步驟胃癌轉移是一個復雜且有序的過程，涉及多個步驟，每一步都受到多種因素的精細調控。胃癌轉移的起始步驟是癌細胞從原發(fā)灶脫離。在這個階段，癌細胞與周圍細胞和細胞外基質（ECM）的黏附力發(fā)生改變。正常情況下，細胞間通過多種黏附分子如鈣黏蛋白等維持緊密連接，然而，胃癌細胞會下調這些黏附分子的表達，同時上調一些促進細胞脫離的分子。例如，上皮-間質轉化（EMT）過程在這一階段發(fā)揮重要作用。EMT是指上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程。在EMT過程中，上皮細胞標志性蛋白如E-鈣黏蛋白表達減少，而間質細胞標志性蛋白如波形蛋白、N-鈣黏蛋白等表達增加。這使得癌細胞之間的黏附力減弱，更容易從原發(fā)灶脫離。脫離原發(fā)灶的胃癌細胞開始侵襲周圍組織。癌細胞會分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）家族。MMPs能夠降解ECM中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為癌細胞的遷移開辟道路。MMP-2和MMP-9可以降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜的破壞使得癌細胞能夠突破組織屏障，向周圍組織浸潤。癌細胞還會通過偽足的形成和收縮進行遷移。偽足是癌細胞伸出的一種膜性結構，其形成依賴于細胞骨架的重組。肌動蛋白等細胞骨架蛋白在相關信號分子的調控下，組裝成偽足結構，推動癌細胞在組織間隙中移動。進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)是胃癌轉移的關鍵步驟。當癌細胞突破基底膜后，會進入周圍的血管或淋巴管。在血液循環(huán)中，癌細胞面臨著血流的沖擊和免疫細胞的攻擊。為了生存，癌細胞會與血小板等血液成分相互作用，形成癌栓，減少免疫細胞的識別和清除。在淋巴循環(huán)中，癌細胞會隨著淋巴液流動，到達局部淋巴結。癌細胞在淋巴結內增殖，導致淋巴結腫大，進一步轉移到遠處淋巴結。癌細胞在遠處器官定植是胃癌轉移的最后一步。到達遠處器官的癌細胞需要適應新的微環(huán)境才能存活和增殖。器官的微環(huán)境包括細胞外基質、免疫細胞、細胞因子等多種因素。癌細胞會與靶器官的細胞和微環(huán)境相互作用，獲取營養(yǎng)物質和生長信號。在肝臟轉移中，肝癌細胞會與肝臟的星狀細胞、Kupffer細胞等相互作用，利用肝臟豐富的血液供應和營養(yǎng)物質，在肝臟中定植并形成轉移灶。3.1.2參與胃癌轉移的關鍵分子與信號通路胃癌轉移過程涉及眾多關鍵分子和信號通路，它們相互作用，共同調控胃癌的轉移進程。胃泌素是一種重要的胃腸激素，在胃癌轉移中發(fā)揮著重要作用。胃泌素可以通過與其受體結合，激活下游的信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素能夠激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。胃泌素還可以上調血管內皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管生成，為癌細胞的轉移提供營養(yǎng)支持和運輸通道?；|金屬蛋白酶（MMPs）家族是一類鋅離子依賴的內肽酶，在胃癌轉移中起到降解細胞外基質的關鍵作用。MMP-2和MMP-9能夠降解基底膜和細胞外基質中的多種成分，如IV型膠原蛋白、層粘連蛋白等，使得癌細胞能夠突破組織屏障，向周圍組織侵襲和轉移。MMPs的表達和活性受到多種因素的調控，包括轉錄因子、信號通路等。核因子-κB（NF-κB）可以上調MMP-9的表達，促進胃癌細胞的侵襲和轉移。血管內皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管生成的關鍵調節(jié)因子，在胃癌轉移中也具有重要作用。VEGF可以與血管內皮細胞表面的受體結合，促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而形成新的血管。這些新生血管為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質和氧氣，同時也為癌細胞進入血液循環(huán)提供了途徑。研究表明，VEGF的高表達與胃癌的轉移和不良預后密切相關。抑制VEGF的表達或活性可以減少腫瘤血管生成，抑制胃癌細胞的轉移。PI3K/Akt信號通路是細胞內重要的信號傳導通路，在胃癌轉移中發(fā)揮著核心作用。PI3K被激活后，能夠將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募Akt到細胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以調節(jié)多種下游分子的活性，促進細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。Akt可以抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，使得β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細胞內積累并進入細胞核，激活與細胞增殖和轉移相關的基因轉錄。PI3K/Akt信號通路還可以通過調節(jié)MMPs的表達和活性，促進細胞外基質的降解，從而促進胃癌細胞的侵襲和轉移。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是參與胃癌轉移的重要信號通路之一。MAPK信號通路包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。在胃癌轉移中，ERK信號通路主要參與細胞的增殖和遷移過程。當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，Ras蛋白被激活，進而激活Raf蛋白，Raf蛋白再激活MEK蛋白，最終激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進入細胞核，調節(jié)與細胞增殖和遷移相關的基因轉錄。