生物化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)第一頁，共149頁。組成蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素有：C、H、O、N和S，這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：C：50~55%H：6~8%O：20~23%N：15~18%S：0~4%其它(P、Cu2+、Mn2+、Fe3+等)微量蛋白質(zhì)N平均含量為16%的特點作為凱氏（Kjedahl）定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計算依據(jù)。蛋白質(zhì)含量=N含量×6.25第二頁，共149頁。二、蛋白質(zhì)的分類1.分類依據(jù)——蛋白質(zhì)不能按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類常用依據(jù)：生物來源、理化性質(zhì)、分子形狀、化學(xué)組成等。2.三種分類方法——按組成分類常用1）根據(jù)分子形狀：球狀和纖維狀蛋白；球狀蛋白：軸比小于10，較易溶解。常見：血紅蛋白，血清球蛋白，豆類球蛋白等。纖維狀蛋白：軸比大于10，不溶于水。常見：羽毛中的角蛋白和蠶絲中的絲蛋白等。第三頁，共149頁。第四頁，共149頁。第五頁，共149頁。二、蛋白質(zhì)的分類2)根據(jù)溶解度：清蛋白：白蛋白，溶于水；精蛋白：溶于水和酸性溶液，含堿性氨基酸多組蛋白：溶于水及稀酸，含堿性氨基酸較多球蛋白：微溶于水而溶于稀中性鹽溶液谷蛋白：不溶于水、醇及中性鹽溶液，溶于稀酸、稀堿，如麥蛋白。醇溶蛋白：不溶于水，溶于70~80%乙醇；硬蛋白：不溶于水、鹽、稀酸、稀堿。第六頁，共149頁。二、蛋白質(zhì)的分類3)根據(jù)組成：單純蛋白質(zhì)：僅由氨基酸組成。如清蛋白、球蛋白、組蛋白等。結(jié)合蛋白質(zhì)：氨基酸、糖、脂肪、核酸、磷酸以及色素等。核蛋白色蛋白糖蛋白：幾乎存在所有組織；脂蛋白：血漿脂蛋白、膜脂蛋白等。磷蛋白：酪蛋白、卵黃蛋白等。第七頁，共149頁。三、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能催化功能：酶；調(diào)節(jié)功能：激素、受體、毒蛋白等；結(jié)構(gòu)功能：構(gòu)成細胞和組織；運輸功能：血紅蛋白，載脂蛋白等；免疫功能：抗體；運動功能：肌肉，纖毛和鞭毛；儲藏功能：乳汁中的酪蛋白等；生物膜的功能：通透性、信號傳遞、生理識別等。第八頁，共149頁。第二節(jié)蛋白質(zhì)的基本單位——氨基酸一、蛋白質(zhì)的水解1.酸水解常以5~10倍的20%HCl煮沸回流16~24h，或加壓于120℃水解12h。優(yōu)點：水解徹底，產(chǎn)物為L-氨基酸；缺點：色氨酸破壞，水解液呈黑色。應(yīng)用：氨基酸工業(yè)生產(chǎn)、蛋白質(zhì)分析等。第九頁，共149頁。第二節(jié)蛋白質(zhì)的基本單位——氨基酸2.堿水解6mol/LNaOH或4mol/LBa(OH)2煮沸6h。優(yōu)點：色氨酸未破壞，水解液清亮；缺點：氨基酸發(fā)生旋光異構(gòu)。一般很少使用。3.酶水解條件溫和，常溫（36~60℃）、常壓和pH2~8，氨基酸未破壞，不發(fā)生旋光異構(gòu)；但水解不徹底。第十頁，共149頁。二、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征1.結(jié)構(gòu)特征——氨基酸是氨基取代羧酸氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH2）和羧基（-COOH）結(jié)合到α碳原子（Cα），同時結(jié)合到（Cα）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R）；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）。第十一頁，共149頁。不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式Cα如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]第十二頁，共149頁。二、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征2.常見氨基酸——20種基本氨基酸從細菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸（20standardaminoacids)組成。不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR第十三頁，共149頁。20種基本氨基酸第十四頁，共149頁。三、氨基酸的分類（1）根據(jù)酸堿性質(zhì)：酸性氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸；堿性氨基酸：精氨酸、賴氨酸和組氨酸；中性氨基酸：15種，包括兩種酰胺。第十五頁，共149頁。三、氨基酸的分類（2）根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)脂肪族氨基酸：15種。芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp雜環(huán)氨基酸：His雜環(huán)亞氨基酸：Pro第十六頁，共149頁。芳香族側(cè)鏈氨基酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸第十七頁，共149頁。組氨酸脯氨酸第十八頁，共149頁。三、氨基酸的分類（3）根據(jù)R的極性①極性氨基酸：a）不帶電：Ser、Thr、Tyr（OH）、Asn、Gln（CONH2）、Cys（SH）；b）帶正電：His、Lys、Arg；c）帶負電：Asp、Glu②非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Pro第十九頁，共149頁。極性不帶電氨基酸半胱氨酸天冬酰胺谷氨酰胺絲氨酸蘇氨酸酪氨酸第二十頁，共149頁。帶正電的氨基酸賴氨酸精氨酸組氨酸第二十一頁，共149頁。帶負電的氨基酸天冬氨酸谷氨酸第二十二頁，共149頁。四、氨基酸的性質(zhì)1.一般物理性質(zhì)無色晶體，熔點較高（200℃以上），能溶于水、稀酸或稀堿中，不溶于有機溶劑；除Gly外都有旋光性。2.兩性解離和等電點氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負離子，為兩性電解質(zhì)。第二十三頁，共149頁。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。生理pH值時，大多數(shù)氨基酸以兩性離子存在。第二十四頁，共149頁。甘氨酸的酸堿滴定曲線氨基酸等電點的確定第二十五頁，共149頁。甘氨酸的解離第二十六頁，共149頁。等電點時，Glu主要以兼性離子(R0)存在，[R+]和[R-]很小而且相等，R2-的量可忽略不計。因此pI=1/2(pK1’+pKR’)帶有可解離R基的氨基酸有3個pK’。第二十七頁，共149頁。谷氨酸pI=3.22第二十八頁，共149頁。等電點時，Lys主要以兼性離子(R0)存在，[R2+]的影響極小。因此pI=1/2(pK2’+pKR’)2第二十九頁，共149頁。組氨酸pI=7.59第三十頁，共149頁。pI=————pK1+pK22氨基酸等電點的確定1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據(jù)pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。酸性氨基酸pI=1/2(pK1’+pKR’)堿性氨基酸pI=1/2(pK2’+pKR’)第三十一頁，共149頁。第三十二頁，共149頁。練習(xí)題1.精氨酸的pK1'(COO-)值為2.17，pK2'(NH3+)值為9.04，pK3'

