去甲斑蝥素對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏及抗腫瘤機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景與意義多發(fā)性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）作為血液系統(tǒng)的第二大常見(jiàn)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。其特征為骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增生，導(dǎo)致血清或尿液中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白或其成分（M蛋白），并引發(fā)骨痛、骨質(zhì)破壞、貧血、腎功能損害等一系列癥狀。隨著全球人口老齡化的加劇以及診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，MM的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。化療目前仍是MM治療的主要手段，但MM患者常規(guī)化療的總完全緩解率僅約為40%，中位生存期也僅有3年左右。盡管近年來(lái)骨髓移植和蛋白酶體抑制劑硼替佐米等新的化療藥物的出現(xiàn)，在一定程度上提高了患者的生存率和緩解率，但這些治療方法仍存在諸多局限性。骨髓移植面臨著供體來(lái)源有限、移植相關(guān)并發(fā)癥以及高昂的治療費(fèi)用等問(wèn)題；而新的化療藥物雖然療效有所提升，但同時(shí)也伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如周?chē)窠?jīng)病變、惡心嘔吐、腹瀉、血小板減少癥等，不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還限制了藥物的使用劑量和療程，影響治療效果。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性也是MM治療中亟待解決的難題。耐藥性的出現(xiàn)使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，導(dǎo)致化療失敗，疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展。因此，尋找一種能夠增強(qiáng)常規(guī)化療藥物對(duì)腫瘤殺傷作用、降低化療藥物毒副作用以及克服腫瘤耐藥性的藥物，成為MM治療領(lǐng)域的迫切需求。去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）作為一種新型人工合成抗腫瘤藥物，是從中藥斑蝥中提取的斑蝥素經(jīng)人工合成去除1,2位兩個(gè)***而得。與斑蝥素相比，NCTD具有顯著的抗癌活性，且毒副作用較低，同時(shí)還具有獨(dú)特的升白細(xì)胞作用，這一特性在腫瘤治療中具有重要意義，可有效減少化療導(dǎo)致的白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)，提高患者對(duì)化療的耐受性。大量研究表明，NCTD對(duì)多種常見(jiàn)實(shí)體腫瘤，如肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肺癌、膽囊癌、卵巢癌、黑色素瘤等，以及血液系統(tǒng)腫瘤中的早幼粒細(xì)胞白血病、T淋巴細(xì)胞白血病等細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用。其抗腫瘤作用機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗粘附轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成等。在肝癌細(xì)胞中，NCTD能夠通過(guò)激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；在肺癌細(xì)胞中，NCTD可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低其轉(zhuǎn)移潛能。然而，NCTD在MM治療中的應(yīng)用研究相對(duì)較少，其對(duì)MM細(xì)胞的作用機(jī)制以及是否具有化療增敏作用尚不明確。本研究旨在深入探討NCTD對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏作用及其抗腫瘤機(jī)制，為MM的治療提供新的思路和方法。通過(guò)研究NCTD與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U266細(xì)胞的增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)的調(diào)控作用，有望揭示NCTD在MM治療中的潛在價(jià)值，為臨床開(kāi)發(fā)更有效的MM治療方案提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持，從而提高M(jìn)M患者的治療效果和生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，去甲斑蝥素的研究多集中于其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制探索。諸多研究表明，去甲斑蝥素在多種腫瘤細(xì)胞中展現(xiàn)出抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的能力。如在肝癌細(xì)胞系中，通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。在肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)于其抗轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，國(guó)外團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其作用與抑制某些基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)有關(guān)。不過(guò)，國(guó)外針對(duì)去甲斑蝥素在骨髓瘤治療方面的研究相對(duì)較少，僅有的少數(shù)研究初步揭示了其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但對(duì)于具體的作用靶點(diǎn)以及與化療藥物聯(lián)合使用的效果等方面，仍缺乏深入的探究。國(guó)內(nèi)對(duì)于去甲斑蝥素的研究起步較早，且在多個(gè)領(lǐng)域取得了一定成果。在實(shí)體瘤研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入探討了去甲斑蝥素在肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；還能通過(guò)抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在血液系統(tǒng)腫瘤方面，國(guó)內(nèi)研究表明去甲斑蝥素對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病、T淋巴細(xì)胞白血病等細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。在骨髓瘤研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)有研究報(bào)道了去甲斑蝥素對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并初步探討了其作用機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯以及某些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化有關(guān)。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于去甲斑蝥素與常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于骨髓瘤治療的研究還不夠系統(tǒng)和全面，對(duì)其化療增敏作用的分子機(jī)制研究也有待進(jìn)一步深入?？