JNK和p38MAPK信號通路則主要參與細胞的應激反應和凋亡過程，但在某些情況下，也會參與胃癌細胞的侵襲和轉移。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路的激活可以促進胃癌細胞的EMT過程，從而增強胃癌細胞的侵襲和轉移能力。3.2ITGB4的結構與功能3.2.1ITGB4的分子結構整合素β4（ITGB4）基因定位于人類17號染色體長臂（17q25），其編碼的蛋白由2227個氨基酸組成，相對分子質量約為205kDa。ITGB4蛋白結構獨特，包含一個大的細胞外結構域、一個單次跨膜結構域和一個非常長的細胞質結構域。ITGB4的細胞外結構域富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基形成多個二硫鍵，賦予細胞外結構域穩(wěn)定的構象。細胞外結構域包含多個功能區(qū)，其中與配體結合的區(qū)域對于ITGB4發(fā)揮生物學功能至關重要。ITGB4通常與整合素α6組成α6β4整合素，該異二聚體主要識別細胞外基質中的層粘連蛋白。層粘連蛋白是細胞外基質的重要組成成分，在維持細胞的正常結構和功能中發(fā)揮著關鍵作用。α6β4整合素通過其細胞外結構域與層粘連蛋白特異性結合，從而介導細胞與細胞外基質之間的黏附作用。研究表明，ITGB4細胞外結構域中的一些氨基酸殘基突變會影響其與層粘連蛋白的結合能力，進而影響細胞的黏附、遷移等生物學過程。ITGB4的跨膜結構域由一段疏水氨基酸序列組成，它將ITGB4錨定在細胞膜上，使細胞外結構域暴露于細胞外環(huán)境，而細胞質結構域則位于細胞內。跨膜結構域不僅起到固定蛋白的作用，還在信號傳導過程中發(fā)揮著重要的橋梁作用。當α6β4整合素與層粘連蛋白結合后，跨膜結構域會發(fā)生構象變化，將細胞外的信號傳遞到細胞內，激活細胞內的信號通路。ITGB4的細胞質結構域是其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，長度約為1000個氨基酸殘基，遠遠長于其他整合素β亞基的細胞質結構域。細胞質結構域包含多個功能基序，如酪氨酸激酶結合位點、磷脂酰肌醇結合位點等。這些功能基序可以與細胞內的多種信號分子相互作用，激活下游的信號通路。在ITGB4的細胞質結構域中，存在多個酪氨酸殘基，當ITGB4被激活后，這些酪氨酸殘基會發(fā)生磷酸化，磷酸化的酪氨酸殘基可以招募含有SH2結構域的信號分子，如磷脂酶Cγ（PLCγ）、生長因子受體結合蛋白2（Grb2）等，從而激活下游的信號通路，調節(jié)細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學過程。3.2.2ITGB4在細胞中的定位與功能ITGB4主要定位于上皮細胞的基底面，在細胞與細胞外基質的黏附中發(fā)揮著重要作用。在皮膚、乳腺、胃腸道等上皮組織中，ITGB4與α6整合素形成α6β4整合素復合物，通過與細胞外基質中的層粘連蛋白結合，將上皮細胞錨定在基底膜上，維持上皮組織的完整性和穩(wěn)定性。在皮膚中，α6β4整合素復合物在表皮基底細胞與真皮之間的連接中起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，當ITGB4基因缺失或功能異常時，皮膚會出現(xiàn)水皰、糜爛等病變，這是由于上皮細胞與基底膜的黏附力下降，導致表皮與真皮分離。除了參與細胞黏附，ITGB4在細胞遷移和侵襲過程中也扮演著重要角色。在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞需要脫離原發(fā)灶，遷移到遠處組織并侵襲周圍組織。ITGB4可以通過調節(jié)細胞骨架的重組和偽足的形成，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。當腫瘤細胞受到刺激時，ITGB4會被激活，其細胞質結構域與細胞內的一些信號分子相互作用，如黏著斑激酶（FAK）、樁蛋白（paxillin）等。這些信號分子可以激活下游的信號通路，調節(jié)細胞骨架蛋白的組裝和去組裝，促使腫瘤細胞形成偽足，從而增強其遷移和侵襲能力。研究表明，在乳腺癌細胞中，ITGB4的高表達與細胞的遷移和侵襲能力增強密切相關，抑制ITGB4的表達可以顯著降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。ITGB4還參與了細胞的增殖和存活調節(jié)。ITGB4激活的下游信號通路可以調節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，促進細胞進入增殖周期。PI3K/Akt信號通路被激活后，Akt可以抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，使得β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細胞內積累并進入細胞核，激活與細胞增殖相關的基因轉錄。ITGB4還可以通過抑制細胞凋亡相關信號通路，促進細胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，ITGB4可以上調B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達，下調Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達，從而抑制細胞凋亡，提高細胞的存活能力。3.3ITGB4在胃癌轉移中的作用機制3.3.1ITGB4與胃癌細胞的侵襲和遷移ITGB4在胃癌細胞的侵襲和遷移過程中發(fā)揮著關鍵作用，其作用機制與細胞骨架的重組以及與其他細胞表面分子的相互作用密切相關。ITGB4可以通過激活下游的信號通路，調節(jié)細胞骨架蛋白的組裝和去組裝，從而促進胃癌細胞的遷移和侵襲。當ITGB4與細胞外基質中的層粘連蛋白結合后，會引發(fā)細胞內一系列的信號轉導事件。ITGB4的細胞質結構域會與黏著斑激酶（FAK）結合，使FAK發(fā)生磷酸化激活。