(胍基)值為12.48，其pI(等電點時的pH值)為_________。2.用凱氏定氮法測定正常人血清含氮量為11.58mg/ml,則此人血清蛋白含量為

g/100ml。3.人體八種必需氨基酸分別是

。第三十三頁，共149頁。練習(xí)題4.寫出下列氨基酸的三字母縮寫符號：天冬氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸。5.下列哪種氨基酸溶液不使平面偏振光發(fā)生偏轉(zhuǎn)A.Pro

B.Gly

C.Leu

D.Lys6.含有兩個氨基的氨基酸是A.谷氨酸B.絲氨酸C.酪氨酸D.賴氨酸E.蘇氨酸第三十四頁，共149頁。帶芳香環(huán)側(cè)鏈的氨基酸具有紫外吸收的能力，最大光吸收在280nm。利用氨基酸的紫外吸收測定蛋白含量。2.紫外吸收——芳香族氨基酸第三十五頁，共149頁。

酪氨酸max＝278nm苯丙氨酸max＝259nm色氨酸max＝279nm第三十六頁，共149頁。（1）-氨基參與的反應(yīng)①與亞硝酸反應(yīng)：得到-羥基酸并放出氮氣。是范斯來克法定量測定氨基酸的基本反應(yīng)?？梢杂冒被c總蛋白氮的比例表示蛋白質(zhì)的水解程度。3.化學(xué)性質(zhì)第三十七頁，共149頁。3.化學(xué)性質(zhì)（1）-氨基參與的反應(yīng)②與甲醛發(fā)生羥甲基化反應(yīng)：R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2第三十八頁，共149頁。③與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)Sanger首先用此反應(yīng)鑒定多肽鏈或蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸。pH8~9第三十九頁，共149頁。3.化學(xué)性質(zhì)④形成席夫堿反應(yīng)：與醛類化合物反應(yīng)。非酶促褐變的一種機制。⑤脫氨基和轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)在氨基酸氧化酶作用下，脫氨基生成-酮酸。轉(zhuǎn)氨酶催化下實現(xiàn)氨基轉(zhuǎn)移。如谷丙轉(zhuǎn)氨酶。第四十頁，共149頁。第四十一頁，共149頁。（2）-羧基參與的反應(yīng)①成鹽反應(yīng)：與堿作用生成鹽，如谷氨酸一鈉。與重金屬離子形成的鹽不溶于水。第四十二頁，共149頁。（2）-羧基參與的反應(yīng)②脫羧反應(yīng)：在氨基酸脫羧酶作用下，生成一級胺。谷氨酸脫羧形成-氨基丁酸。-氨基丁酸第四十三頁，共149頁。（3）氨基和羧基共同參與的反應(yīng)①與茚三酮的反應(yīng)：藍紫色物質(zhì)（570nm）Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)(440nm)。水合茚三酮還原茚三酮2第四十四頁，共149頁。②成肽反應(yīng)縮合生成酰胺鍵，通常稱為肽鍵。第四十五頁，共149頁。（4）側(cè)鏈基團的化學(xué)性質(zhì)①巰基及二硫鍵：可與芐氯、碘乙酰胺等結(jié)合，保護巰基。兩個巰基氧化形成二硫鍵-S-S-，相互可形成氧化還原體系，并且可以維持多肽分子和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。②羥基：可與酸成酯，如絲氨酸或蘇氨酸與乙酸、磷酸反應(yīng)成酯。第四十六頁，共149頁。巰基（-SH）的性質(zhì)作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或斷裂。胱氨酸半胱氨酸第四十七頁，共149頁。第三節(jié)肽一、肽的概念1.結(jié)構(gòu)——由氨基酸構(gòu)成肽鍵：由一個氨基酸的-氨基與另一個氨基酸的-羧基縮合失水而形成的酰胺鍵。第四十八頁，共149頁。氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水形成肽。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式。肽鍵相連構(gòu)成了蛋白質(zhì)的主鏈。第四十九頁，共149頁。

肽鍵特點：氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。第五十頁，共149頁。肽(peptide)氨基酸之間通過肽鍵聯(lián)結(jié)起來的化合物稱為肽。兩個氨基酸形成的肽叫二肽，三個氨基酸形成的肽叫三肽……，十個氨基酸形成的肽叫十肽，一般將十肽以下稱為寡肽(oligopeptide)，以上者稱多肽(polypeptide)或稱多肽鏈。氨基酸殘基(aminoacidresidues)肽鏈中的氨基酸在參加肽鍵形成時失去了1分子水，已經(jīng)不是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基。第五十一頁，共149頁。一條肽鏈通常含有一個游離的-氨基端(N-末端)和一個游離的-羧基端(C-末端)。規(guī)定肽鏈的氨基酸排列順序從其N-末端開始，到C-末端終止。常把N-末端氨基酸殘基放在左邊，C-末端氨基酸殘基放在右邊。小分子肽一般按其氨基酸殘基排列順序命名，如：Tyr-Gly-Gly-Phe-Met稱為：酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸（腦啡肽）。命名及書寫方式第五十二頁，共149頁。二、生物活性肽1.谷胱甘肽——參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)還原型谷胱甘肽（GSH）氧化型谷胱甘肽（GSSG）第五十三頁，共149頁。2.神經(jīng)肽——神經(jīng)肽與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽等和P-物質(zhì)。具有嗎啡一樣的鎮(zhèn)痛作用。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-