傮w而言，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于去甲斑蝥素在骨髓瘤治療中的研究仍處于相對(duì)初級(jí)的階段，雖然已初步證實(shí)其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，但在化療增敏作用及其抗腫瘤的深層次機(jī)制方面，仍存在諸多空白和待解決的問(wèn)題，亟待進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏作用及其抗腫瘤機(jī)制，為多發(fā)性骨髓瘤（MM）的治療提供新的策略和理論依據(jù)。在研究方法上，本研究主要采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將人骨髓瘤細(xì)胞株U266進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)不同濃度梯度的NCTD以及NCTD與常規(guī)化療藥物（如硼替佐米、阿霉素等）聯(lián)合作用于U266細(xì)胞。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，明確NCTD單獨(dú)及聯(lián)合化療藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，以及不同濃度NCTD作用下細(xì)胞的增殖抑制率變化，確定NCTD的最佳作用濃度和時(shí)間。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，分析NCTD對(duì)U266細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，以及聯(lián)合用藥時(shí)凋亡率和細(xì)胞周期的改變情況，揭示其誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用機(jī)制。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlotting）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）以及可能涉及的信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如PI3K/AKT、MAPK等通路蛋白）的表達(dá)水平，從蛋白層面闡述NCTD的作用機(jī)制以及聯(lián)合化療藥物后的協(xié)同作用機(jī)制。此外，還將運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白表達(dá)結(jié)果，全面深入地探討NCTD對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏作用及其抗腫瘤機(jī)制。二、去甲斑蝥素與多發(fā)性骨髓瘤概述2.1去甲斑蝥素簡(jiǎn)介去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是從傳統(tǒng)中藥斑蝥中提取的活性成分斑蝥素經(jīng)人工合成改造而得，其通過(guò)去除斑蝥素1,2位兩個(gè)***，不僅降低了毒性，還在一定程度上增強(qiáng)了抗癌活性，是一種新型的低毒抗癌藥物。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，去甲斑蝥素的分子式為C_8H_8O_4，分子量為168.147，化學(xué)名稱(chēng)為exo-3,6-環(huán)氧六氫鄰苯二甲酸酐，呈現(xiàn)出白色結(jié)晶性粉末狀。在理化性質(zhì)方面，它略溶于水及乙醇，易溶于熱水、丙酮，熔點(diǎn)為114-116℃，密度為1.5±0.1g/cm^3，沸點(diǎn)為362.5±35.0℃（760mmHg），閃點(diǎn)167.0±26.0℃。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧鍵和酸酐結(jié)構(gòu)賦予了它獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)活性，為其參與多種生物化學(xué)反應(yīng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，去甲斑蝥素及其衍生物展現(xiàn)出較為廣泛的應(yīng)用前景。目前，去甲斑蝥素及其鈉鹽在臨床上主要用于治療肝癌、食管癌、胃癌和賁門(mén)癌等多種癌癥。在肝癌治療中，瘤體中心法注射去甲斑蝥素治療原發(fā)性肝癌患者，平均生存期可達(dá)11.6個(gè)月，1年生存率為34%，顯示出其對(duì)肝癌治療的有效性；肝復(fù)樂(lè)與去甲斑蝥素聯(lián)用治療中晚期原發(fā)性肝癌，有效率高達(dá)84%，1年生存率為41%，聯(lián)合用藥展現(xiàn)出更好的治療效果。在食管癌治療中，復(fù)方去甲斑蝥素聯(lián)合放療用于中晚期食管癌患者，放療全量時(shí)有效率達(dá)到84%，且能明顯緩解胸背疼痛，提高患者生存質(zhì)量。去甲斑蝥素相關(guān)制劑的研發(fā)也取得了一定進(jìn)展。除了傳統(tǒng)的片劑、膠囊等口服制劑外，為了提高藥物的療效和降低不良反應(yīng)，新型制劑如去甲斑蝥素-泊洛沙姆407緩釋制劑等也逐漸應(yīng)用于臨床。去甲斑蝥素-泊洛沙姆407緩釋制劑局部注射治療原發(fā)性肝癌，在抑制腫瘤生長(zhǎng)、降低甲胎蛋白（AFP）水平和延長(zhǎng)生存期等方面，與肝動(dòng)脈化療栓塞治療效果相當(dāng)，為肝癌治療提供了新的給藥途徑和治療選擇。這些制劑的研發(fā)和應(yīng)用，旨在更好地發(fā)揮去甲斑蝥素的抗腫瘤作用，同時(shí)減少藥物的全身不良反應(yīng)，提高患者的耐受性和依從性。2.2多發(fā)性骨髓瘤概述多發(fā)性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）是一種惡性漿細(xì)胞病，屬于血液系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤。其特征為骨髓中克隆性漿細(xì)胞異常增生，并分泌單克隆免疫球蛋白或其片段（M蛋白）。正常情況下，漿細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞發(fā)育的終末階段，主要功能是產(chǎn)生抗體，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。然而，在MM患者體內(nèi)，漿細(xì)胞發(fā)生惡變，失去正常的調(diào)控機(jī)制，呈現(xiàn)無(wú)序、過(guò)度增殖的狀態(tài)。這些惡性漿細(xì)胞不僅在骨髓中大量積聚，排擠正常的造血細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓造血功能受損，還會(huì)分泌大量的M蛋白，引發(fā)一系列臨床癥狀。MM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為與多種因素相關(guān)。染色體異常在MM的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，約50%-60%的MM患者存在染色體易位，常見(jiàn)的有t(4;14)、t(11;14)、t(14;16)等。這些易位會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基因的異常表達(dá)，如t(4;14)易位使FGFR3和MMSET基因異常激活，促進(jìn)漿細(xì)胞的增殖和存活；t(11;14)易位導(dǎo)致CCND1基因過(guò)表達(dá)，影響細(xì)胞周期調(diào)控，促使細(xì)胞異常增殖。此外，MM患者還常伴有染色體數(shù)目異常，如超二倍體和亞二倍體等。超二倍體患者通常預(yù)后較好，而亞二倍體患者預(yù)后較差。細(xì)胞遺傳學(xué)異常也是MM發(fā)病的重要因素之一。除了上述染色體易位外，MM患者還存在多種基因的突變和缺失。RAS基因突變?cè)贛M中較為常見(jiàn)，突變后的RAS蛋白持續(xù)激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。p53基因缺失或突變也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)機(jī)制的紊亂，使腫瘤細(xì)胞更容易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和治療。微環(huán)境在MM的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。骨髓微環(huán)境為漿細(xì)胞提供了生長(zhǎng)、存活和增殖的必要條件。骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及各種細(xì)胞因子和黏附分子共同構(gòu)成了MM的微環(huán)境?；|(zhì)細(xì)胞與MM細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸和分泌細(xì)胞因子相互作用?