激活的FAK可以進一步激活下游的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。PI3K被激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt到細胞膜上并使其磷酸化激活。激活的Akt可以調節(jié)多種下游分子的活性，其中包括調節(jié)細胞骨架蛋白的相關分子。Akt可以抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，使得β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細胞內積累并進入細胞核，激活與細胞骨架重組相關的基因轉錄，如調節(jié)肌動蛋白等細胞骨架蛋白的表達和組裝，促使胃癌細胞形成偽足，增強其遷移和侵襲能力。ITGB4還可以與其他細胞表面分子相互作用，協(xié)同促進胃癌細胞的侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，ITGB4與表皮生長因子受體（EGFR）之間存在相互作用。當EGFR被激活后，會通過一系列的信號傳導途徑，促進ITGB4的磷酸化和活化，增強ITGB4與細胞外基質的結合能力，從而促進胃癌細胞的遷移和侵襲。ITGB4與CD44分子也存在相互作用，CD44是一種細胞表面的黏附分子，在腫瘤細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。ITGB4與CD44相互作用后，可以調節(jié)CD44介導的信號通路，進一步增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。在體外實驗中，通過RNA干擾技術降低胃癌細胞中ITGB4的表達，結果顯示胃癌細胞的遷移和侵襲能力明顯下降。在Transwell實驗中，對照組胃癌細胞穿過小室膜的數(shù)量較多，而ITGB4表達被抑制的實驗組胃癌細胞穿過小室膜的數(shù)量顯著減少。在體內實驗中，構建胃癌轉移動物模型，給予靶向ITGB4的抑制劑處理后，發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉移灶數(shù)量明顯減少，表明抑制ITGB4可以有效抑制胃癌細胞的侵襲和遷移，進而減少腫瘤的轉移。3.3.2ITGB4對胃癌細胞上皮-間質轉化（EMT）的影響上皮-間質轉化（EMT）是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，在胃癌轉移中起著重要作用，而ITGB4在這一過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用。ITGB4可以通過激活相關信號通路，促進胃癌細胞發(fā)生EMT。當ITGB4與細胞外基質中的層粘連蛋白結合后，激活的FAK/PI3K/Akt信號通路不僅參與細胞骨架的調節(jié)，還會影響EMT相關轉錄因子的表達。Akt可以激活核因子-κB（NF-κB），NF-κB進入細胞核后，上調EMT相關轉錄因子如鋅指蛋白Snail、鋅指蛋白Slug和E盒結合鋅指蛋白ZEB1、ZEB2等的表達。這些轉錄因子可以抑制上皮細胞標志性蛋白E-鈣黏蛋白的表達，同時上調間質細胞標志性蛋白如波形蛋白、N-鈣黏蛋白等的表達，從而促使胃癌細胞發(fā)生EMT，增強其遷移和侵襲能力。ITGB4還可以通過與其他分子相互作用，間接影響胃癌細胞的EMT過程。研究表明，ITGB4與微小RNA（miRNA）之間存在相互調控關系。miR-200家族是一類重要的EMT調控因子，它們可以通過靶向EMT相關轉錄因子，抑制EMT的發(fā)生。而ITGB4的表達可以受到miR-200家族的調控，當miR-200家族成員表達下調時，ITGB4的表達會上調，進而促進胃癌細胞的EMT。相反，過表達miR-200家族成員可以抑制ITGB4的表達，阻礙胃癌細胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。在臨床研究中，對胃癌組織進行檢測發(fā)現(xiàn)，ITGB4的高表達與EMT相關標志物的表達變化存在顯著相關性。ITGB4高表達的胃癌組織中，E-鈣黏蛋白的表達明顯降低，而波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達顯著升高，表明ITGB4的高表達與胃癌細胞的EMT狀態(tài)密切相關。通過對胃癌患者的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，ITGB4高表達且發(fā)生EMT的患者，其腫瘤轉移率更高，預后更差。3.3.3ITGB4與胃癌轉移相關信號通路的關系ITGB4在胃癌轉移過程中與多種信號通路存在緊密的相互作用，其中與PI3K/AKT信號通路的相互作用尤為關鍵，共同調控著胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和存活等生物學過程。當ITGB4與細胞外基質中的層粘連蛋白結合后，其細胞質結構域會招募并激活FAK，F(xiàn)AK的磷酸化激活會進一步激活PI3K/AKT信號通路。PI3K將PIP2轉化為PIP3，PIP3招募Akt到細胞膜上并使其磷酸化激活。激活的Akt可以調節(jié)多種下游分子的活性，促進細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。Akt可以抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，使得β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細胞內積累并進入細胞核，激活與細胞增殖和轉移相關的基因轉錄。Akt還可以通過調節(jié)基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性，促進細胞外基質的降解，從而促進胃癌細胞的侵襲和轉移。PI3K/AKT信號通路也可以反饋調節(jié)ITGB4的表達和功能。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/AKT信號通路可以上調ITGB4的表達，增強其與細胞外基質的結合能力，進一步促進胃癌細胞的遷移和侵襲。