Met-腦啡肽Leu-腦啡肽α、β、γ-內(nèi)啡肽分別為16肽、31肽、17肽，它們的前五個氨基酸序列與蛋氨酸-腦啡肽的五肽相同。第五十四頁，共149頁。3.抗菌肽——細菌的一種防御武器抑制細菌和其他微生物生長或繁殖的物質(zhì)；由特定微生物產(chǎn)生，最常見的是青霉素，它是由半胱氨酸和纈氨酸結(jié)合成的二肽衍生物。主要破壞細菌細胞壁糖肽的合成，引起溶菌。第五十五頁，共149頁。第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。第五十六頁，共149頁。一、蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)1.一級結(jié)構(gòu)概念——特指氨基酸的順序1969年，理論和應(yīng)用化學(xué)國際協(xié)會特規(guī)定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)特指肽鏈中的氨基酸順序。維持一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：共價鍵，主要為肽鍵。書寫方式：從N-末端到C-末端，用氨基酸的3字母縮寫或單字母符號連續(xù)排列。第五十七頁，共149頁。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第五十八頁，共149頁。第五十九頁，共149頁。1953年英國Sanger等人，完成了牛胰島素(Insulin)一級結(jié)構(gòu)測定工作，分子量為5700D，有A鏈(21Aa)和B鏈(30Aa)兩條肽鏈，兩個鏈間二硫鍵和一個鏈內(nèi)二硫鍵(A鏈)。第六十頁，共149頁。2.一級結(jié)構(gòu)的測定——氨基酸序列的自動程序測定一級結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。片段重疊法，主要步驟為：測定氨基酸末端的數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成，并測得末端組成；對幾條肽鏈進行拆分、分離；第六十一頁，共149頁。2.一級結(jié)構(gòu)的測定肽鏈水解后進行氨基酸組成分析；一種不完全水解，得到片段，分離后測定氨基酸順序；另一種不完全水解，測定片段氨基酸順序；比較兩套片段氨基酸順序，得到整個氨基酸順序；確定多肽鏈中二硫鍵的位置。第六十二頁，共149頁。一級結(jié)構(gòu)的測定方法（1）肽鏈末端分析末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。①N-末端測定A.二硝基氟苯（DNFB）法反應(yīng)后酸水解，得到一個DNP-氨基酸和其余所有游離氨基酸的混合液。DNP-氨基酸為黃色，可用乙醚抽提，分離鑒定得到末端氨基酸。第六十三頁，共149頁。黃色二硝基氟苯（DNFB）法第六十四頁，共149頁。B.Edman法：生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物，通過層析法分離鑒定，Edman首先用此反應(yīng)鑒定多肽的N-端AA。PTH-氨基酸第六十五頁，共149頁。C.丹磺酰氯法：在堿性條件下，得到丹磺酰-氨基酸。優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到1

10-9mol。第六十六頁，共149頁。D.氨肽酶法：一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向內(nèi)水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。第六十七頁，共149頁。②C-末端測定A.肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。第六十八頁，共149頁。

B.羧肽酶法：一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。常用的羧肽酶至少包括A、B、C三種；羧肽酶A能水解除Pro、Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵；C能水解C-末端的任何一個殘基。第六十九頁，共149頁。（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離肽鏈通過非共價鍵連接，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理，將肽鏈分開；二硫鍵的打開：氧化還原法，即用過量的-巰基乙醇或二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇處理，然后用碘乙酸（ICH2COOH）保護巰基。也可以用過甲酸（HCOOOH）處理。第七十頁，共149頁。二硫鍵的拆分二硫蘇糖醇過甲酸碘乙酸第七十一頁，共149頁。（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離蛋白質(zhì)裂解成小肽，然后分離并測定肽段的氨基酸序列。選用專一性強的蛋白水解酶或化學(xué)試劑進行有控制的裂解?；疽螅哼x擇性強，裂解點少，反應(yīng)產(chǎn)率高?；痉椒ǎ夯瘜W(xué)裂解（溴化氰裂解和酸水解）、酶解法（胰蛋白酶等）。