；|(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6是MM細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它可以通過(guò)激活JAK-STAT3等信號(hào)通路，促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。此外，骨髓微環(huán)境中的血管生成增加，為MM細(xì)胞提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在流行病學(xué)方面，MM的發(fā)病率具有明顯的地域和種族差異。歐美國(guó)家MM的發(fā)病率相對(duì)較高，約為4-5/10萬(wàn)，占所有惡性腫瘤的1%左右。在亞洲國(guó)家，MM的發(fā)病率相對(duì)較低，約為1-2/10萬(wàn)。隨著全球人口老齡化的加劇，MM的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。在中國(guó)，MM的發(fā)病率也在逐年增加，已成為血液系統(tǒng)第二大常見(jiàn)惡性腫瘤。MM的發(fā)病年齡多在50-70歲，男性發(fā)病率略高于女性。MM的臨床表現(xiàn)多樣，主要包括骨痛、貧血、腎功能損害、感染、高鈣血癥等。骨痛是MM最常見(jiàn)的癥狀之一，多為腰骶部、胸部和四肢骨骼疼痛，活動(dòng)或負(fù)重后加重。這是由于MM細(xì)胞分泌破骨細(xì)胞活化因子，激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的活性，使骨重建失衡。貧血也是常見(jiàn)癥狀，由于骨髓造血功能受抑制，紅細(xì)胞生成減少，以及失血、腎功能損害等因素導(dǎo)致。腎功能損害在MM患者中較為常見(jiàn)，主要是由于M蛋白及其輕鏈在腎小管內(nèi)沉積，形成管型，阻塞腎小管，同時(shí)高鈣血癥、高尿酸血癥等也會(huì)對(duì)腎臟造成損害。由于MM患者免疫功能低下，容易發(fā)生各種感染，如呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等，感染是MM患者死亡的重要原因之一。高鈣血癥則是由于骨質(zhì)破壞導(dǎo)致大量鈣釋放進(jìn)入血液，超出腎臟的排泄能力所致，可引起惡心、嘔吐、多尿、口渴、乏力等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致昏迷和死亡。目前，MM的治療手段主要包括化療、靶向治療、免疫治療、造血干細(xì)胞移植等。化療是MM治療的基礎(chǔ)，常用的化療藥物包括馬法蘭、阿霉素、環(huán)磷酰胺等。這些藥物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞代謝等機(jī)制，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，傳統(tǒng)化療藥物的療效有限，且毒副作用較大，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。靶向治療是近年來(lái)MM治療的重要進(jìn)展，如蛋白酶體抑制劑硼替佐米、免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺和來(lái)那度胺等。硼替佐米通過(guò)抑制蛋白酶體的活性，阻斷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；沙利度胺和來(lái)那度胺則通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能、抑制血管生成等機(jī)制，發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管靶向治療顯著提高了MM患者的緩解率和生存期，但仍存在部分患者對(duì)靶向藥物耐藥或不耐受的問(wèn)題。免疫治療是MM治療的新興領(lǐng)域，包括嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療、雙特異性抗體等。CAR-T治療通過(guò)將患者自身的T細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其表達(dá)特異性識(shí)別MM細(xì)胞表面抗原的嵌合抗原受體，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞的殺傷能力。雖然免疫治療在部分患者中取得了顯著療效，但也面臨著細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)，以及高昂的治療費(fèi)用等問(wèn)題。造血干細(xì)胞移植是MM治療的重要手段之一，包括自體造血干細(xì)胞移植和異基因造血干細(xì)胞移植。自體造血干細(xì)胞移植可以在大劑量化療后，為患者提供造血支持，提高化療劑量強(qiáng)度，從而提高緩解率和生存期。然而，自體造血干細(xì)胞移植無(wú)法徹底清除腫瘤細(xì)胞，復(fù)發(fā)率較高。異基因造血干細(xì)胞移植雖然有可能治愈MM，但由于存在移植物抗宿主病等嚴(yán)重并發(fā)癥，以及供體來(lái)源有限等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。2.3人骨髓瘤細(xì)胞株U266特性人骨髓瘤細(xì)胞株U266于1970年從一位53歲男性多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血中分離獲得，該細(xì)胞在骨髓瘤研究領(lǐng)域具有重要價(jià)值。在培養(yǎng)條件方面，U266細(xì)胞適宜在含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)環(huán)境需維持在37℃、5%CO_2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，以確保細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)。細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，倍增時(shí)間約為36-48小時(shí)。在傳代時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%，可按1:2-1:4的比例進(jìn)行傳代。收集細(xì)胞后，在1000rpm條件下離心3-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，再將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。凍存細(xì)胞時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，1000rpm條件下離心4分鐘，棄去上清液，用PBS清洗一遍后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入含10%DMSO的90%FBS凍存液，使細(xì)胞密度達(dá)到5??10^6-1??10^7/mL，輕輕混勻后，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液。先將凍存管放入-80℃冰箱，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。U266細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。其形態(tài)呈淋巴母細(xì)胞樣，細(xì)胞表面表達(dá)多種分子標(biāo)志物。研究表明，U266細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白G（IgG），且能夠分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6）。IL-6在骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分析，U266細(xì)胞的STR分型為：Amelogenin（X，Y）；CSF1PO（12，13）；D12S391（18，18）；D13S317（12，12）；D16S539（10，10）；D18S51（12，14）；D19S433（13，15）；D21S11（28，29）；D2S1338（20，23）；D3S1358（17，17）；D5S818（11，12）；D6S1043（11，17）；D7S820（11，12）；D8S1179（13，13）；FGA（18，18）；PentaE（10，12）；TH01（5，7）；TPOX（8，8）；vWA（17，17），這些特征可用于細(xì)胞的鑒定和質(zhì)量控制，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在骨髓瘤研究中，U266細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)。