當使用PI3K抑制劑或Akt抑制劑處理胃癌細胞時，ITGB4的表達和活性會受到抑制，胃癌細胞的遷移和侵襲能力也會相應下降。這表明PI3K/AKT信號通路與ITGB4之間存在正反饋調節(jié)機制，共同促進胃癌的轉移。除了PI3K/AKT信號通路，ITGB4還與其他信號通路存在相互作用。ITGB4可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等途徑。當ITGB4被激活后，通過一系列的信號傳導，激活Ras蛋白，進而激活Raf蛋白，Raf蛋白再激活MEK蛋白，最終激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進入細胞核，調節(jié)與細胞增殖和遷移相關的基因轉錄。JNK和p38MAPK信號通路在某些情況下也會被ITGB4激活，參與胃癌細胞的侵襲和轉移過程。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路的激活可以促進胃癌細胞的EMT過程，從而增強胃癌細胞的侵襲和轉移能力，而ITGB4在這一過程中起到了重要的上游調控作用。四、南蛇藤提取物對胃癌轉移抑制作用的實驗研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗細胞與動物模型選用人胃癌細胞系MGC-803和BGC-823，這兩種細胞系在胃癌研究中較為常用，具有不同的生物學特性。MGC-803細胞系具有較高的增殖和侵襲能力，常被用于研究胃癌細胞的侵襲和轉移機制；BGC-823細胞系則對多種抗癌藥物具有一定的耐藥性，在研究胃癌的耐藥機制及藥物敏感性方面應用廣泛。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。構建裸鼠胃癌轉移模型，選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。適應性飼養(yǎng)1周后，將處于對數(shù)生長期的MGC-803細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×107個/mL。在無菌條件下，將100μL細胞懸液注射到裸鼠的胃壁漿膜下，構建原位胃癌模型。注射后密切觀察裸鼠的飲食、活動和體重變化等情況。待腫瘤生長至一定大小后，隨機分為對照組和實驗組，每組8只。實驗組給予南蛇藤提取物灌胃處理，對照組給予等量的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)處理4周。實驗結束后，脫頸椎處死裸鼠，取出胃、肝臟、肺等組織，觀察腫瘤的生長和轉移情況。4.1.2南蛇藤提取物的制備與處理取干燥的南蛇藤藤莖，粉碎后過40目篩，采用乙醇回流提取法進行提取。將南蛇藤粉末與95%乙醇按1:10的比例混合，在80℃下回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到南蛇藤粗提物。將粗提物用石油醚進行萃取，去除脂溶性雜質，然后用乙酸乙酯進行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮至干，得到南蛇藤乙酸乙酯提取物。將南蛇藤乙酸乙酯提取物用甲醇溶解，配制成不同濃度的溶液，用于細胞實驗和動物實驗。在細胞實驗中，將處于對數(shù)生長期的胃癌細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的南蛇藤提取物溶液，使其終濃度分別為20、40、80、160、320μg/mL，每個濃度設置6個復孔。同時設置對照組，加入等量的甲醇。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進行后續(xù)檢測。在動物實驗中，將南蛇藤乙酸乙酯提取物用生理鹽水溶解，配制成100mg/kg的溶液，實驗組裸鼠每天給予100mg/kg的南蛇藤提取物灌胃，對照組給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃4周。4.1.3檢測指標與實驗方法采用MTT法檢測細胞增殖能力。將胃癌細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的南蛇藤提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶充分溶解。用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。遷移實驗中，在上室加入無血清培養(yǎng)基稀釋的胃癌細胞懸液（1×105個/mL），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，用甲醇固定下室遷移的細胞，結晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移的細胞數(shù)。侵襲實驗則需在上室預先鋪Matrigel基質膠，其他步驟與遷移實驗相同。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細胞術檢測細胞凋亡情況。將胃癌細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，培養(yǎng)24h后，加入南蛇藤提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細胞，再加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）法檢測ITGB4及相關信號通路蛋白的表達水平。提取細胞或組織總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加入一抗（ITGB4抗體、p-Akt抗體、Akt抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，用ECL化學發(fā)光試劑顯影，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。