第七十二頁，共149頁。①溴化氰水解法：專一性地切斷肽鏈中由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。專一性強，切點少且產(chǎn)率高，片段較大。第七十三頁，共149頁。（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離②部分酸水解：測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，稀酸條件下，肽鏈Asp的羧基端易斷裂，濃酸條件下，含羥基氨基酸的氨基端肽鍵易斷裂。③酶解法：胰蛋白酶：作用Arg和Lys羧基端肽鍵；胰凝乳蛋白酶：芳香族氨基酸及一些有大的非極性側(cè)鏈的氨基酸的羧基端肽鍵。第七十四頁，共149頁。（4）肽段的氨基酸序列測定采用Edman降解法、酶解法等。酶解法：利用一種酶水解產(chǎn)生一個或兩個可知末端特征的片段，再用另一種酶作用產(chǎn)生另一組片段，然后后一組片段進行色譜分離并進行末端測定，最后進行片段重疊分析，確定氨基酸序列。（5）肽段在多肽鏈中次序的推斷采用肽段重疊法。利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。第七十五頁，共149頁。氨基酸組分分析Sanger反應(yīng)測定N-端氨基酸Edman反應(yīng)測定氨基酸序列末端分析第七十六頁，共149頁。氨基酸組分分析末端氨基酸測定還原二硫鍵用兩種以上方法將蛋白裂解成短肽測定短肽序列短肽序列拼裝胰蛋白酶溴化氰片段重疊法第七十七頁，共149頁。練習(xí)題有一多肽經(jīng)酸水解后產(chǎn)生等摩爾的Lys，Gly和A1a，如用胰蛋白酶水解該肽，僅發(fā)現(xiàn)有游離的Gly和一種二肽。下列多肽的一級結(jié)構(gòu)中，哪一個符合該肽的結(jié)構(gòu)?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys第七十八頁，共149頁。練習(xí)題一個七肽，經(jīng)分析氨基酸組成是:Lys,Pro,Arg,Phe,Ala,Tyr和Ser，此多肽與DNFB不反應(yīng)。經(jīng)胰凝乳蛋白酶處理后，斷裂成兩個肽段，其氨基酸組成分別為Ala,Tyr,Ser和Pro,Phe,Lys,Arg。這兩個肽段與DNFB反應(yīng)，可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應(yīng)，同樣能生成兩個肽段，它們的氨基酸組成分別是Arg,Pro和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。試問此七肽的結(jié)構(gòu)是怎樣的?第七十九頁，共149頁。二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)1.概念——蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)系非共價結(jié)構(gòu)（1）含義：二級結(jié)構(gòu)：指肽鏈借助氫鍵排列成沿一個方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。三級結(jié)構(gòu)：指多肽鏈借助各種次級鍵盤繞成特定的不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。四級結(jié)構(gòu)：指寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間排布上的相互關(guān)系或結(jié)合方式。第八十頁，共149頁。在蛋白鏈中,羰基和氨基具有形成氫鍵的潛能,蛋白質(zhì)鏈內(nèi)和鏈間氫鍵促使蛋白質(zhì)形成一些規(guī)則的折疊單元,即所謂的二級結(jié)構(gòu)。第八十一頁，共149頁。（2）維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵①氫鍵：主要維持-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)。②靜電引力：也稱離子鍵或鹽鍵，對蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性貢獻不大。③范德華力：對維持蛋白質(zhì)活性中心構(gòu)象非常重要。④疏水相互作用：維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)；⑤二硫鍵：兩個硫原子之間形成的共價鍵。維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵主要是次級鍵。次級鍵：除共價鍵、離子鍵和金屬鍵外基團間和分子間相互作用力的總稱。第八十二頁，共149頁。肽平面兩個旋轉(zhuǎn)角：φ（C-N）、ψ（C-C）氨基酸殘基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)、極性造成空間位阻，使旋轉(zhuǎn)角度不能超過0~±180°范圍；C=O和N-H間的氫鍵也限制了二者的旋轉(zhuǎn)。（3）蛋白質(zhì)分子中肽鏈的空間結(jié)構(gòu)原則第八十三頁，共149頁。2.二級結(jié)構(gòu)——肽鏈的螺旋折疊（1）