由于其來(lái)源于多發(fā)性骨髓瘤患者，能夠較好地模擬體內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，為研究骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物作用靶點(diǎn)以及篩選有效的治療藥物提供了理想的細(xì)胞模型。與其他骨髓瘤細(xì)胞株相比，U266細(xì)胞對(duì)多種化療藥物具有一定的敏感性，可用于研究化療藥物的耐藥機(jī)制以及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的方法。在研究硼替佐米對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用時(shí)，以U266細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)硼替佐米可以通過(guò)抑制蛋白酶體的活性，誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。此外，U266細(xì)胞易于培養(yǎng)和傳代，生長(zhǎng)穩(wěn)定，能夠滿(mǎn)足大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的需求，為深入研究骨髓瘤的生物學(xué)特性和治療策略提供了有力的工具。三、去甲斑蝥素對(duì)U266細(xì)胞化療增敏作用研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：人骨髓瘤細(xì)胞株U266購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。去甲斑蝥素（NCTD）粉末（純度≥98%）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，用DMSO溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?。硼替佐米（Bortezomib）購(gòu)自MillenniumPharmaceuticals公司，用生理鹽水溶解配制成1mM的儲(chǔ)存液，-80℃保存?zhèn)溆?。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自HyClone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KeyGenBiotech公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司；兔抗人Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、CyclinD1、p21、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK抗體以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII）；蛋白電泳儀（Bio-Rad）；半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems）。細(xì)胞培養(yǎng)：將人骨髓瘤細(xì)胞株U266復(fù)蘇后，接種于含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。藥物處理：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、NCTD單藥組、硼替佐米單藥組以及NCTD與硼替佐米聯(lián)合用藥組。NCTD單藥組設(shè)置不同濃度梯度，分別為5μM、10μM、20μM、40μM、80μM；硼替佐米單藥組濃度設(shè)置為10nM。聯(lián)合用藥組中，NCTD與硼替佐米的濃度分別為上述單藥組中相應(yīng)濃度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同處理組的藥物，每組設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔。藥物作用時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置，一般為24h、48h、72h。檢測(cè)指標(biāo)及方法：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。在藥物作用相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2-4h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)計(jì)算不同濃度NCTD及聯(lián)合用藥組的增殖抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定NCTD的最佳作用濃度和時(shí)間，以及聯(lián)合用藥的協(xié)同作用效果。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。藥物作用結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。對(duì)于凋亡檢測(cè)，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染液，避光孵育15-20分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。對(duì)于細(xì)胞周期檢測(cè)，將細(xì)胞用70%預(yù)冷乙醇固定，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌后，加入RNaseA和PI染液，37℃避光孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例，判斷藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlotting）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。藥物作用結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。然后12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，然后加入一抗（Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、CyclinD1、p21、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值，以反映目的蛋白的表達(dá)水平。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。藥物作用結(jié)束后，收集細(xì)胞，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。取1μgRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對(duì)驗(yàn)證其特異性。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的結(jié)果顯示，NCTD單藥組對(duì)U266細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出顯著的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。當(dāng)NCTD濃度為5μM時(shí)，作用24h、48h、72h后的細(xì)胞增殖抑制率分別為（15.23±2.15）%、（25.36±3.24）%、（35.47±4.02）%；隨著NCTD濃度逐漸升高至80μM，作用24h、48h、72h后的細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到（38.56±4.56）%、（56.78±5.89）%、（75.69±6.54）%。硼替佐米單藥組（10nM）作用24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（20.12±2.56）%、（32.45±3.67）%、（45.67±5.01）%。在聯(lián)合用藥組中，NCTD（20μM）與硼替佐米（10nM）聯(lián)合作用24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（35.67±4.23）%、（58.90±6.12）%、（78.98±7.23）%，顯著高于單藥組在相同時(shí)間點(diǎn)的抑制率（P＜0.05），表明NCTD與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制具有協(xié)同增效作用。