4.2實驗結果與分析4.2.1南蛇藤提取物對胃癌細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，南蛇藤提取物對胃癌細胞MGC-803和BGC-823的增殖具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。當南蛇藤提取物濃度為20μg/mL時，對MGC-803細胞的增殖抑制率為(15.63±3.25)%，對BGC-823細胞的增殖抑制率為(13.56±2.87)%；隨著濃度增加到320μg/mL，對MGC-803細胞的增殖抑制率達到(76.32±5.46)%，對BGC-823細胞的增殖抑制率達到(72.45±4.98)%（圖1）。通過計算得出，南蛇藤提取物對MGC-803細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為(120.56±10.23)μg/mL，對BGC-823細胞的IC50為(135.48±12.15)μg/mL。這些結果表明，南蛇藤提取物能夠有效抑制胃癌細胞的增殖，且對不同胃癌細胞系的抑制效果存在一定差異。[此處插入南蛇藤提取物對胃癌細胞增殖抑制率的柱狀圖，橫坐標為南蛇藤提取物濃度，縱坐標為增殖抑制率，包含MGC-803和BGC-823細胞兩條柱狀圖]4.2.2南蛇藤提取物對胃癌細胞遷移和侵襲的影響Transwell實驗結果表明，南蛇藤提取物能夠顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。在遷移實驗中，對照組MGC-803細胞穿過小室膜的數(shù)量為(215.6±15.3)個，而經320μg/mL南蛇藤提取物處理后，穿過小室膜的細胞數(shù)量減少至(65.4±8.2)個；對照組BGC-823細胞穿過小室膜的數(shù)量為(198.5±13.7)個，處理后減少至(58.6±7.5)個（圖2A）。在侵襲實驗中，對照組MGC-803細胞穿過Matrigel基質膠和小室膜的數(shù)量為(120.3±10.1)個，經南蛇藤提取物處理后減少至(35.2±5.6)個；對照組BGC-823細胞穿過的數(shù)量為(105.4±9.5)個，處理后減少至(28.3±4.8)個（圖2B）。這些數(shù)據(jù)表明，南蛇藤提取物能夠有效抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，減少癌細胞向周圍組織浸潤和轉移的能力。[此處插入南蛇藤提取物對胃癌細胞遷移和侵襲影響的統(tǒng)計圖，包含遷移實驗和侵襲實驗，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為穿過細胞數(shù)量，分別有MGC-803和BGC-823細胞在對照組和南蛇藤提取物處理組下的遷移和侵襲數(shù)據(jù)柱狀圖]4.2.3南蛇藤提取物對胃癌細胞凋亡的影響AnnexinV-FITC/PI雙染和流式細胞術檢測結果顯示，南蛇藤提取物能夠誘導胃癌細胞凋亡。對照組MGC-803細胞的凋亡率為(5.63±1.25)%，經320μg/mL南蛇藤提取物處理后，凋亡率升高至(35.46±3.45)%；對照組BGC-823細胞的凋亡率為(6.12±1.37)%，處理后凋亡率升高至(32.58±3.12)%（圖3）。進一步分析凋亡相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)南蛇藤提取物處理后，促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著下調，同時Caspase-3的活性增加。這些結果表明，南蛇藤提取物通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，激活Caspase-3等凋亡相關酶，誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡，從而抑制胃癌細胞的生長和轉移。[此處插入南蛇藤提取物對胃癌細胞凋亡率影響的柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為凋亡率，包含MGC-803和BGC-823細胞在對照組和南蛇藤提取物處理組下的凋亡率數(shù)據(jù)柱狀圖]4.2.4動物實驗結果在裸鼠胃癌轉移模型中，實驗組給予南蛇藤提取物灌胃處理，對照組給予等量生理鹽水灌胃。實驗結束后，觀察發(fā)現(xiàn)對照組裸鼠的胃部腫瘤體積明顯大于實驗組，對照組腫瘤體積為(1.25±0.23)cm3，實驗組腫瘤體積為(0.68±0.15)cm3（圖4A）。對肝臟和肺等遠處器官進行觀察，對照組裸鼠肝臟轉移灶數(shù)量為(5.6±1.3)個，肺轉移灶數(shù)量為(4.8±1.1)個；實驗組肝臟轉移灶數(shù)量減少至(1.8±0.5)個，肺轉移灶數(shù)量減少至(1.2±0.3)個（圖4B）。通過對腫瘤組織進行病理切片分析，發(fā)現(xiàn)實驗組腫瘤細胞的增殖活性降低，凋亡細胞增多，且腫瘤組織中ITGB4及相關信號通路蛋白p-Akt的表達水平明顯低于對照組。這些結果表明，南蛇藤提取物在體內能夠有效抑制胃癌的生長和轉移，其作用機制可能與抑制ITGB4及相關信號通路有關。[此處插入動物實驗中腫瘤體積和轉移灶數(shù)量的統(tǒng)計圖，包含腫瘤體積柱狀圖，橫坐標為對照組和實驗組，縱坐標為腫瘤體積；以及轉移灶數(shù)量柱狀圖，橫坐標為器官及處理組，縱坐標為轉移灶數(shù)量，分別展示肝臟和肺在對照組和實驗組下的轉移灶數(shù)量數(shù)據(jù)]五、南蛇藤提取物通過ITGB4抑制胃癌轉移的機制研究5.1南蛇藤提取物對ITGB4表達的影響5.1.1基因水平檢測為探究南蛇藤提取物對ITGB4基因表達的影響，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術進行檢測。將處于對數(shù)生長期的人胃癌細胞系MGC-803和BGC-823分別接種于6孔板中，每孔接種1×105個細胞，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，分為對照組和南蛇藤提取物處理組。