-螺旋(

-helix)

1951年P(guān)auling和Corey根據(jù)

-角蛋白(-keratin)的X射線衍射結(jié)果提出的。①

-螺旋結(jié)構(gòu)模型要點：a.主鏈圍繞中心軸螺旋上升，每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當于0.54nm，每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，每個氨基酸旋轉(zhuǎn)100°。b.相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵；c.R側(cè)鏈在螺旋的外側(cè)；d.天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手螺旋。第八十四頁，共149頁。

-螺旋第八十五頁，共149頁。

-螺旋第八十六頁，共149頁。②影響

-螺旋形成和穩(wěn)定的因素a.氨基酸的組成和排列順序多聚丙氨酸（

-螺旋）多聚賴氨酸（無規(guī)則卷曲）遇到脯氨酸螺旋被中斷或拐彎。b.氨基酸所帶電荷性質(zhì)c.R側(cè)鏈的大?。嚎臻g位阻。第八十七頁，共149頁。①β-折疊結(jié)構(gòu)要點a.肽鏈幾乎是完全伸展的；b.肽鏈成鋸齒狀，按層平行排列，肽平面呈片狀；c.相鄰肽鏈的C=O與N-H形成氫鍵，氫鍵幾乎垂直于肽鏈；d.肽鏈的R側(cè)鏈基團在肽平面的上下交替出現(xiàn)；e.折疊片以反平行式結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。②β-折疊與

-螺旋的轉(zhuǎn)變：頭發(fā)中的角蛋白。（2）β-折疊(β-pleatedsheet)第八十八頁，共149頁。反平行第八十九頁，共149頁。平行第九十頁，共149頁。（3）-轉(zhuǎn)角(