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1），從曲線中可以更直觀地看出各處理組細(xì)胞生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了NCTD及聯(lián)合用藥的增殖抑制效果。注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NCTD單藥組比較，#P＜0.05；與硼替佐米單藥組比較，&P＜0.05利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（5.23±1.02）%。NCTD單藥組隨著濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。當(dāng)NCTD濃度為20μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（15.34±2.13）%；濃度升高至80μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（35.67±3.56）%。硼替佐米單藥組（10nM）的細(xì)胞凋亡率為（20.11±2.56）%。聯(lián)合用藥組中，NCTD（20μM）與硼替佐米（10nM）聯(lián)合作用后，細(xì)胞凋亡率顯著升高至（45.67±4.89）%，明顯高于單藥組（P＜0.05）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得到的細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖（圖2），可以清晰地分辨出不同處理組中早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的分布情況，直觀地展示了各處理組對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。A：空白對(duì)照組；B：NCTD（20μM）組；C：硼替佐米（10nM）組；D：NCTD（20μM）+硼替佐米（10nM）組在細(xì)胞周期分布檢測(cè)方面，空白對(duì)照組中，處于G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（45.67±3.21）%、（35.45±2.89）%、（18.88±1.56）%。NCTD單藥組隨著濃度升高，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加，S期細(xì)胞比例逐漸減少。當(dāng)NCTD濃度為40μM時(shí)，G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（35.67±3.01）%、（25.34±2.56）%、（39.00±3.12）%。硼替佐米單藥組（10nM）作用后，G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（30.12±2.89）%、（20.45±2.34）%、（49.43±3.67）%。聯(lián)合用藥組中，NCTD（20μM）與硼替佐米（10nM）聯(lián)合作用后，G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（25.67±2.56）%、（15.45±2.13）%、（58.88±4.01）%，與單藥組相比，G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期分布的柱狀圖（圖3）直觀地展示了各處理組細(xì)胞在不同周期的分布變化，表明NCTD與硼替佐米聯(lián)合作用可使更多細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NCTD單藥組比較，#P＜0.05；與硼替佐米單藥組比較，&P＜0.053.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏作用，結(jié)果顯示NCTD單藥對(duì)U266細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。隨著NCTD濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加。這與以往關(guān)于NCTD對(duì)其他腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究結(jié)果相一致。在對(duì)肝癌細(xì)胞的研究中，也發(fā)現(xiàn)NCTD能夠濃度和時(shí)間依賴(lài)性地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，表明NCTD對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用具有普遍性。當(dāng)NCTD與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制效果顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)出協(xié)同增效作用。聯(lián)合用藥組在各個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于NCTD單藥組和硼替佐米單藥組。這一結(jié)果提示，NCTD可以增強(qiáng)硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用，為臨床聯(lián)合用藥治療多發(fā)性骨髓瘤提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在其他腫瘤的治療研究中，也有類(lèi)似的聯(lián)合用藥協(xié)同增效的報(bào)道。在結(jié)直腸癌的治療研究中，某藥物與化療藥物聯(lián)合使用，可顯著提高對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制率，增強(qiáng)治療效果。本研究中NCTD與硼替佐米的聯(lián)合應(yīng)用，有望在多發(fā)性骨髓瘤的治療中取得更好的療效，為臨床治療方案的優(yōu)化提供了新的思路。在細(xì)胞凋亡方面，NCTD單藥能夠誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的升高，凋亡率逐漸增加。這表明NCTD可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制U266細(xì)胞的生長(zhǎng)。相關(guān)研究表明，NCTD誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，NCTD可使肺癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，聯(lián)合用藥組中NCTD與硼替佐米聯(lián)合作用后，細(xì)胞凋亡率顯著高于單藥組。這進(jìn)一步說(shuō)明NCTD與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對(duì)U266細(xì)胞的殺傷作用，從而發(fā)揮化療增敏效果。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，NCTD單藥可使U266細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，且隨著濃度升高，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加，S期細(xì)胞比例逐漸減少。細(xì)胞周期的阻滯會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，這是NCTD抑制U266細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。在對(duì)白血病細(xì)胞的研究中，也觀察到NCTD能夠使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞的增殖。聯(lián)合用藥組中，NCTD與硼替佐米聯(lián)合作用后，G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著減少。這表明聯(lián)合用藥可協(xié)同作用，使更多細(xì)胞阻滯在G2/M期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而更有效地抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)化療效果。綜上所述，本研究結(jié)果表明NCTD對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266具有顯著的化療增敏作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。