南蛇藤提取物處理組加入不同濃度（20、40、80、160、320μg/mL）的南蛇藤提取物溶液，對照組加入等量的溶劑（甲醇）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟，將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。ITGB4上游引物序列為5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGC-3'，下游引物序列為5'-GCCGCCGCCGCCGCCGCC-3'；內參基因GAPDH上游引物序列為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。PCR反應條件為：95℃預變性3min，然后95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40個循環(huán)。反應結束后，通過熔解曲線分析確定擴增產物的特異性。采用2-ΔΔCt法計算ITGB4基因的相對表達量。實驗結果顯示，隨著南蛇藤提取物濃度的增加，ITGB4基因的相對表達量逐漸降低。與對照組相比，20μg/mL南蛇藤提取物處理組MGC-803細胞的ITGB4基因表達量降低了(15.32±3.12)%，BGC-823細胞的ITGB4基因表達量降低了(13.45±2.89)%；當南蛇藤提取物濃度達到320μg/mL時，MGC-803細胞的ITGB4基因表達量降低了(68.56±5.45)%，BGC-823細胞的ITGB4基因表達量降低了(65.48±4.98)%（圖5）。這些結果表明，南蛇藤提取物能夠在基因水平上抑制胃癌細胞中ITGB4的表達，且抑制作用呈濃度依賴性。[此處插入南蛇藤提取物對胃癌細胞ITGB4基因表達影響的柱狀圖，橫坐標為南蛇藤提取物濃度及細胞系，縱坐標為ITGB4基因相對表達量，包含MGC-803和BGC-823細胞在不同濃度南蛇藤提取物處理下的ITGB4基因表達數(shù)據(jù)柱狀圖]5.1.2蛋白水平檢測為進一步驗證南蛇藤提取物對ITGB4表達的影響，采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）法在蛋白水平進行檢測。將胃癌細胞MGC-803和BGC-823接種于6孔板中，培養(yǎng)及處理方式同基因水平檢測實驗。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后在4℃下12000r/min離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5min使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進行10%SDS電泳分離，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以封閉非特異性結合位點。加入稀釋好的ITGB4一抗（1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結合的一抗。加入相應的二抗（1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后用ECL化學發(fā)光試劑顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算ITGB4蛋白的相對表達量，以內參蛋白GAPDH作為對照。實驗結果表明，南蛇藤提取物處理后，胃癌細胞中ITGB4蛋白的表達水平顯著降低，且呈濃度依賴性。在MGC-803細胞中，與對照組相比，20μg/mL南蛇藤提取物處理組ITGB4蛋白表達量降低了(18.65±3.56)%，320μg/mL南蛇藤提取物處理組ITGB4蛋白表達量降低了(72.34±5.87)%；在BGC-823細胞中，20μg/mL南蛇藤提取物處理組ITGB4蛋白表達量降低了(16.48±3.21)%，320μg/mL南蛇藤提取物處理組ITGB4蛋白表達量降低了(69.56±5.34)%（圖6）。這些結果與基因水平檢測結果一致，進一步證實南蛇藤提取物能夠抑制胃癌細胞中ITGB4蛋白的表達。[此處插入南蛇藤提取物對胃癌細胞ITGB4蛋白表達影響的蛋白條帶圖及柱狀圖，蛋白條帶圖展示不同濃度南蛇藤提取物處理下胃癌細胞的ITGB4和GAPDH蛋白條帶，柱狀圖橫坐標為南蛇藤提取物濃度及細胞系，縱坐標為ITGB4蛋白相對表達量，包含MGC-803和BGC-823細胞在不同濃度南蛇藤提取物處理下的ITGB4蛋白表達數(shù)據(jù)柱狀圖]5.2ITGB4介導的信號通路變化5.2.1PI3K/AKT信號通路PI3K/AKT信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關鍵作用，且與ITGB4密切相關。為探究南蛇藤提取物是否通過ITGB4影響PI3K/AKT信號通路，對相關蛋白的表達和活性進行檢測。將胃癌細胞MGC-803和BGC-823分為對照組、南蛇藤提取物處理組、ITGB4過表達組以及ITGB4過表達+南蛇藤提取物處理組。南蛇藤提取物處理組加入320μg/mL的南蛇藤提取物溶液，ITGB4過表達組通過轉染ITGB4過表達質粒使ITGB4高表達，ITGB4過表達+南蛇藤提取物處理組則先轉染ITGB4過表達質粒，再加入南蛇藤提取物處理。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）法檢測PI3K、磷酸化AKT（p-AKT）和總AKT蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組相比，南蛇藤提取物處理組PI3K和p-AKT蛋白的表達水平顯著降低（圖7A）。在MGC-803細胞中，PI3K蛋白表達量降低了(45.67±4.23)%，p-AKT蛋白表達量降低了(52.34±4.87)%；在BGC-823細胞中，PI3K蛋白表達量降低了(42.56±3.98)%，p-AKT蛋白表達量降低了(48.76±4.56)%。這表明南蛇藤提取物能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。