-turn)指肽鏈出現(xiàn)的180o回折，由彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O與第四個氨基酸殘基的-NH之間形成氫鍵。Gly和Pro出現(xiàn)頻率高。（4）無規(guī)則卷曲：沒有確定規(guī)律性的部分肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列，屬于松散的無規(guī)卷曲(randomcoil)。第九十一頁，共149頁。兩種典型的轉(zhuǎn)角第九十二頁，共149頁。3.三級結(jié)構(gòu)——肽鏈非幾何形的進一步折疊蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步卷曲折疊，構(gòu)成一個不規(guī)則的特定構(gòu)象。包括全部主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排布，但不包括肽鏈的相互作用。只有三級結(jié)構(gòu)才是蛋白質(zhì)生物活性的特征構(gòu)象。維系三級結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵、二硫鍵、離子鍵、疏水作用力和范德華力。第九十三頁，共149頁。肌紅蛋白由一條肽鏈（153個氨基酸殘基）組成。它由8個

-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。第九十四頁，共149頁。第九十五頁，共149頁。4.四級結(jié)構(gòu)——亞基間的相互關(guān)系蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)：由兩條或兩條以上的具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價鍵鍵聚合而成的特定構(gòu)象。四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每個最小共價單位稱為亞基。亞基一般由一條肽鏈組成。四級結(jié)構(gòu)涉及亞基的種類和數(shù)目以及各亞基在整個分子中的空間排布，包括亞基間的接觸位點和相互作用關(guān)系。維持四級結(jié)構(gòu)的主要作用力：疏水作用力。第九十六頁，共149頁。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)第九十七頁，共149頁。三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（1）同功蛋白質(zhì)氨基酸的種屬差異和分子進化同功蛋白質(zhì)：不同種屬來源的執(zhí)行同種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)；結(jié)構(gòu)包括兩部分：不變的氨基酸序列，決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能；可變的氨基酸序列：體現(xiàn)種屬差異。同功蛋白質(zhì)組成上的差異體現(xiàn)親緣關(guān)系的遠近。第九十八頁，共149頁。三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（2）同功蛋白質(zhì)中氨基酸序列的個體差異和分子病同種蛋白質(zhì)：同種生物具有相同生物活性的蛋白質(zhì)；個體差異：同種蛋白質(zhì)氨基酸序列的細微差異。引起分子病，個體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致生物學(xué)功能改變。（3）一級結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活血液凝固的生化機理；胰島素原的激活。第九十九頁，共149頁。鐮刀形細胞貧血病血紅蛋白β亞基N端的第6號氨基酸殘基發(fā)生了變異，它變異來源于基因上遺傳信息的突變。第一百頁，共149頁。血液凝固的生化機理第一百零一頁，共149頁。第一百零二頁，共149頁。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的大小1.相對分子質(zhì)量——蛋白質(zhì)是巨大分子相對分子質(zhì)量一般為1萬到幾百萬。2.測定方法——蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定（1）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量例如血紅蛋白含鐵量為0.335%，最低相對分子質(zhì)量=55.84/0.335%≈16700其他方法測定血紅蛋白分子量為68000。第一百零三頁，共149頁。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)（2）物理化學(xué)方法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量滲透壓測定法超離心法：包括沉降速度法（沉降系數(shù)S）和沉降平衡法（根據(jù)密度分離）。二、兩性解離——多價解離蛋白質(zhì)的可解離基團主要指側(cè)鏈的可解離基團，包括氨基、羧基、咪唑基、胍基、巰基、酚基等。蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量是由蛋白質(zhì)分子中的可解離基團的種類和數(shù)目以及溶液pH決定的。第一百零四頁，共149頁。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)等電點——蛋白質(zhì)多種性質(zhì)達到最低值等電點時，蛋白質(zhì)在電場中不移動。pH>等電點，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，向正極移動pH<等電點，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，向負極移動第一百零五頁，共149頁。