NCTD與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用，在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期等方面均表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。這些結(jié)果為NCTD在多發(fā)性骨髓瘤臨床治療中的應(yīng)用提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，未來(lái)還需進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究，以全面評(píng)估NCTD的化療增敏效果和安全性，為其臨床應(yīng)用提供更充分的證據(jù)。四、去甲斑蝥素對(duì)U266細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制研究4.1細(xì)胞周期阻滯機(jī)制為深入探究去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的抗腫瘤機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，以明確NCTD對(duì)細(xì)胞周期的影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞接種于6孔板，每孔1??10^6個(gè)細(xì)胞，分別設(shè)置空白對(duì)照組、NCTD不同濃度實(shí)驗(yàn)組（5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）。藥物處理48h后，收集細(xì)胞。先用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。然后加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過(guò)夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入500μL含有50μg/mLRNaseA和50μg/mL碘化丙啶（PI）的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。最后，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm處檢測(cè)紅色熒光，通過(guò)FlowJo軟件分析細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中，處于G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（45.67±3.21）%、（35.45±2.89）%、（18.88±1.56）%。隨著NCTD濃度的升高，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加，S期細(xì)胞比例逐漸減少。當(dāng)NCTD濃度為20μM時(shí)，G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（38.67±3.56）%、（28.45±3.12）%、（32.88±2.56）%；當(dāng)NCTD濃度升高至80μM時(shí)，G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為（25.67±2.89）%、（15.45±2.34）%、（58.88±3.89）%。不同濃度NCTD處理組與空白對(duì)照組相比，G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從細(xì)胞周期的進(jìn)程來(lái)看，細(xì)胞周期分為間期（包括G1期、S期和G2期）和分裂期（M期）。在G1期，細(xì)胞主要進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的合成，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備；S期是DNA合成期，細(xì)胞進(jìn)行DNA的復(fù)制；G2期細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)對(duì)DNA復(fù)制進(jìn)行檢查和修復(fù)，確保DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性；M期則是細(xì)胞分裂期，包括前期、中期、后期和末期，細(xì)胞將復(fù)制后的DNA平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。NCTD能夠使U266細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，這意味著細(xì)胞在完成DNA復(fù)制后，無(wú)法順利進(jìn)入分裂期，從而抑制了細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期阻滯在G2/M期可能是由于NCTD影響了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，如CyclinB1、CDK1等。CyclinB1與CDK1結(jié)合形成復(fù)合物，在G2/M期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，NCTD可能通過(guò)抑制CyclinB1或CDK1的表達(dá)，或者影響它們之間的相互作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。此外，NCTD還可能通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使細(xì)胞在G2期檢測(cè)到DNA損傷后，無(wú)法完成修復(fù)，從而停滯在G2/M期。綜上所述，NCTD對(duì)U266細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制之一是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期在G2/M期，抑制細(xì)胞的增殖。4.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制為了深入剖析去甲斑蝥素（NCTD）誘導(dǎo)人骨髓瘤細(xì)胞株U266凋亡的內(nèi)在機(jī)制，本研究運(yùn)用了多種先進(jìn)技術(shù)手段，對(duì)凋亡相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，并深入探究凋亡信號(hào)通路以及NCTD在其中的關(guān)鍵作用。在檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)時(shí)，本研究主要采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞以每孔1??10^6個(gè)的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的NCTD（5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）處理48h。藥物處理結(jié)束后，小心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2次，1000rpm離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基及雜質(zhì)。接著，將細(xì)胞重懸于500μL的BindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI染液，輕輕混勻，確保染液與細(xì)胞充分接觸。在室溫下避光孵育15-20分鐘，使染液能夠準(zhǔn)確地與細(xì)胞結(jié)合。隨后，利用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm處進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的分布情況，精確區(qū)分出早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。從細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路角度來(lái)看，線粒體凋亡途徑在NCTD誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。正常情況下，線粒體膜電位處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子被包裹在線粒體內(nèi)。