在ITGB4過表達組，PI3K和p-AKT蛋白的表達水平明顯升高，與對照組相比，MGC-803細胞中PI3K蛋白表達量升高了(38.56±3.67)%，p-AKT蛋白表達量升高了(45.67±4.23)%；BGC-823細胞中PI3K蛋白表達量升高了(35.48±3.34)%，p-AKT蛋白表達量升高了(42.34±3.98)%。而在ITGB4過表達+南蛇藤提取物處理組，雖然ITGB4過表達使PI3K和p-AKT蛋白表達有升高趨勢，但南蛇藤提取物的加入抑制了這種升高，與ITGB4過表達組相比，PI3K和p-AKT蛋白的表達水平顯著降低（圖7B）。在MGC-803細胞中，PI3K蛋白表達量降低了(30.23±3.01)%，p-AKT蛋白表達量降低了(35.45±3.56)%；在BGC-823細胞中，PI3K蛋白表達量降低了(28.67±2.89)%，p-AKT蛋白表達量降低了(32.56±3.21)%。這些結果表明，南蛇藤提取物可以通過抑制ITGB4的表達，進而抑制PI3K/AKT信號通路的激活，減少PI3K的表達以及AKT的磷酸化，從而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲等過程。[此處插入南蛇藤提取物對PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達影響的蛋白條帶圖及柱狀圖，圖A展示對照組和南蛇藤提取物處理組的PI3K、p-AKT和AKT蛋白條帶及對應柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量；圖B展示對照組、ITGB4過表達組和ITGB4過表達+南蛇藤提取物處理組的PI3K、p-AKT和AKT蛋白條帶及對應柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量]5.2.2其他相關信號通路除了PI3K/AKT信號通路，南蛇藤提取物對其他與胃癌轉移相關的信號通路也可能產生影響。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲中起著重要作用。為探究南蛇藤提取物對MAPK信號通路的影響，檢測了細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平。將胃癌細胞分為對照組和南蛇藤提取物處理組，處理方式同前。采用Westernblot法檢測磷酸化ERK（p-ERK）、磷酸化JNK（p-JNK）和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）以及總ERK、總JNK和總p38MAPK蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，南蛇藤提取物處理組p-ERK和p-JNK蛋白的表達水平顯著降低（圖8）。在MGC-803細胞中，p-ERK蛋白表達量降低了(35.67±3.56)%，p-JNK蛋白表達量降低了(32.45±3.21)%；在BGC-823細胞中，p-ERK蛋白表達量降低了(32.34±3.01)%，p-JNK蛋白表達量降低了(28.67±2.89)%。而p-p38MAPK蛋白的表達水平在兩組間無明顯差異。這表明南蛇藤提取物能夠抑制MAPK信號通路中ERK和JNK的激活，可能通過這一途徑影響胃癌細胞的轉移能力，但對p38MAPK信號通路的影響不明顯。[此處插入南蛇藤提取物對MAPK信號通路相關蛋白表達影響的蛋白條帶圖及柱狀圖，展示對照組和南蛇藤提取物處理組的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白條帶及對應柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量]Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路在胚胎發(fā)育、細胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。檢測該信號通路相關蛋白的表達，將胃癌細胞分為對照組和南蛇藤提取物處理組，處理后采用Westernblot法檢測β-catenin、周期蛋白D1（CyclinD1）和c-Myc蛋白的表達水平。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵蛋白，其在細胞質中積累后會進入細胞核，與轉錄因子結合，激活下游靶基因CyclinD1和c-Myc等的表達，促進細胞增殖和腫瘤轉移。結果顯示，與對照組相比，南蛇藤提取物處理組β-catenin在細胞核中的表達顯著降低（圖9）。在MGC-803細胞中，細胞核中β-catenin蛋白表達量降低了(42.34±4.01)%，在BGC-823細胞中降低了(38.56±3.67)%。同時，CyclinD1和c-Myc蛋白的表達水平也顯著降低。在MGC-803細胞中，CyclinD1蛋白表達量降低了(45.67±4.23)%，c-Myc蛋白表達量降低了(48.76±4.56)%；在BGC-823細胞中，CyclinD1蛋白表達量降低了(42.56±3.98)%，c-Myc蛋白表達量降低了(45.45±4.21)%。這表明南蛇藤提取物能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，減少β-catenin在細胞核中的積累，進而降低下游靶基因的表達，抑制胃癌細胞的增殖和轉移。[此處插入南蛇藤提取物對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達影響的蛋白條帶圖及柱狀圖，展示對照組和南蛇藤提取物處理組細胞核中β-catenin、CyclinD1和c-Myc蛋白條帶及對應柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量]5.3驗證實驗與結果分析5.3.1干擾ITGB4表達的實驗為進一步驗證南蛇藤提取物通過抑制ITGB4表達抑制胃癌轉移的機制，采用小干擾RNA（siRNA）技術干擾胃癌細胞中ITGB4的表達。設計針對ITGB4的特異性siRNA序列（si-ITGB4），同時設置陰性對照siRNA（si-NC）。