蛋白質(zhì)在等電點時，因沒有同性電荷排斥，故最不穩(wěn)定，溶解度最小，易聚集成較大的顆粒，易沉淀析出（分離提純蛋白質(zhì)的方法）。電泳：帶電質(zhì)點在電場中向電荷相反的電極泳動的現(xiàn)象。實驗室、生產(chǎn)、臨床診斷等常用電泳分離蛋白質(zhì)和鑒定蛋白質(zhì)純度。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)第一百零六頁，共149頁。三、膠體性質(zhì)1.膠體性質(zhì)——親水膠體膠體形成條件：粒子大小在1~100nm之間；帶相同電荷；與溶劑之間形成溶劑化層。蛋白質(zhì)：2~20nm。第一百零七頁，共149頁。2.滲析滲析或透析：蛋白質(zhì)不能透過半透膜，可將其與一些小分子物質(zhì)分開。超濾：利用外加壓力或離心力使水和其他小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。第一百零八頁，共149頁。四、沉淀作用1.蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定因素：水化層：蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）+水；帶電層：表面可解離基團在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生，同性電荷相互排斥。蛋白質(zhì)的沉淀作用：條件改變時，蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性被破壞，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象。原因：破壞水化層和帶電層。第一百零九頁，共149頁。四、沉淀作用2.沉淀方法：高濃度中性鹽、有機溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑等都可引起蛋白質(zhì)沉淀。加入高濃度的中性鹽（如[NH4]2SO4、NaCl等），可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析(saltingout)。當除去鹽后，可再溶解。鹽析法是最常用的分離蛋白質(zhì)的方法。第一百一十頁，共149頁。第一百一十一頁，共149頁?？膳c水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液至等電點時，加入有機溶劑可加速蛋白質(zhì)沉淀。常溫下有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用于分離制備蛋白質(zhì)。有機溶劑沉淀法第一百一十二頁，共149頁。當溶液pH值高于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來解毒。若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。重金屬鹽沉淀第一百一十三頁，共149頁。pH小于等電點時蛋白質(zhì)帶正電荷，易與帶負電（酸根陰離子）的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)生成不溶性鹽而沉淀。血液化學(xué)分析時常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì)，此類沉淀反應(yīng)也可用于檢驗?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。生物堿試劑和某些酸類沉淀蛋白質(zhì)第一百一十四頁，共149頁。蛋白質(zhì)因受理化因素影響，使其維系空間結(jié)構(gòu)的次級鍵受到破壞，使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物活性改變或喪失，稱為變性作用(denaturation)。引起蛋白質(zhì)發(fā)生變性的因素化學(xué)因素：強酸、強堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、苦味酸、乙醇等。物理因素：加熱(70℃~100℃)、加壓、脫水、劇烈振蕩或攪拌、紫外線、X-射線照射、超聲波等。五、蛋白質(zhì)的變性作用第一百一十五頁，共149頁。維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞，一級結(jié)構(gòu)的共價鍵（肽鍵）沒有被破壞。分為可逆變性和不可逆變性。變性后的特點：①喪失生物活性；②溶解度降低；③易被水解（對水解酶的抵抗力減弱）。應(yīng)用：變性因素常用于消毒及滅菌；保存蛋白質(zhì)制劑時應(yīng)注意防止蛋白質(zhì)變性。變性的本質(zhì)和應(yīng)用第一百一十六頁，共149頁。①雙縮脲反應(yīng)②茚三酮反應(yīng)③米隆反應(yīng)④坂口反應(yīng)⑤Folin-酚反應(yīng)⑥乙醛酸反應(yīng)⑦黃色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第一百一十七頁，共149頁。①雙縮脲反應(yīng)(BiuretReaction)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色（540nm），稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都呈此反應(yīng)，所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。②茚三酮反應(yīng)(NinhydrinReaction)α-氨基酸和所有蛋白質(zhì)均可與水合茚三酮作用產(chǎn)生藍色反應(yīng)。第一百一十八頁，共149頁。雙縮脲反應(yīng)第一百一十九頁，共149頁。