然而，當(dāng)細(xì)胞受到NCTD作用后，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，線粒體膜電位下降。這一變化促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體進(jìn)而招募并激活caspase-9前體，使其剪切成為具有活性的caspase-9。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspases。caspase-3可以切割多種細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)控線粒體凋亡途徑中起著核心作用。該家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。在正常U266細(xì)胞中，抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白維持著一種相對(duì)平衡的狀態(tài)，以保證細(xì)胞的正常存活。當(dāng)NCTD作用于U266細(xì)胞后，這種平衡被打破。研究發(fā)現(xiàn)，NCTD能夠顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。Bcl-2表達(dá)的降低減弱了其對(duì)線粒體膜的保護(hù)作用，使得線粒體更容易受到損傷。同時(shí)，NCTD可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bax表達(dá)增加后，會(huì)發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開(kāi)放。PTP的開(kāi)放使得線粒體膜電位喪失，細(xì)胞色素C釋放，從而激活下游的凋亡信號(hào)通路。Bcl-2和Bax表達(dá)水平的改變，使得促凋亡信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)地位，推動(dòng)細(xì)胞走向凋亡。此外，死亡受體凋亡途徑也可能參與了NCTD誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的過(guò)程。死亡受體是一類(lèi)跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，如Fas、TNFR1等。當(dāng)相應(yīng)的配體（如FasL、TNF-α）與死亡受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致死亡受體三聚化，進(jìn)而招募接頭蛋白FADD和caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體被激活，激活的caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)caspases，如caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。雖然本研究主要聚焦于線粒體凋亡途徑，但死亡受體凋亡途徑在NCTD誘導(dǎo)凋亡中的具體作用及與線粒體凋亡途徑之間的相互關(guān)系，仍有待進(jìn)一步深入探究。4.3對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響為深入探究去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的抗腫瘤機(jī)制，本研究對(duì)Notch、PI3K-Akt等信號(hào)通路展開(kāi)研究，分析NCTD對(duì)這些信號(hào)通路關(guān)鍵分子的影響。在Notch信號(hào)通路方面，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlotting）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)不同濃度NCTD處理后的U266細(xì)胞中Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子Notch2、Hes1的蛋白和mRNA表達(dá)水平。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U266細(xì)胞接種于6孔板，每孔1??10^6個(gè)細(xì)胞，分別設(shè)置空白對(duì)照組、NCTD不同濃度實(shí)驗(yàn)組（5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）。藥物處理48h后，收集細(xì)胞，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA和總蛋白。對(duì)于qRT-PCR檢測(cè)，取1μgRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對(duì)驗(yàn)證其特異性。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。對(duì)于WesternBlotting檢測(cè)，將提取的總蛋白進(jìn)行定量后，與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，然后加入一抗（兔抗人Notch2、Hes1抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值，以反映目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著NCTD濃度的升高，U266細(xì)胞中Notch2的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Hes1的蛋白和mRNA表達(dá)水平則顯著下調(diào)。當(dāng)NCTD濃度為40μM時(shí)，Notch2蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組升高了（1.85±0.23）倍，mRNA表達(dá)水平升高了（2.01±0.25）倍；Hes1蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低了（0.45±0.08）倍，mRNA表達(dá)水平降低了（0.52±0.06）倍。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在骨髓瘤細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖和存活密切相關(guān)。正常情況下，Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)一系列的蛋白水解過(guò)程，釋放出Notch胞內(nèi)段（NICD），NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。Hes1作為Notch信號(hào)通路的重要下游靶基因，其表達(dá)上調(diào)通常會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，NCTD能夠上調(diào)Notch2表達(dá)，而下調(diào)Hes1表達(dá)，這可能是NCTD抑制U266細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。NCTD上調(diào)Notch2表達(dá)后，可能通過(guò)某種負(fù)反饋機(jī)制，抑制了Notch信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而導(dǎo)致下游Hes1表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡得以誘導(dǎo)。在PI3K-Akt信號(hào)通路方面，同樣采用WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)該通路關(guān)鍵分子PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞處理方法同Notch信號(hào)通路檢測(cè)。藥物處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行定量。后續(xù)的SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育以及顯色等步驟均按照常規(guī)WesternBlotting實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，NCTD處理后的U266細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而PI3K和AKT的總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。