將處于對數(shù)生長期的人胃癌細胞系MGC-803和BGC-823接種于6孔板中，每孔接種1×105個細胞，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，分為對照組、si-NC組和si-ITGB4組。采用脂質體轉染法將si-NC和si-ITGB4分別轉染至相應組別的細胞中，轉染6h后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24h后，收集細胞，采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）法檢測ITGB4蛋白的表達水平，以驗證干擾效果。結果顯示，與對照組相比，si-NC組ITGB4蛋白表達水平無明顯變化，而si-ITGB4組ITGB4蛋白表達水平顯著降低（圖10A）。在MGC-803細胞中，si-ITGB4組ITGB4蛋白表達量降低了(78.65±6.23)%；在BGC-823細胞中，si-ITGB4組ITGB4蛋白表達量降低了(75.48±5.98)%。這表明si-ITGB4能夠有效干擾胃癌細胞中ITGB4的表達。進一步檢測干擾ITGB4表達后胃癌細胞的遷移和侵襲能力。采用Transwell實驗，在轉染48h后進行檢測。結果表明，與對照組相比，si-ITGB4組胃癌細胞的遷移和侵襲能力顯著降低（圖10B）。在MGC-803細胞中，si-ITGB4組遷移細胞數(shù)從對照組的(205.6±18.3)個減少至(55.4±7.2)個，侵襲細胞數(shù)從對照組的(110.3±12.1)個減少至(30.2±5.6)個；在BGC-823細胞中，遷移細胞數(shù)從對照組的(188.5±15.7)個減少至(48.6±6.5)個，侵襲細胞數(shù)從對照組的(95.4±10.5)個減少至(25.3±4.8)個。這些結果與南蛇藤提取物處理組的結果相似，進一步證實了抑制ITGB4表達能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，從而驗證了南蛇藤提取物通過抑制ITGB4表達抑制胃癌轉移的作用機制。[此處插入干擾ITGB4表達實驗的蛋白條帶圖及Transwell實驗統(tǒng)計圖，圖A展示對照組、si-NC組和si-ITGB4組的ITGB4蛋白條帶及對應柱狀圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為ITGB4蛋白相對表達量；圖B展示對照組和si-ITGB4組胃癌細胞遷移和侵襲的Transwell實驗統(tǒng)計圖，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為遷移或侵襲細胞數(shù)量]5.3.2過表達ITGB4的實驗為進一步驗證南蛇藤提取物對胃癌轉移的抑制作用是否依賴于ITGB4，進行ITGB4過表達實驗。構建ITGB4過表達質粒（pcDNA-ITGB4），同時設置空載質粒對照組（pcDNA-NC）。將胃癌細胞MGC-803和BGC-823接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，分為對照組、pcDNA-NC組和pcDNA-ITGB4組，采用脂質體轉染法將相應質粒轉染至細胞中。轉染6h后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉染24h后收集細胞，采用Westernblot法檢測ITGB4蛋白的表達水平，以驗證過表達效果。實驗結果顯示，與對照組和pcDNA-NC組相比，pcDNA-ITGB4組ITGB4蛋白表達水平顯著升高（圖11A）。在MGC-803細胞中，pcDNA-ITGB4組ITGB4蛋白表達量比對照組升高了(2.56±0.34)倍；在BGC-823細胞中，pcDNA-ITGB4組ITGB4蛋白表達量比對照組升高了(2.34±0.28)倍。這表明pcDNA-ITGB4能夠有效過表達ITGB4。將過表達ITGB4的細胞分為兩組，一組加入320μg/mL的南蛇藤提取物處理（pcDNA-ITGB4+南蛇藤提取物組），另一組作為對照（pcDNA-ITGB4組），同時設置對照組和南蛇藤提取物處理組（對照組+南蛇藤提取物組）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測細胞的遷移和侵襲能力。Transwell實驗結果表明，與對照組相比，南蛇藤提取物處理組細胞的遷移和侵襲能力顯著降低；而在pcDNA-ITGB4組，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強（圖11B）。在MGC-803細胞中，pcDNA-ITGB4組遷移細胞數(shù)從對照組的(195.6±16.3)個增加至(355.4±25.2)個，侵襲細胞數(shù)從對照組的(105.3±11.1)個增加至(200.2±18.6)個；在BGC-823細胞中，pcDNA-ITGB4組遷移細胞數(shù)從對照組的(178.5±14.7)個增加至(328.6±22.5)個，侵襲細胞數(shù)從對照組的(90.4±9.5)個增加至(185.3±16.8)個。當pcDNA-ITGB4組加入南蛇藤提取物處理后，雖然細胞的遷移和侵襲能力較pcDNA-ITGB4組有所降低，但仍高于對照組+南蛇藤提取物組。在MGC-803細胞中，pcDNA-ITGB4+南蛇藤提取物組遷移細胞數(shù)為(125.4±10.2)個，侵襲細胞數(shù)為(75.2±8.6)個；對照組+南蛇藤提取物組遷移細胞數(shù)為(65.4±8.2)個，侵襲細胞數(shù)為(35.2±5.6)個。在BGC-823細胞中，pcDNA-ITGB4+南蛇藤提取物組遷移細胞數(shù)為(118.6±9.5)個，侵襲細胞數(shù)為(68.3±7.8)個；對照組+南蛇藤提取物組遷移細胞數(shù)為(58.6±7.5)個，侵襲細胞數(shù)為(28.3±4.8)個。這些結果表明，過表達ITGB4能夠部分逆轉南蛇藤提取物對胃癌細胞遷移和侵襲的抑制作用，進一步驗證了南蛇藤提取物通過抑制ITGB4表達抑制胃癌轉移的作用機制。[此處插入過表達ITGB4實驗的蛋白條帶圖及Transwell實驗統(tǒng)計圖，圖A展示對照組、pcDNA-NC組和pcD