③米隆反應(yīng)(MillonReaction)蛋白質(zhì)溶液中加入米隆試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀，此為酪氨酸的酚基所特有的反應(yīng)，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米隆反應(yīng)。此外，蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)生顏色反應(yīng)。第一百二十頁，共149頁。第六節(jié)蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測定一、分離純化的一般原則及基本步驟1.一般原則——根據(jù)性質(zhì)設(shè)計分離純化方法①所用原料來源方便，成本低；目的蛋白質(zhì)含量、相對活性高；可溶性和穩(wěn)定性好；基因分子背景如何等要明確；②破碎細胞條件要溫和；盡量去除雜質(zhì)、脂類、核酸及毒素；③大部分操作在溶液中進行；④建立靈敏、特異、精確的檢測方法。第一百二十一頁，共149頁。第六節(jié)蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測定一、分離純化的一般原則及基本步驟2.基本步驟——分離純化的戰(zhàn)略①取材：含量豐富，便于提取；②組織細胞破碎：機械法：組織分散器、勻漿器等；物理法：超聲波、滲透壓、壓榨等；化學(xué)法：酸、堿等；酶法：溶菌酶、纖維素酶等。第一百二十二頁，共149頁。分離純化基本步驟③提?。哼x擇適當溶劑；水溶性蛋白：應(yīng)用中性緩沖溶液抽提；酸性蛋白：稀堿性溶液抽提；脂溶性蛋白：有機溶劑抽提。④分離純化**；⑤結(jié)晶；⑥鑒定、分析。第一百二十三頁，共149頁。第六節(jié)蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測定二、分離純化的基本方法1.鹽析與等電點沉淀——根據(jù)溶解度分離（1）鹽析：高濃度中性鹽溶液，水化層被破壞和表面電荷被中和，發(fā)生沉淀，常用硫酸銨。（2）等電點沉淀：凈電荷為零，分子間靜電排斥力最小，容易聚集沉淀，此時溶解度最小。沉淀的蛋白質(zhì)保持天然構(gòu)象，能再溶解。第一百二十四頁，共149頁。二、分離純化的基本方法2.離子交換色譜——根據(jù)電荷性質(zhì)不同一定pH下蛋白質(zhì)所帶電荷不同進行分離；利用離子交換劑，靠相反電荷間的靜電吸引，根據(jù)帶電荷多少進行分離，結(jié)合力小的先被洗脫。常用離子交換劑：CM-纖維素（弱酸型）：陽離子交換劑；DEAE-纖維素（弱堿性）：陰離子交換劑。第一百二十五頁，共149頁。離子交換層析第一百二十六頁，共149頁。二、分離純化的基本方法3.凝膠過濾——根據(jù)相對分子質(zhì)量不同介質(zhì)：交聯(lián)葡萄糖（葡聚糖）、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠顆粒。凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進入顆粒內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當用洗脫液洗脫時，被排阻的相對分子質(zhì)量大的分子先被洗脫下來，相對分子質(zhì)量小的分子后下來。第一百二十七頁，共149頁。大分子快，小分子慢第一百二十八頁，共149頁。例題1指出下列蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析柱時的洗脫順序，蛋白質(zhì)分布范圍從5000到600000。肌紅蛋白：16900；過氧化氫酶：247500；細胞色素C：13370；肌球蛋白：524800；胰凝乳蛋白酶原：23240；血清清蛋白：68500。第一百二十九頁，共149頁。二、分離純化的基本方法4.親和色譜——根據(jù)特異性親和力不同分離根據(jù)不同蛋白質(zhì)對特定配體的特異性而非共價結(jié)合的能力不同進行分離的?；静襟E：選擇配體；配體與載體（瓊脂糖類）共價連接；裝柱后蛋白質(zhì)被特異性吸附，其它物質(zhì)流出；洗脫。第一百三十頁，共149頁。親和層析第一百三十一頁，共149頁。三、氨基酸的分離1.濾紙色譜——根據(jù)溶解度不同進行的分配色譜當一種溶質(zhì)在兩種一定的不互溶或幾乎不互溶的溶劑中分配時，在一定溫度下達到平衡后，在兩相中的濃度比值與在這兩種溶劑中的溶解度比值相等，稱為分配定律。分配系數(shù)=溶質(zhì)在溶劑A中濃度/溶質(zhì)在溶劑B中濃度以濾紙為支持物，濾紙纖維吸附水為固定相，有機溶劑為移動相，分離氨基酸。第一百三十二頁，共149頁。三、氨基酸的分離Rf=原點到色譜點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離Rf越大，說明該物質(zhì)前進越快，在有機相中的溶解度越大。第一百三十三頁，共149頁。三、氨基酸的分離2.離子交換色譜——根據(jù)電荷性質(zhì)不同一定pH下氨基酸所帶電荷不同進行分離；利用離子交換劑（SO32-H+或-N(CH3)3+OH-)，靠相反電荷間的靜電吸引，根據(jù)帶電荷多少進行分離。洗脫液中氨基酸的濃度由茚三酮反應(yīng)的顏色深淺來檢測。第一百三十四頁，共149頁。例題2將含有天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和賴氨酸的檸檬酸緩沖液（pH=3），加到預(yù)先同樣緩沖液平衡過的強陽離子交換樹脂中，隨后用此緩沖液洗脫此柱，并分別收集洗出液，這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來？第一百三十五頁，共149頁。3.薄層色譜——根據(jù)吸附性質(zhì)不同將固體吸附劑（纖維素粉末、硅膠粉等）涂布在玻璃板等支持物上，根據(jù)吸附劑對樣品中各組分的吸附力不同來進行。4.紙電泳與薄膜電泳——電場下分離外電場作用下，帶電顆粒將向著