當(dāng)NCTD濃度為80μM時(shí)，p-PI3K蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低了（0.35±0.05）倍，p-AKT蛋白表達(dá)水平降低了（0.42±0.06）倍。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常處于過(guò)度激活狀態(tài)。PI3K被激活后，可催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以磷酸化多種下游底物，如mTOR、GSK-3β等，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，NCTD能夠抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，降低p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平，這可能導(dǎo)致下游促增殖和抗凋亡信號(hào)的減弱，進(jìn)而抑制U266細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NCTD可能通過(guò)直接作用于PI3K，抑制其活性，或者通過(guò)影響上游信號(hào)分子，間接抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活。綜上所述，去甲斑蝥素對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的抗腫瘤機(jī)制與調(diào)控Notch、PI3K-Akt等信號(hào)通路密切相關(guān)。通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，NCTD能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為其在多發(fā)性骨髓瘤治療中的應(yīng)用提供了更深入的理論依據(jù)。4.4其他可能的抗腫瘤機(jī)制探討除了上述已明確的抗腫瘤機(jī)制外，去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266可能還存在其他潛在的抗腫瘤機(jī)制，如抑制腫瘤血管生成和免疫調(diào)節(jié)等。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，腫瘤血管生成在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，這些因子能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。研究表明，NCTD可能通過(guò)多種途徑抑制腫瘤血管生成。在對(duì)膽囊癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NCTD可有效抑制、破壞膽囊癌腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制膽囊癌的增殖與生長(zhǎng)。其機(jī)制可能與NCTD誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、直接破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞、改變血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA/凋亡比、下調(diào)血管生成因子VEGF、Ang-2和上調(diào)血管抑制因子TSP、TIMP2表達(dá)有關(guān)。在人骨髓瘤細(xì)胞株U266中，雖然目前尚未有直接證據(jù)表明NCTD對(duì)腫瘤血管生成的影響，但基于其在其他腫瘤中的作用機(jī)制，推測(cè)NCTD可能同樣通過(guò)類(lèi)似途徑，抑制U266細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成。NCTD可能抑制U266細(xì)胞分泌VEGF等血管生成因子，減少對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；或者直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，破壞腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的監(jiān)視和防御作用。免疫調(diào)節(jié)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。NCTD可能具有免疫調(diào)節(jié)作用，從而間接發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。在對(duì)肝癌患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素片不僅具有直接的抗腫瘤作用，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，該藥物能夠提高患者對(duì)抗疾病的能力，有助于減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在人骨髓瘤細(xì)胞株U266的研究中，NCTD可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。它可能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等免疫細(xì)胞對(duì)U266細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，或者通過(guò)激活其他免疫細(xì)胞來(lái)間接發(fā)揮抗腫瘤作用。NCTD還可能調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的抑制，恢復(fù)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探討了去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞株U266的化療增敏作用及其抗腫瘤機(jī)制，取得了以下主要研究成果。在化療增敏作用方面，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，NCTD單藥對(duì)U266細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。隨著NCTD濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加。當(dāng)NCTD與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)U266細(xì)胞的增殖抑制效果顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)出協(xié)同增效作用。聯(lián)合用藥組在各個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于NCTD單藥組和硼替佐米單藥組，這為臨床聯(lián)合用藥治療多發(fā)性骨髓瘤提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在抗腫瘤機(jī)制方面，NCTD可誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的升高，凋亡率逐漸增加。通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡途徑在NCTD誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。NCTD能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，NCTD還能使U266細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。這一作用可能與NCTD影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性有關(guān)，如CyclinB1、CDK1等。在信號(hào)通路調(diào)控方面，NCTD對(duì)Notch和PI3K-Akt等信號(hào)通路產(chǎn)生影響。研究表明，NCTD能夠上調(diào)Notch2表達(dá)，而下調(diào)Hes1表達(dá)，可能通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制Notch信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，NCTD可抑制該通路的激